Abstract
inflammatoriske mediatorer i svulsten mikromiljøet fremme tumorvekst, vaskulær utvikling og gjøre det mulig unndragelse av anti-tumor immunresponser, ved å deaktivere infiltrere dendrittiske celler. Imidlertid er de bestanddeler av svulsten mikromiljøet som har direkte innvirkning dendrittiske cellemodning og fungerer ikke godt karakterisert. Vårt mål var å identifisere tumorassosierte inflammatoriske mediatorer som påvirker funksjonen til dendrittiske celler. Tumor kondisjonert medium fra dyrkede kolorektal tumor eksplantat vevet inneholdt høye nivåer av kjemokiner CCL2, CXCL1, CXCL5 i tillegg til VEGF. Forbehandling av stammer fra monocytter dendrittiske celler med denne tumor kondisjonert medium inhiberte oppregulering av CD86, CD83, CD54 og HLA-DR som respons på LPS, styrke IL-10 samtidig redusere IL-12p70 sekresjon. Vi undersøkte om bestemte enkeltvise komponenter i tumor kondisjonerte medier (CCL2, CXCL1, CXCL5) kunne modulere dendrittiske cellemodningen eller cytokinsekresjon som respons på LPS. VEGF ble også vurdert som den har en undertrykkende virkning på dendrittiske cellemodning. Forbehandling av umodne dendrittiske celler med hemmet LPS VEGF indusert oppregulering av CD80 og CD54, mens CXCL1 hemmet HLA-DR. Interessant, behandling av dendrittiske celler med CCL2, CXCL1, CXCL5 eller VEGF trykkes betydelig evne til å utskille IL-12p70 som respons på LPS. I tillegg, dendrittiske celler behandlet med en kombinasjon av CXCL1 og VEGF utskilt mindre IL-12p70 som respons på LPS forhold til forbehandling med enten cytokin alene. I konklusjonen, påvirker svulst betinget media sterkt dendrittiske cellen modning og funksjon
Citation. Michielsen AJ, Hogan AE, Marry J, Tosetto M, Cox F, Hyland JM et al. (2011) Tumor Tissue mikromiljøet kan hemme Dendritic Cell Modning i tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (11): e27944. doi: 10,1371 /journal.pone.0027944
Redaktør: Francesco Dieli, Universitetet i Palermo, Italia
mottatt: May 30, 2011; Godkjent: 28 oktober 2011; Publisert: 18.11.2011
Copyright: © 2011 Michielsen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av den irske Forskningsrådet for Science, Engineering and Technology og Darren Gibbons Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
dendrittiske celler (DCS) er potente antigenpresenterende celler i stand til å aktivere naive T-celler. DC er til stede i vev i en umoden tilstand og vise lave nivåer av modning eller co-stimulerende markører som CD83, CD80 eller CD86. Umodne DC (IDCS) gjenkjenne og fange spesifikke antigener, inkludert tumorantigener. DC gjennomgå en funksjonell modningsprosess i respons til inflammatoriske mediatorer så som IFN-α eller Toll lignende reseptor (TLR) agonist. Som DCS modne de får potensialet til å presentere antigen for T-celler og aktivering av en spesifikk antitumor T-cellerespons [1], [2]. DC som utskiller høye nivåer av bioaktivt IL-12p70 indusere optimal anti-tumor immunforsvar, som de har økt evne til å fremme naturlig drepecelleaktivitet, skew responsen på Th1 og prime tumorspesifikke CD8
+ T-celler [3], [ ,,,0],4].
Men mange svulster unngå immunresponsen ved å skille cytokiner og andre faktorer som hemmer DC differensiering eller modningen av tumor infiltrerer DC. [1]. En av disse «pro-tumor» faktorer, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er kjent for å opprettholde tumorvekst via dens angiogene egenskaper, men kan også fremkalle en hemmende effekt på DC differensiering og modning, styrke tumor overlevelse [1], [5] , [6], [7], [8]. VEGF har med hell blitt målrettet av humanisert monoklonalt antistoff Bevacizumab (Avastin) [9], men responsraten er ca 40% og mange pasienter utvikler resistens mot denne behandlingen. Derfor er det viktig å undersøke mulighetene for andre inflammatoriske mediatorer stede i svulsten mikromiljøet som kan hemme DC modning, da disse kan også være potensielle terapeutiske mål.
Flere cytokiner og chemokiner er til stede på et høyt nivå i svulst mikromiljøet, sammenlignet med normale vev, slik som CCL2 (MCP-1), CXCL1 (GROα) og CXCL5 (ENA-78) [10], [11], [12]. CCL2 er kjent for å tiltrekke seg monocytter, T-celler og dendrittiske celler [10], [13], mens den viktigste funksjonen til CXCL1 og CXCL5 er å tiltrekke og aktivere neutrofiler [14], [15]. I tillegg til sine kjemoattraktant funksjoner, CCL2, CXCL1 og CXCL5 spiller også en viktig rolle i angiogenese [15], [16], [17], noe som viser den multifunksjonelle natur disse kjemokiner. Det er kjent at human myeloid DC uttrykke CCR2 og CXCR2, reseptorer for CCL2 og CXCL1 og CXCL5, henholdsvis [18], [19]. Men effekten av disse kjemokiner på DC modning og funksjon er ikke tidligere undersøkt.
I denne studien brukte vi Eksplanterte human kolorektal kreft vev for å modellere svulsten mikromiljøet [20]. Eksplantering vev opprettholde den komplekse 3D-struktur av tumoren, herunder stroma, og således tillate fremstilling av mange forskjellige tumorassosierte faktorer, tett etterligne inflammatorisk miljø i tumor
in situ
. Tidligere studier har vist at supernatanter fra tumorcellelinjer kan hemme DC modning [21], [22], men betydningen av faktorer som utskilles av den hele svulsten på dendrittiske cellemodning har ikke tidligere blitt undersøkt.
Vi demonstrerer at Tumor kondisjonerte medium (TCM) fra dyrkede tykktarmskreftsvulster signifikant inhiberte LPS-indusert DC modning, markert økt IL-10 samtidig redusere IL-12p70 sekresjon som respons på LPS. Vi fant at TCM inneholdt betydelige mengder av kjemokiner CCL2, CXCL1 og CXCL5 i tillegg til VEGF. Nivåer av CCL2, CXCL1 og CXCL5 i TCM korrelert med CD83 uttrykk og IL-12p70 sekresjon fra DC behandlet med TCM. Individuelt, kan alle disse inflammatoriske mediatorer i betydelig grad hemmet LPS-induserte IL-12p70 sekresjon, forble imidlertid IL-10 sekresjon upåvirket. Interessant, effekten av CXCL1 og VEGF på inhibering av LPS-indusert IL-12p70 sekresjon av DC var additiv. I tillegg CXCL1 hadde også en markert inhiberende effekt på LPS-indusert oppregulering av HLA-DR.
Resultatene
Tumor kondisjonerte medium hemmer like modning og IL-12p70 sekresjon forsterke mens IL-10 sekresjon i respons på LPS
stammer fra monocytter DC oppnådd fra 2 friske frivillige ble inkubert med forskjellige mengder av TCM fra fire pasienter med kolorektal kreft i 4 timer før LPS simulering i ytterligere 18 timer, for å bestemme den optimale konsentrasjonen av TCM. Vi undersøkt effekten av TCM på evnen til DC til å utskille IL-10 og IL-12p70 som respons på stimulering med LPS. Sekresjon av IL-12p70 ved DC forsterker og styrer ekspansjon og differensiering av tumorspesifikke Th1-responser, mens høye nivåer av IL-10-sekresjon fortrinnsvis fører til utvidelse av immunosuppressive T regulatoriske celler. Behandling av DC med en i to fortynning av TCM viste å ha den mest potent effekt på IL-10 øker og IL-12p70-inhibering (p = 0,028) som respons på LPS (figur 1). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i ekspresjon av CD80, CD86, CD54, CD83 og HLA-DR (MHC II), markører assosiert med like modning, mellom forskjellige fortynninger av TCM (data ikke vist). Derfor brukte vi en 1 i 2 fortynning av TCM for videre analyse.
Umodne monocytt avledet dendrittiske celler (IDCS) (n = 2) ble behandlet i 4 timer med 01:02, 01:04 og 01:10 Tumor fortynninger av kondisjonert medium (TCM) er oppnådd ved dyrking av eksplanterte tumorer i fire pasienter med kolorektal kreft
in vitro
i 72 timer. LPS (1 pg /ml) ble tilsatt, og cellene ble dyrket i ytterligere 18 timer. Supernatanter ble samlet opp fra cellene dyrket som beskrevet ovenfor, og nivåene av IL-10 og IL-12p70 sekresjon av DCS ble målt ved hjelp av ELISA. Statistiske forskjeller ble bestemt ved Mann-Whitney U-test.
stammer fra monocytter DC hentet fra 6 friske givere ble behandlet med en i to TCM av 21 kolorektal pasienter i 4 timer før behandling med LPS i ytterligere 18 timer, og interessant, TCM behandlet DCs utskilt betydelig høyere nivåer av IL-10 som svar på LPS (p 0,0001), men betydelig lavere nivåer av IL-12p70 (p 0,0001) (figur 2A). I tillegg IL-12p70 viste en negativ korrelasjon med CD83 uttrykk Spearman r = -0,71, p. 0,001 (data ikke vist), videre tyder på at TCM behandlet DC med økende CD83 uttrykk er avtagende nivåer av IL-12p70 sekresjon
iDC (n = 6) ble behandlet med TCM av 21 pasienter med kolorektal kreft for 4 timer før du legger LPS; cellene ble dyrket i ytterligere 18 timer. Nivåer av IL-10 og IL-12p70 sekresjon av DCS ble målt ved hjelp av ELISA. Statistiske forskjeller ble bestemt av ANOVA. (A) Ekspresjon av de følgende modnings markører: CD80-, CD54, CD86, HLA-DR, og CD83 ble bestemt ved flow-cytometri. En representant eksperiment av seks er vist (B). Den Fold Endring i M.F.I. av hver markør ble beregnet i forhold til ustimulerte IDCS for celler behandlet med LPS eller TCM + LPS. Statistisk signifikans ble beregnet ved bruk av Wilcoxon signert rank test. (C). *
p
0,05, **
p
0,01, og ***
p
. 0,001
Behandling av DCs med TCM også betydelig hemmet LPS-indusert DC modning, med redusert uttrykk av CD54 (
p
0,0001), CD86 (
p
= 0,0035), HLA-DR (
p
= 0,0474) og CD83 (
p
= 0,0018) observert (figur 2B C). Behandling av DC med kondisjonert media hentet fra normalt vev ved siden av svulstvev (NCM) hemmet ikke LPS indusert modning eller cytokin sekresjon fra DC (figur 3).
Normal betinget media (NCM) av 5 tykktarmskreft pasienter ble brukt til å behandle stammer fra monocytter DC før du legger LPS. Ekspresjon av CD80, CD54, CD86, HLA-DR og CD83 ble målt ved flow-cytometri. Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Wilcoxon signert rank test.
Nivåer av CCL2, CXCL1, og CXCL5 stede i TCM korrelerer med CD83 uttrykk og IL-12p70 sekresjon fra DCs
TCM innhentet fra 21 pasienter med kolorektal kreft, ble analysert ved ELISA for flere kjente tumorassosierte faktorer. Nivåer av CCL2, CXCL1 og CXCL5 var konsekvent høyere enn de av VEGF (en aktuell terapeutisk mål i kolorektal kreft) i alle pasienter som ble undersøkt. Vi fant at nivåene av CCL2 (Spearman r = 0,59,
p
= 0,0053) CXCL1 (Spearman r = 0,50,
p
= 0,0202) og CXCL5 (Spearman r = 0,50,
p
= 0,0199) til stede i TCM positivt korrelert med CD83 uttrykk på DC behandlet med TCM (figur 4A). Dette innebærer at med økende nivåer av CCL2, CXCL1 og CXCL5 stede i TCM, er CD83 uttrykk forhøyet på DC behandlet med TCM. Selv om VEGF er til stede i detekterbare nivåer i TCM, viste ingen korrelasjon med like modning. I tillegg fant vi at IL-12p70 sekresjon fra DC behandlet med TCM negativt korrelert med CCL2 (Spearman r = -0,64,
p
= 0,0019), CXCL1 (Spearman r = -0,59,
p
= 0,0049) og CXCL5 (Spearman r = -0,57,
p
= 0,0075) (figur 4B). Dette tyder på at med økende nivåer av CCL2, CCL1 og CXCL5 i TCM, IL-12p70 sekresjon fra DC avtar. Det var ingen signifikant sammenheng mellom de fire cytokiner og de andre DC markører, CD80-, CD54, CD86, og HLA-DR, og IL-10-sekresjon.
Konsentrasjoner av CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF i svulsten kondisjonerte media av 21 kreftpasienter kolorektal ble målt med ELISA. Konsentrasjonene av CCL2, CXCL1 og CXCL5 korrelert med ekspresjonen av CD83 på DC behandlet med TCM (A). CCL2, CXCL1 og CXCL5 inverst korrelert med sekresjon av IL-12p70 fra dendrittiske celler behandlet med TCM (B). Den Spearman rank korrelasjon test ble brukt.
Effekt av CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF på DC modning markør uttrykk og cytokin sekresjon som svar på LPS
Etter å ha fastslått at TCM hemmer DC modning som respons på LPS og at TCM inneholder høye nivåer av kjemokiner CCL2, CXCL1 og CXCL5 vi neste bestemt om disse individuelle komponentene hadde en direkte effekt på DC. Rekombinant VEGF betydelig hemmet LPS-indusert uttrykk for DC modning markører CD80 (
p
= 0,0391) og CD54 (
p
= 0,0078) og CXCL1 vesentlig hemmet oppregulering av HLA-DR (
p
= 0,0156) (data ikke vist). Selv CCL2 og CXCL5 viste en reduksjon av LPS-indusert modningen av DC, gjorde dette ikke statistisk signifikans (data ikke vist). Mens forbehandling av DC med CCL2, CXCL1, CXCL5 eller VEGF unnlatt å forsterke LPS-indusert IL-10 sekresjon, ble det observert en betydelig reduksjon i nivåene av LPS-indusert IL-12p70 sekresjon: CCL2 (
p
= 0,048), CXCL1 (
p
= 0,0068), CXCL5 (
p
= 0,0255), VEGF (
p
= 0,0402) (figur 5). IL-1β, TNF-α, IL-8 og IL-6-produksjon av DC som respons på LPS i fravær eller nærvær av forbehandling med VEGF, CCL2, CXCL1 eller CXCL5 ble også målt; Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i nivåene av disse cytokinene er bestemt under disse betingelser (data ikke vist). Behandling av DC med CCL2, gjorde CXCL1, CXCL5 og VEGF ikke påvirke deres evne til å indusere T celleproliferasjon eller produksjon av IFNy (data ikke vist).
Supernatantene av DCS dyrket i nærvær av CCL2, CXCL1 , CXCL5 og VEGF (n = 8) ble høstet og konsentrasjoner av IL-10 og IL-12p70 bestemt ved ELISA. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Mann-Whitney U-test. * P 0,05, ** p. 0,01
I tillegg har vi undersøkt om CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF kan påvirke DC migrasjon. CCL19 ble anvendt som en positiv kontroll, siden det er kjent for å binde til reseptoren chemokiner CCR7, som uttrykkes ved DC [23]. Vi fant ut at de ikke øke migrasjon sammenlignet med CCL19 (data ikke vist).
CXCL1 og VEGF har en additiv hemmende effekt på IL-12p70 sekresjon av DC som respons på LPS
TCM har en sterk hemmende virkning på DC modning og funksjon, men CCL2 og CXCL5, som er til stede i høye nivåer i TCM, ikke har noen signifikant effekt på dendrittiske cellemodning markør ekspresjon, mens CXCL1 bare hemmet signifikant HLA-DR og VEGF i betydelig grad hemmet CD80 og CD54 (data ikke vist). Derfor undersøkte vi hvorvidt å kombinere de rekombinante cytokiner kan ha en mer potent effekt på dendrittiske cellemodning. Vi undersøkte syv forskjellige kombinasjoner av de fire cytokiner: CCL2 + CXCL1, CCL2 + CXCL5, CCL2 + VEGF, CXCL1 + CXCL5, CXCL1 + VEGF, CXCL5 + VEGF, CCL2 + CXCL1 + CXCL5 + VEGF. Kombinasjonen av CXCL1 og VEGF hemmet ikke signifikant LPS-indusert modning markør uttrykk av DC (CD80
p
= 0,0625, CD54
p
= 0,6, CD86
p
= 0,6, HLA-DR
p
= 0,1, CD83
p
= 0,8) (Figur 6A). Men å kombinere CXCL1 og VEGF betydelig redusert LPS-indusert IL-12p70 (
p
= 0,0028), men endret ikke nivåene av IL-10 (figur 6B). IL-1β, TNFa, IL-8 eller IL-6-sekresjon ble ikke endret (data ikke vist). Ingen andre kombinasjonen hadde en direkte effekt på LPS-indusert DC modning eller cytokinsekresjon av DC som respons på LPS i forhold til de enkelte cytokiner (data ikke vist). I tillegg inkludering av nøytraliserende antistoffer til CXCL1 og VEGF, alene og i kombinasjon, ikke riktig TCM indusert endring av like modning, IL-10 eller IL-12p70 sekresjon fra DC som respons på LPS (data ikke vist).
IDCS (n = 5) ble behandlet med en kombinasjon av rekombinant CXCL1 (100 ng /ml) og VEGF (20 ng /ml), 4 timer før tilsetningen av LPS (1 pg /ml). Cellene ble deretter dyrket i ytterligere 18 timer, og nivåer av CD80, CD54, CD86, HLA-DR og CD83 ble bestemt ved flow-cytometri. Resultatene er vist som fold-endring i M.F.I. i forhold til ubehandlede IDCS. Statistisk signifikans ble bestemt ved Wilcoxon rank test signert (A). Supernatanter ble fjernet fra cellene behandlet som beskrevet ovenfor, og konsentrasjonen av IL-10 og IL-12p70 ble bestemt ved hjelp av ELISA. Statistisk signifikans ble beregnet ved Mann-Whitney U test (B). * P 0,05, ** p. 0,01
Diskusjoner
I denne studien har vi vist for første gang at svulsten betinget media fra kolorektal kreft svulst explants kan hemme LPS indusert modning av stammer fra monocytter DC. I tillegg er behandling av DC med TCM før LPS stimulering betydelig økt produksjon av IL-10, et anti-inflammatorisk cytokin som inhiberer en Th1 reaksjon [24], mens redusere sekresjonen av IL-12p70, et pro-inflammatorisk cytokin som er nødvendig for Th1 svar: en DC fenotype forbundet med toleranse. Deretter fant vi at CCL2, CXCL1 og CXCL5 ble uttrykt ved høye nivåer i TCM forhold til VEGF, og vi bestemt om disse inflammatoriske mediatorer kan endre funksjonen til DC. VEGF ble inkludert i våre analyser som den tidligere hadde blitt vist å inhibere kjønnsmodning DC [8], [22]. Tilsetningen av rekombinant VEGF til IDCS hadde en hemmende effekt på LPS-indusert oppregulering av CD80 og CD54, mens tilsetning av rekombinant CXCL1 til IDCS redusert HLA-DR uttrykk etter LPS-behandling.
Imidlertid behandling av IDCS med humant rekombinant CCL2, CXCL1, CXCL5 eller VEGF, i doser på linje med andre studier [13], [22], [25], [26], førte til en signifikant reduserte nivåer av IL-12p70-sekresjon som respons på LPS-stimulering. Disse dataene tyder på at inflammatoriske mediatorer som finnes i svulsten mikromiljøet redusere kapasiteten av lokale DCs å utskille IL-12p70 og dermed induksjon av et effektivt anti-tumorrespons.
Lignende funn ble rapportert i en studie som undersøkte effekten av betinget media tatt fra bukspyttkjertelkreft cellelinje BxPC-3 (BxCM), hvor DC differensiering og modning ble hemmet av BxCM. Studien viste at BxCM redusert uttrykk av CD83, CD1a, CD1c, CD80 og CD86 ved DC svar på TNFa. I samsvar med våre funn, denne studien fant en signifikant økning i IL-10 og en reduksjon i IL-12p70 produksjon i respons til stimulering med TNFa følgende BxCM behandling [27]. Imidlertid er behandling av DC med supernatant fra RCC-10 (renal cell carcinoma-celler), resulterte i en reduksjon i ekspresjonen av modnings markører, men påvirker ikke IL-10-produksjon som respons på stimulering med TNFa, IFNα og poly I: C [22]. Disse studiene, sammen med de data som presenteres her, antyder at mange tumortyper utskille inflammatoriske mediatorer som kan hemme funksjonen av DC; men at det er sannsynlig å være variasjoner i den inflammatoriske miljøet, og den resulterende virkning på like funksjon i henhold til tumortypen og scenen. Selv om det ville vært interessant å vurdere og isolere de faktiske nivåene av DC infiltrasjon i svulsten eksplantering vev, dette kan ikke utføres på grunn av begrensning av eksplantering vev størrelse vi fikk fra kirurgi. Våre resultater tyder på at NCM ikke i vesentlig grad påvirker like modning eller cytokinsekresjon, noe som indikerer at den normale tilstøtende vev kan ha funksjonelle immunitet. Det var ingen tegn på et immunsuppressivt felt effekt.
VEGF er etablert som en viktig faktor som bidrar til tumorvekst ved å fremkalle angiogenese. VEGF er et terapeutisk mål i flere krefttyper, inkludert tykktarmskreft, der humanisert anti-VEGF mAb, Bevacizumab (Avastin) er ansatt. Tidligere studier har vist at VEGF hemmer DC DC modning og evne til å aktivere T-celler [5], [8], [22]. I denne studien viser vi at VEGF hemmer ekspresjon av CD80 og CD54, men ikke CD86 eller HLA-DR, data i samsvar med Alfaro
et al.
[22]. Interessant, fant vi at VEGF behandlet DCs utskilles vesentlig reduserte nivåer av IL-12p70 som respons på LPS; et funn som ikke tidligere har vært dokumentert. Bruken av LPS å modne DC, kontra modningen cocktail bestående av TNFa, IFNα og poly I: C brukes av Alfaro
et al
kan forklare forskjellene observert i effekten av VEGF på DC modning og IL. -12p70 sekresjon. Våre funn at VEGF stimulering av DC ikke påvirke T-celle-proliferasjon og cytokin sekresjon er forenlig med Alfaro
et al.
, Men de funnet en hemmende effekt av VEGF når til stede ved differensiering stadium av DC utvikling, noe som indikerer at differensierte DCS kan være mindre følsom for virkningene av VEGF [22]. Vår studie viste også at våre pasienter med kolorektal kreft eksplantering vev skilles høye nivåer av CCL2, CXCL1 og CXCL5, sammenlignet med VEGF. Interessant, 2CCl, CXCL1 og CXCL5 nivåer i TCM korrelerte med CD83 uttrykk på TCM behandlet DC. Dette er første gang denne sammenhengen har blitt observert, og antyder at pasienter med høyere nivåer av CCL2, kan CXCL1 eller CXCL5 har økte nivåer av CD83 på DC. CD83 er meget viktig for naive T-celle og B-celleaktivering [28], [29], men vi har også funnet at forbedret ekspresjon av CD83 på DC behandlet med TCM korrelert med redusert IL-12p70 sekresjon fra TCM behandlet DC. Det er tidligere blitt rapportert at mens forskjellige stimuli kan modnes DC til samme nivå, med tilsvarende ekspresjon av CD83, CD80 og CD86, profilen av cytokiner at de utskiller forskjellig; stimuli så som IFN-γ kan resultere i IL-12-utskillende CD83 + DC som stimulerer Th1-responser, mens andre stimuli slik som prostaglandin E2 resultat i CD83 + DC som utskiller ingen IL-12, men effektivt fremmer en Th2-respons [30].
Selv om det har blitt rapportert at CCL2, CXCL1 og CXCL5 er viktige for tumorvekst, proliferasjon og angiogenese [31], [32], effekten av disse kjemokiner på DC har ikke tidligere blitt dokumentert. CCL2, CXCL1 og CXCL5 nivåer i TCM korrelert omvendt med IL-12p70 sekresjon, er dette første gang denne sammenhengen har blitt observert, og antyder at med økende nivåer av CCL2, CXCL1 og CXCL5 i TCM, IL-12p70 sekresjon fra DC er redusert. CCL2 er en kjemoattraktant for monocytter, hukommelses T-celler og dendrittiske celler [26], [31]. CCL2 har også tidligere blitt rapportert å indusere angiogenese [17], noe som er viktig for tumorvekst og metastase. Begge pro- og anti-tumor-effekter av CCL2 har blitt observert gjennom sin virkning på monocytter og makrofager [31], mens her vi vise at CCL2 kan også påvirke den anti-tumor immunrespons ved å påvirke evnen til DC til å utskille IL-12p70 men ikke andre cytokiner, inkludert IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8 eller TNF-α som respons på LPS-stimulering. I kontrast, Braun
mfl.
Tidligere har vist at CCL2 kan hemme IL-12p70 produksjon fra monocytter og dette er pertussis toksin sensitive, men de gjorde ikke observere denne reduksjonen i IL-12p70 sekresjon fra dendrittiske celler behandlet med enten SAC + IFNy eller CD40L + IFNy [33]. Alternativt Omata
et al.
Funnet DC differensiert fra monocytter i nærvær av CCL2 hadde en redusert evne til å skille ut IL-12p70 etter stimulering med CD40-ligand, en effekt som ikke er følsomme for pertussis toksin. Disse forfatterne rapporterte ingen effekt av CCL2 på differensiering eller modningen av DC. [34]. Derfor forblir den nøyaktige mekanisme som CCL2 utøver sin virkning på DC ikke helt klarlagt.
Mens effekten av CXCL1 og CXCL5 på DC-modning og cytokin sekresjon ikke tidligere har blitt undersøkt, er deres kjente funksjon for å tiltrekke og aktivere neutrofiler [14], [15], som i sin tur har vært innblandet med tumorcellevekst, angiogenese og metastase [35]. Siden DCs uttrykke CXCR2 [19] som er reseptoren for CXCL1 og CXCL5, er det ikke overraskende at CXCL1 og CXCL5 kunne ha en effekt på DC funksjon. Kjemokiner som CCL2, CXCL1 og CXCL5 signal gjennom G-protein koblede reseptorer, som kontrollerer intracellulære cAMP-nivåer og økt cAMP-nivåer korrelerer med redusert IL-12 produksjon [36]. Imidlertid er mekanismen ved hvilken disse kjemokiner redusere IL-12p70-sekresjon fra DC ikke kjent, og det vil være gjenstand for fremtidige undersøkelser.
Interessant CXCL1 og VEGF har en additiv hemmende effekt på IL-12p70 sekresjon. De opptrer på forskjellige reseptorer som tidligere er blitt vist å være til stede på DC [7], [19], og derfor de kan aktivere forskjellige signalveier samtidig, eller de kan aktivere det samme reaksjonsvei mer effektivt. VEGF har vist seg å forbedre fosfo-ERK1 en effekt som ikke tidligere er vist for CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF. Eksplantatet tumorvev utskiller mange forskjellige løselige faktorer, og det er ikke veldig overraskende at noen få isolerte faktorer på egenhånd ikke har en virkning sammenlignbar med TCM. Det er meget sannsynlig at de mange forskjellige faktorer som utskilles i TCM ved eksplantatet tumor seg sammen ved inhibering DC modning og funksjon. Men evnen til CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF å redusere IL-12p70 produksjon av DC er viktig, da dette kan potensielt føre til en redusert anti-tumor Th1 respons
in vivo
.
I konklusjonen har vi funnet at TCM hemmer DC modning, og induserer IL-10, mens hemme IL-12p70 sekret fra DC. TCM komponenter CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF synes å spille en rolle ved modulering av den inflammatoriske respons via hemming av IL-12p70-sekresjon med DC, eventuelt for å beskytte svulsten fra en potent immunologisk respons mot den. I tillegg CXCL1 og VEGF virker sammen i hemming av IL-12p70 sekresjon fra DC. Selv om CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF er tilstede i TCM ved høye nivåer, er de ikke de viktigste komponentene i TCM som påvirker like modning og funksjon. Avslutningsvis har vi vist betydningen av svulst betinget media i å regulere dendrittiske cellen funksjon i pasienter med kolorektal kreft, men de underliggende mekanismene fortsatt må belyses.
Materialer og metoder
Ex vivo tumor eksplantering kultur
Alle vev ble oppnådd med informert skriftlig samtykke fra pasienten, og protokollen ble godkjent av etikkomiteen St. Vincent universitetssykehus.
Kirurgisk reseksjon tykktarmskreft svulstvev ( n = 21) og normalt vev ( 10 cm fra svulsten, n = 5) ble oppnådd fra pasienter fra Senter for kolorektal sykdom er eksplantering vev bio-banken på St. Vincent universitetssykehus, Dublin (12 mann, 9 kvinner, median 67 år, en Stage II, 5 trinn III, 15 Stage IV tykktarmskreft). Eksplantert vev ble kuttet i det minste i 4 like store biter på omtrent 5 mm
3 og dyrket som tidligere beskrevet [20]. I korthet, det eksplanterte tumorvev ble dyrket i 72 timer (i 24-brønners plater) i 2 ml RPMI 1640 inneholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 4 ug /ml Fungizone, 30 ug /ml gentamicin (Invitrogen, Carlsbad , California) og supplert med 20% føtalt bovint serum (Invitrogen). Etter 72 timer i kultur, ble tumor kondisjonert medium (TCM) og normale kondisjonert medium (NCM) samlet og lagret ved -20 ° C inntil anvendt for analyser.
Dendrittiske celleisolering og kultur
menneske~~POS=TRUNC moncyttavledede umodne dendrittiske celler (IDCS) ble samlet inn via perifere mononukleære blodceller (PBMC) hentet fra buffy coat preparater (National Blood Centre, St. James Hospital, Dublin). Monocytter ble isolert ved positiv seleksjon ved anvendelse av CD14-magnetiske kuler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml i 6-brønns plater i 3 ml RPMI 1640 inneholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 4 ug /ml Fungizone, og supplert med 10% definert Hyclone føtalt bovint serum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF; 50 ng /ml, Immunotools, Friesoythe, Tyskland), og humant IL-4 (70 ng /ml, Immunotools). Celler ble matet på dag 3 ved å erstatte halvparten av medium og legge friske cytokiner. På dag 6 cellene viste en umoden DC fenotype (CD14
-, CD11c
+, CD86
-, CD54
lav, CD83
-, CD80
– og HLA- DR
lav).
Stimulering av monocytter utledet DC
Fersk isolert iDC ble belagt i tre eksemplarer i 96 brønners plater 1 × 10
5 celler /200 ul i RPMI 1640 media supplementert med 10% definert Hyclone FBS (Thermo Fisher Scientific), og stimulert med en i to, en i 4 og en i 10-fortynning av tumor kondisjonert medium (TCM) fra 4 dyrkede eksplantering vev i 4 timer før tilsetning av 1 pg /ml
Escherichia coli
lipopolysakkarid (LPS; Alexis Biochemicals, Lausen, Sveits) for å bestemme den beste dosen av TCM. Deretter DC ble behandlet med en 1 i to fortynning TCM av alle 21 pasienter eksplantering vev i 4 timer før tilsetning av 1 ug /ml LPS. I tillegg ble DC behandlet med en 1 i 2 fortynning av NCM av 5 pasientens eksplantering vev i 4 timer før 1 ug /ml LPS ble tilsatt. I separate forsøk 1 x 10
5 iDC /200 ul media ble behandlet med human rekombinant 50 ng /ml CCL2 (MCP-1), 100 ng /mL CXCL1 (GROα), 100 ng /mL CXCL5 (ENA-78)
