Abstract
Bakgrunn
Menneskekreftceller opprettholde telomerer å beskytte cellene mot alderdom gjennom telomerase aktivitet (TA) eller alternativ forlengelse av telomerer (ALT) i ulike celletyper. Videre kan mobilnettet senescence omgås ved epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) under kreft progresjon i ulike solide svulster. Det har imidlertid ikke klarlagt hva som kjennetegner telomere vedlikehold og progresjon evne etter langvarig kultur i blærekreft T24 celler med hTERT dysfunksjon.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien, ved ved hjelp av en dominant negativ mutant menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) vektor for å hemme TA i blærekreft T24 celler, observerte vi utseendet på lang fenotype av telomer-lengden og ALT-forbundet PML kroppen (APB) kompleks etter 27
th passasje, som indikerer forekomsten av ALT-lignende bane i overlevende T24 /DN868A celler med telomerase hemming. I mellomtiden, telomerase inhibering resulterte i signifikant EMT som vist ved forandring i cellulær morfologi samtidig med variasjon av EMT markører. Konsekvent, de overlevende T24 /DN868A celler viste økt progresjon evne
in vitro Hotell og
in vivo
. I tillegg fant vi Twist ble aktivert for å mekle EMT i overlevende T24 /DN868A prøvene.
Konklusjon /Betydning
Til sammen våre funn tyder på at blærekreft T24 celler kan gjennomgå telomerase-to -ALT-lignende konvertering og fremme kreft progresjon ved fremskredne stadier gjennom å fremme EMT, og dermed gi romanen mulig innsikt i mekanismen av resistens mot telomerase-hemmere i kreftbehandling
Citation. Xue Y, Li L, Zhang D, Wu K, Chen Y, Zeng J et al. (2011) Twisted epithelial-til-Mesenchymale Transition Fremmer Progresjon Gjenlevende blærekreft T24 celler med hTERT-dysfunksjon. PLoS ONE 6 (11): e27748. doi: 10,1371 /journal.pone.0027748
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 12 juli 2011; Godkjent: 24 oktober 2011; Publisert: 15.11.2011
Copyright: © 2011 Xue et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av programmet for The National Natural Science Foundation of China (NSFC NO. 30772163). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
stabilisering av telomerer er kritisk for den uendelige cellulær proliferasjon som er nødvendig for tumordannelse [1]. Minst to mekanismer har blitt identifisert til å opprettholde telomerer homeostase i cellene
in vivo
samt
in vitro
. Først fleste karcinomceller utnytte telomerase, en multi-subenhet celle ribonucleoprotein enzym (referert til som en telomerase-veien), for å legge til telomeric gjentakelser på kromosom endene [2]. Telomerase er sammensatt av en RNA-subenhet, telomerase-assosiert protein 1, og katalysatoren telomerase revers transkriptase (hTERT), som er en begrensende komponent i å regulere aktiviteten av telomerase [3]. For det andre, sarkomceller utnytte en telomerase-uavhengig mekanisme kalt alternativ forlengelse av telomerer (dvs. ALT vei) for å opprettholde kromosom termini [4]. Utbruddet av ALT bestemmes av utseendet på lenge, heterogen telomerlengde, og utseendet på ALT-forbundet promyelocytic leukemi organer (APBs) i ca 10% av interfase kjerner [5].
Tidligere rapporter har indikert at telomerase og ALT mekanismen kan eksistere i noen svulster [4], [6]. Videre har en reversibel konvertering av telomerase-positive til telomerase-negative celler er rapportert tilfeller av humant papillomavirus type 16 E6-udødelig fibroblaster [7]. I lys av viktigheten av telomerase i cellen immortalisering og mangel på telomerase-ekspresjon i de fleste normale somatiske celler, telomerase-inhibitorer holdt betydelige løftet for kreftterapi i det siste [8]. Men muligheten for aktivering av ALT som er motstandsdyktig mot telomerase-inhibitorer kompliserer denne situasjonen [9]. Det er velkjent at ALT overfører egenskaper forskjellige fra telomerase på kreft. I tilfelle av glioblastoma multiforme, ALT korrelert med en bedre pasient prognose [10], mens en dårlig prognose ble påvist hos pasienter med liposarkom [11]. Årsaken til forskjellen på kreft fortsatt ukjent.
I tillegg til telomere vedlikehold, oppkjøp av et fullt ondartet fenotype omfatter også kravet om metastasering. Epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) spiller en viktig rolle i progresjon av primære tumorer mot metastaser til [12]. Nyere observasjoner tyder på at EMT og celle senescence krysses i kreft progresjon [13]. Flere forskjellige transkripsjonsfaktorer, som har blitt funnet å være i stand til å indusere EMT programmer, for eksempel Twist og ZEB1, kan også beskytte celler fra senescence indusert av
ras
onkogen [14], [15].
i dette arbeidet brukte vi en dominant negativ mutant av hTERT til konstitutivt inaktivere telomerase aktivitet (TA) i blæren kreft T24 celler. Våre data viser at lange telomer-lengden og APBs kompleks uten oppregulering av TA kan oppstå ved langvarig kultur i blæren kreftceller
in vitro
. Påfallende, ble en krysning mellom EMT og telomere vedlikehold sti observert samtidig med økt progresjon evne. Videre Twist ble aktivert for å indusere EMT. Oppsummert beskriver vi en ny mekanisme i oppkjøpet av invasive egenskaper og telomer-homeostase etter telomerase hemming i blærekreft T24 celler, og dermed gi innsikt i legemiddelresistens etter telomerase hemming i blærekreft.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle eksperimenter på dyr i samsvar med
Retningslinjer for Animal Care
av Xi’an Jiaotong University og godkjent av Ethical Review Board (ERB) komité (The First Affiliated Hospital of Medical College, Xi’an Jiaotong University, Kina), og godkjenning IDen til etikk styret er SCXK2007-0005.
Antistoffer
Antistoffer mot PML, TRF2, N-cad, vimentin , Cytokeratin-18, 19 (CK-18, CK-19), Matrix metalloproteinaser-2 (MMP-2) og Twist var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California).
Cell kultur
Den humane blærecancercellelinje T24 og osteosarcom cellelinjen U
2OS ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (GIBCO, Grand Island, NY) supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS , Sijiqing, Hangzhou, Kina) ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator.
Etablering av hTERT
DN868A Stabil celler og forbigående Twist transfeksjon
dominant negativ mutant konstruere av hTERT (PCI-neo-hTERT
DN868A) ble verifisert ved sekvensering før transfeksjon inn dyrkede T24 celler. siRNA for Twist ble utformet og syntetisert av Invitrogen (Shanghai, Kina). Sekvensen av siTwist var: 5′-følelse CACCGGACAAGCUGAGCAAGAUUCACGAAUGAAUCU UGCUCAGCUUGUCC-3 «; antisense 5»-AAAAGGACAAGCUGAGCAAGAUUCA UUCGUGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3 «. Transfeksjon ble utført ved anvendelse av LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Inc., Gaithersburg, VA) i henhold til produsentens protokoll. Stabile transfektanter ble valgt med 300 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Tyskland).
Telomerase aktivitetsanalyse
Telomerase aktivitet ble målt ved hjelp av en TRAP-PCR-ELISA assay kit følge produsentens instruksjoner (Roche, Basel, Sveits). Kort sagt ble 2 x 10
5-celler oppslemmet med lyseringsbuffer, og en lik mengde av atom supernatant ble anvendt som en TRAP templat for PCR-reaksjonen. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 25 ° C i 30 minutter, og deretter PCR amplifisert for 35 sykluser ved 94 ° C i 30 s sekunder og 59 ° C i 60 sekunder. Da produktet ble blandet med en hybridiserings-oppløsning og inkubert ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av vasking og inkubering i 30 minutter. Det ble deretter chromogenized og absorbansen ble oppdaget.
TRF analyse
DNA ble ekstrahert ved hjelp av en DNA kit (Roche, Basel, Sveits) og porsjoner (2 mikrogram) fordøyd 2 timer med restriksjonsenzymer
Rsa
jeg og
Hinf
I. Fordøyde DNA-fragmenter ble separert på 0,8% agarosegeler og blottet på positivt ladede nylonmembraner. Telomere restriksjonsfragmentene ble avdekket gjennom hybridisering med DIG-merket telomer-probe og chemiluminescence deteksjon.
Q-FISH for Cytogenetisk analyse
kromosomer fra colcemid arrestceller ble utarbeidet og fulgt en standard Q-FISH teknikk [16] med telomere PNA FISH /FITC kit (Dako Cytomation, USA). I korte trekk ble frittliggende cellene behandlet med 50 mmol /l KCl og festes ved hjelp av 03:01 metanol /iseddik; deretter lysbilder var forberedt. Telomerer ble oppdaget ved hjelp av en FITC-konjugert peptid nukleinsyre (PNA) sonde og kontra med DAPI. Digitale bilder ble tatt til fange etter konfokalmikroskopi 60 × eller 120 × mål.
Double immunfluorescens
Celler ble dyrket på dekkglass og fiksert i 4% paraformaldehyde (PFA). Etter vasking med PBS ble cellene permeabilisert ved anvendelse av 0,1% Triton X-100-løsning og blokkert med 10% esel serum. Etter inkubasjon med primære antistoffer PML og TRF2, ble de inkubert med fluorescensmerkede sekundære antistoffer Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555/568 (Invitrogen). Bilder ble samlet inn i henhold konfokalmikroskopi og behandlet ved hjelp av Adobe Photoshop 7.0.
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [17]. Kort beskrevet ble prøver ble analysert med 12% SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner, og probet med de primære antistoffer og sekundære antistoffer koblet til pepperrotperoksidase, da detektert av ECL-kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham, Piscataway, NJ).
Invasion og migrasjon analysen
invasjonen og migrasjon evnen til T24 celler ble bestemt av Transwell analysen. For invasjonen assay, ble 50 ul av Matrigel (Sigma, Inc.) anvendt på 8 um-pore-størrelse polykarbonatmembranfiltere (Corning, Inc., Corning, NY), i bunnkammeret i apparatet inneholdende DMEM med 20% FBS . 5 x 10
3 T24, T24 /PCI, og
nd passasje av T24 /DN868A 32 (definert som overlever T24 /DN868A i det følgende studien) celler ble sådd ut med et serumfritt medium, og deretter inkubert i 48 timer ved 37 ° C. Etter inkubasjon ble cellene invaderte festet til den nedre overflate av membranen fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med Giemsa. Celle tall ble telt i tre tilfeldig valgte mikroskopiske felt (10 ×) per membran. Migrasjonen Analysen ble utført som beskrevet for invasjonen analysen, uten belegg av Matrigel.
adhesjonsassayet
Matrigel ble fortynnet med serumfritt DMEM på 01:20 og belagt på undersiden av 96-brønns plate. 1 × 10
4 celler var innhøstingen og sådd i 96-brønns plate med serumfritt medium og lov til å feste til Matrigel. Etter 6 timer ble medium med ufestede celler fjernet og MTT ble tilsatt. 4 timer med inkubasjon senere, DMSO ble tilsatt for å oppløse formazankrystaller og absorbans (OD) ved 590 nm ble målt.
soft agar-kolonidannelse Assay
kolonidannelse Assayet ble utført som tidligere beskrevet [18]. Kort sagt ble totalt 500 celler suspendert i 2 ml DMEM inneholdende 0,3% agar med lavt smelte og ligger over 2 ml basislaget besto av 2 x DMEM og 1,2% agar (01:01 blandet) i seks-brønns plater. Etter inkubering ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator i 14 d, kolonier mer enn 50 celler ble tellet.
tumorgenisitet Assay
in vivo
Fire til seks uker gamle naken atymiske BALB /C mus (Shanghai Experimental Animal Center, Shanghai, Kina) ble brukt for tumorigenitet analysen. Cellene ble høstet, vasket og resuspendert i serumfritt DMEM ved en konsentrasjon på 1 x 10
7 celler /ml og 1 x 10
6-celler ble injisert subkutant. Musene ble avlivet etter 8 uker for å måle tumorvekten. Immunhistokjemisk farging ble utført som beskrevet tidligere [19].
Statistical Analysis
Alle dataanalyser ble gjort av programvaren SPSS 13.0 for Windows.
P
. 0,05 ble betraktet som grenseverdien for statistisk signifikans
Resultater
Telomerase aktivitet i T24 celle klon uttrykker dominant-negative (DN) hTERT
for å konstitutivt inaktivere hTERT ble human blærekreft cellelinje T24 med høy TA transfektert med et plasmid som koder for DN-hTERT eller tom vektor PCI, og enkelte cellekloner ble isolert ved G418 screening for 7 uker. TRAP-PCR-ELISA-analyse viste at i T24 /DN868A celler ved 3
rd passasje, ble TA kraftig redusert sammenlignet med de parentale celler (fig. 1). Tre kloner med redusert TA ble vist og betegnet som T24 /DN868A (M1~3). De tomme vektor transfektert kontrollceller ble utpekt som T24 /PCI.
Telomerase aktivitet (TA) i T24 celler transfektert med ulike konstruksjoner ble bestemt som beskrevet i materialer og metoder (*
P
b) T24; c) T24 /PCI; d~f) T24 /DN868A subkloner av
th 8,
th 24 og 27
th passasjer, henholdsvis; g og h) T24 /DN868A subkloner av 29
th og 32
nd passasje, henholdsvis (120 ×). C. TA av celler ved hvert tidspunkt når telomerlengde-analyse ble utført. Histogrammer er representative for TA i T24 /DN868A versus foreldrecellelinje.
Videre har vi farget de metaphasic kromosomer T24 /DN868A celler med en telomeric PNA sonde, og sammenlignet dem med de foreldre eller kontroll celler på samme passasje. Den osteosarcom cellelinjen U
2OS ble anvendt som en ALT-positiv kontroll (Fig. 2B a) [20]. Fig. 2B viser Q-FISH-analyse av en av klonene. Den meget intense grønne signaler ved utgangen av kromosom tilsvarte de lange telomerer. Et detekterbart telomere FISH signal kan ses på nesten hvert kromosom ende, og i de fleste kjerner i en annen passasje av paren T24 celler eller kontrollcellene T24 /PCI; Videre er intensiteten til disse signalene i begge to celler var konsistent (Fig. 2B b~c). Etter telomerase inhibering, selv om intensiteten av grønt signal ved hver ende av kromosom eller i kjernen var i overensstemmelse med den tidligere passering av T24 /DN868A, telomere signaler nedsettes gradvis for hver runde av celledeling inntil 27
th passasjen , ved hvilket punkt den totale intensiteten av fluorescenssignalet var lavest (fig. 2B d~f). Etter dette avsnittet, ble signaler med forskjellig intensitet som representerer heterogen telomerlengde sett ved slutten av enkelte kromosomer i T24 /DN868A celler (Fig. 2B g~h). For de to andre testede T24 /DN868A kloner uttrykker DN hTERT, både viste sterk telomerase hemming, men bare én (T24 /DN868A-M3) vises telomere svingninger lengde som fig. 2A og B, mens den andre (T24 /DN868A-M2) gikk til celledød og tap av kulturen på 16
th passasje.
For å analysere innholdet av telomer-forlengelses hendelser, vi undersøkte TA ved hvert tidspunkt når Q-FISH ble gjort i disse to levedyktige cellekloner. Inhibering av TA av DN hTERT var sterk og sammenhengende (opp til 32
nd passasje), og det samme lave nivå av TA ble observert etter hverandre i T24 /DN868A celler (Fig. 2C). Det er derfor lite sannsynlig at de resterende telomerase er årsaken til den observerte telomere forlengelse.
APBs status på T24 celle klon uttrykker DN hTERT
APBs kompleks er en undergruppe av promyelocytic leukemi (PML) organer inneholder telomeric DNA og telomere-bindende proteiner som TRF1 og TRF2. APBs kan spille en vesentlig rolle i ALT mekanisme, og er ikke funnet i dødelige eller telomerase-positive celler [21]. Derfor har vi oppdaget at nærværet av APBs ved ko-lokalisering av PML med TRF2 i forskjellige T24 cellene ved forskjellige passasjer i forhold til osteosarcom cellelinjen U
2OS. Som vist på fig. 3, samlokalisering av PML med TRF2 kunne ikke påvises i foreldre T24, T24 /PCI celler, eller tidligere passasjer T24 /DN868A celler. Men i 29
th passering av T24 /DN868A celler, de gule glitrer som representerer APBs var tydelig observert hos noen T24 /DN868A celler. Dessuten ble det observert en økning i det totale antall APBs i 32
nd passasje av T24 /DN868A celler. Disse resultatene indikerer sterkt nærvær av en ALT-lignende mekanisme av telomere stabilisering i subklon av T24 /DN868A celler fra 29
th passasje. For å skille sent passering av T24 /DN868A celler med egenskapene til ALT-lignende fra tidligere passasje, alle T24 /DN868A celler etter 29
th passasje ble kalt som gjenlevende T24 /DN868A celler. En av hver overlevende celle klon på 32
nd passasje ble tilfeldig brukt for følgende studie.
Double immunfluorescens analyse for APBs i hTERT-inaktivert T24 på ulike passasjer. Røde flekker representerer PML, grønne flekker representerer TRF2 og gule glitrer indikere colocalizaiton av PML med TRF2. APBs var fraværende i T24, T24 /PCI, og tidligere passering av T24 /DN868A celler, men til stede i T24 /DN868A celler på 29
th og 32
nd passasje (60 ×).
Induksjon av EMT i T24 celler med telomerase hemming
T24 er en E-cadherin mangelcellelinje som ennå viser en epitelial-lignende morfologi [22]. Under langvarig kultur, har vi funnet at T24 celler med telomerase inhibering gradvis oppviste en spindel-formet, mer langstrakt morfologi og løse intercellulære overganger fra 25
th passasje mens T24 eller T24 /PCI-celler var fremdeles polyhedralt og vokste i en tett tilkoblet måte, noe som antydet at cellene kan ha gjennomgått EMT (fig. 4A). For å teste dette, detaljert molekylær karakterisering av EMT markører for T24, T24 /PCI, og annen passasje av T24 /DN868A celler (inkludert
th 25
th 27 og 32
nd passasje) ble oppdaget av Western blot. Faktisk, observerte vi tapet av epitel-markører inkludert CK18 og CK19, og økte nivåer av mesenchymale markører og invasjons-relaterte proteiner som N-cadherin, vimentin, og MMP-2 i T24 /DN868A celler fra 25
th passasje (Fig . 4B).
A. celle morfologi T24, T24 /PCI og T24 /DN868A celler ble observert under et fasekontrastmikroskopi (20 ×). Cellemorfologi endret fra polygonal, epitelial struktur (øvre) til spindellignende, mesenchymale struktur (ned). B. Western blot-analyse av N-cadherin, vimentin, MMP-2, CK18, og CK19 nivåer i T24, T24 /PCI, og annen passasje av T24 /DN868A celler. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Redusert vedheft, økt migrasjon, invasjon og kolonidannelse overlevende T24 /DN868A celler
in vitro
For å undersøke potensialet involvering av telomerer vedlikehold og EMT i tumorutvikling, brukte vi overlevende T24 /DN868A celler som en modell for å undersøke deres cellulære atferd etter denne konverteringen. Transwell analyseresultatene viste at både migrasjon og invasiv potensial overlevende T24 /DN868A celler ble betydelig økt sammenlignet med foreldre eller kontrollceller (Fig. 5A).
A. Transwell assay for celle invasjon og migrering potensiale ble utført. B. Heft analyse for limet evne ble bestemt. C. myk agar-kolonidannelse analysen ble utført. (*
P
0,05, sammenlignet med kontrollceller).
i adhesjonsassayet, Matrigel ble anvendt for å belegge 96-brønners plate for å etterligne den ekstracellulære matriks (ECM) . O.D. verdi på vegne av klebeceller vist at limet kapasitet til å overleve T24 /DN868A celle til Matrigel ble markert redusert (fig. 5B).
Vi ytterligere utforsket virkningen av denne konverteringen på clonogenicity av T24 celler. Som forventet, myk agar-analysen viste at overlevende T24 /DN868A celler fremtredende dannet flere og større kolonier enn foreldre T24 og kontrollere T24 /PCI celler (Fig. 5C).
Økt tumorigenesis overlevende T24 /DN868A celler
in vivo
det har vist seg tidligere at ALT banen ikke erstatte telomerase i ferd med tumorigenesis
in vivo product: [23]; Derfor etablerte vi svulsten xenograft ved subkutan injeksjon av 1 x 10
6 T24, T24 /PCI, eller gjenlevende T24 /DN868A celler i 6-8 uker gamle hårløse mus (n = 4 mus per gruppe). Tumorstykkene ble videre analysert ved H 0,001, sammenlignet med T24 og T24 /PCI-celler). B. Representative svulster isolert fra T24, T24 /PCI, og overlevende T24 /DN868A-injisert nakne mus. C. HE og immunhistokjemisk farging av EMT markører i tumorer avledet fra T24, T24 /PCI, og overlevende T24 /DN868A celler, henholdsvis (40 ×).
Histologisk farging viste at svulster avledet fra gjenlevende T24 /DN868A celler var ledning-aktig og mer aggressiv mens svulster avledet fra T24 eller T24 /PCI celler ble avrundet og mindre ondartet (fig. 6C). For ytterligere å bekrefte at overlevende T24 /DN868A celler gikk EMT
in vivo
, ble immunhistokjemisk undersøkelse utført i vevsprøver fra nakne mus. Som et resultat økte nivåer av N-cadherin og vimentin i kjernen og cytoplasma, så vel som reduserte nivåer av CK18 og CK19 mellom celle grensesnittene ble observert i vev avledet fra overlevende T24 /DN868A celler (Fig. 6C).
Twist ble aktivert for å mekle EMT i overlevende T24 /DN868A celler
Neste vi lurte den molekylære mekanismen som T24 /DN868A konvertering kan modulere EMT. Vi undersøkte mange transkripsjonsfaktorer som Slug, Twist, sneglen, Smad4 og ZEB1 ved RT-PCR. Primersekvensene for RT-PCR ble vist i tabell S1. Som et resultat ble bare Slug og Twist forbedret i overlevende T24 /DN868A celler, mens de andre transkripsjonsfaktorer viste ikke åpenbart forandre (Fig. S1). Siden Twist innebærer i markedsføringen av EMT [24], og er i stand til å overvinne onkogen-indusert senescence i en rekke menneskelige celler [25], har vi fokusert på sin endring i overlevende T24 /DN868A celler. Som et resultat ble Twist dramatisk oppregulert i disse cellene ved begge av mRNA og proteinnivåene (fig. 7A og S2 fig.). Videre immunhistokjemisk farging av vevsprøver oppviste en høy andel av Twist farging i overlevende T24 /DN868A celler. I tillegg til brunlige prikker som representerer Twist i kjernen av et flertall av celler, et antall celler viste også både cytoplasmisk og nukleær farging (fig. 7B). For ytterligere å undersøke betydningen av Twist i denne EMT prosessen, vi slått ned Twist med siRNA. Spesielt, down-modulering av Twist førte til redusert evne til migrasjon og invasjon i overlevende T24 /DN868A celler (Fig. 7C og 7D). I mellomtiden, disse variasjonene var samtidig med heving av CK18, CK19, og undertrykkelse av N-cadherin, vimentin, og MMP-2 i overlevende T24 /DN868A celler (Fig. 7E).
A. RT-PCR og Western blot analyse av Twist uttrykk i T24, T24 /PCI, og overlevende T24 /DN868A celler. B. Påvisning av Twist uttrykk ved immunhistokjemisk farging i naken mus tumorprøver. C og D. Overlevende T24 /DN868A-celler ble behandlet med siRNA spesifikke for Twist, og analysert for invasjon og migrering evne. E. Western blot-analyse av EMT-assosierte proteiner.
diskusjon
I løpet av ondartet progresjon av kreft celler, vedlikehold av telomerlengde er en avgjørende forutsetning for deres immortalisering [26], som oppnås ved telomeraseaktivitet (TA) eller alternativt forlengelsen av telomerer (ALT) [27]. Inhibering av TA er ansett som et potensielt mål for cancerterapi; imidlertid, er situasjonen kompliseres av eksistensen av ALT mekanismen. Nåværende forståelse av telomerlengde kinetikk i fravær av TA og påfølgende inngrep av ALT reaksjonsveien er i hovedsak basert på feilaktige reparasjons-manglende humane tarmkreftceller og strupekreft cellelinje Hep-2 [28], [29]. I dette arbeidet ble DN hTERT brukt til å funksjonelt hemme TA i blærekreft T24, 5637, og 253J cellelinjer, og sekvensert endring av telomer-lengden ble bestemt. Dessverre, etter transfeksjon, de fleste av disse blærecancercellelinjene gikk til død, og ingen enkelt celle-klon kan bli dyrket og passert med unntak av T24-celler. Våre data viser at selv om spredning rate av T24 celler med telomerase hemming var tilbakestående og telomerlengde ble forkortet i tidligere passasje, funksjonene forbundet med ALT-lignende sti ble observert i løpet av langsiktig kultur. Det er også verdt å merke seg at det totale nivået av PML og MRN kompleks økt åpenbart, siden flere foci av MRE11, RAD50 og NBS1 ble observert i kjernen i overlevende T24 /DN868A celler (fig. S3). Mens inhibering av telomerase resulterte i enten celledød eller gjenopptreden av TA som rapportert tidligere [30], [31], vår foreliggende undersøkelse viser ingen åpenbare oppregulering av telomerase ved hver passasje, basert på Q-FISH og TRF-analyse, noe som tyder på at det er lite sannsynlig at gjenværende telomerase er den viktigste årsaken til den observerte telomere forlengelse i T24 /DN868A celler. I stedet, våre data viser at ALT-lignende mekanisme kan være den alternative måten som blærekreftceller flykte fra telomerase hemming.
Aktiverings av ALAT resultater fra sett av genetiske endringer som er tumor-typespesifikk, og mange faktorer bidra til valg av denne mekanismen for telomere vedlikehold. T24-celler uttrykker en mutant protein p53 tumor suppressor og et meget lavt nivå av MSH6 [32], [33], som anses som medvirkende faktorer for ALT-aktivering [34], [35]. Dette kan delvis forklare hvorfor blant mange blærekreft cellelinjer, bare T24 rømte fra cellen krisen scenen og fortsatte å være i live.
Selv om ALT i svulster ikke har blitt studert inngå, det er nå blitt klart at cellene epitelial opprinnelse opprettholde sine telomerer via telomerase vei, mens ALT er oftere til stede i tumorer av mesenchymal opprinnelse [5]. EMT er en prosess hvor epitelceller mister sin epitelial fenotype og skaffe nye karakteristiske trekk ved mesenchyme [36]. Interessant, kan celle-senescens blir forbigått i løpet av aktiveringen av EMT som vanligvis ledsager tumorprogresjon [15]. I kataraktisk canine linse epitelceller, fremgangs EMT omfatter også TERT [37]. I denne studien har vi lagt merke til at morfologi hTERT-inaktivert T24 celler viste en gradvis mesenchymale endring fra 25
th passasje under enhetlig kultur som demonstrert av spindel form og tap av inter veikryss. Redusert epiteliale markører og økt mesenchymale markører ble vist i både overlevende T24 /DN868A celler før på settet av ALAT-lignende egenskaper, og viste prøver som stammer fra overlevende celler, noe som tyder på at EMT ble aktivert for å omgå celle senescence som sett i andre publikasjoner (13 , 15). Basert på ulike tidspunkt av APBs utseende og EMT formasjon, svært sannsynlig, stier som fører til disse endringene kan være forskjellig.
Telomerase og ALT er tenkt å være funksjonelt urettferdig i å spørre tumorprogresjon, men det er fortsatt motstrid som veien er mer aggressive. Noen studier tyder på at den ALT veien, i det minste i noen cellelinjer, ikke funksjonelt erstatte telomerase med hensyn til tumorigenisitet og metastatiske lesjoner [38]. I denne studien har vi undersøkt utviklingen evne til å overleve T24 /DN868A celler. Sammenlignet med de av foreldre T24 eller kontrollceller, bevegelighet, invasjon, og klone dannelse evne
in vitro Hotell og tumorigenicity
in vivo
overleve T24 /DN868A celler ble betydelig forbedret, mens limet evne overlevende T24 /DN868A celler
in vitro
ble hemmet, og dermed gi sterk støtte at dette fullt ondartede fenotype ble utløst i overlevende T24 /DN868A celler med EMT.
Den grunnleggende helix-loop-helix ( bHLH) transkripsjonsfaktor Twist er en sufflør av EMT [39], og dens overekspresjon er signifikant korrelert med scenen og karakteren av menneskelig blæretumor [40]. I sammenheng med kreftutvikling, kan Twist samtidig undertrykke senescence respons og indusere EMT [41]. I denne studien fant vi at Twist er overuttrykt i overlevende T24 /DN868A celler fra 24
th passasje, og videre aggregert i dyr blære tumorvev. Konsekvent, uttømming av Twist reduserer progresjon evne til å overleve T24 /DN868A og induserer mesenchymale-til-epitelial (MET) -lignende endring. Derfor aktivering av EMT henhold telomerase hemming krever samarbeid av Twist-signalveien i blærekreft.
Til sammen våre data viser at funksjoner knyttet til ALT-lignende mekanisme og EMT kan induseres etter telomerase hemming i
