Abstract
Tidligere rapporterte vi at kreft hemmer av protein fosfatase 2A (CIP2A) formidler apoptotiske effekten av bortezomib i leverkreft (HCC). Her rapporterer vi en proteasome-uavhengig mekanisme som bortezomib induserer autofagi i HCC. Våre data indikerer at bortezomib aktivert autofagi i en dose- og tidsavhengig måte i HCC cellelinjer inkludert Huh-7, Sk-Hep1, og Hep3B. Bortezomib downregulated CIP2A, fosfo-Akt (P-Akt) og fosfo-4EBP1 (P-4EBP1) i en dose- og tidsavhengig måte i alle testede HCC celler. Ektopisk uttrykk for CIP2A avskaffet effekten av bortezomib på autofagi. Samtidig behandling av bortezomib og calyculin A, en PP2A hemmer, reduserte effekten av bortezomib på P-Akt, P-4EBP1, og autofagi. Økt fosforylering av enten Akt eller 4EBP1 av ektopiske overekspresjon beskyttede celler fra bortezomib-indusert autofagi. Videre undersøkte vi effekten av ΔBtz, en bortezomib derivat som ligner bortezomib strukturelt, men har ingen proteasome aktivitet, i HCC. Interessant, ΔBtz vist lignende effekter til bortezomib på autofagi, CIP2A, P-Akt og P-4EBP1, noe som tyder på at effekten av bortezomib på autofagi er uavhengig av proteasomhemmingen. Videre våre
in vivo
data viste at både bortezomib og ΔBtz hemmet tumorvekst, downregulated CIP2A, P-Akt og induserte autofagi i Huh-7 svulster. I konklusjonen, induserer bortezomib autofagi i HCC gjennom en CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 veien
Citation. Yu H-C, Hou D-R, Liu C-Y, Lin C-S, Shiau C-W, Cheng A-L, et al. (2013) Cancerous hemmer av protein fosfatase 2A formidler bortezomib-Induced Autophagy i leverkreft Uavhengig av Proteasome. PLoS ONE 8 (2): e55705. doi: 10,1371 /journal.pone.0055705
Redaktør: Peter Starkel, St. Luc universitetssykehus, Belgia
mottatt: 25 oktober 2012; Akseptert: 28 desember 2012; Publisert: 01.02.2013
Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet med tilskudd, NTUH 101P01 (KFC) fra National Taiwan University Hospital; NSC99-2314-B-002-017-MY2 (KFC), og NSC100-2325-B-002-036 (KFC) fra National Science Council, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er den femte vanligste solid svulst i verden [1]. Advanced HCC er karakterisert ved hyppig resistens mot konvensjonelle kjemoterapeutiske midler og stråling. Det er derfor et klart behov for å utvikle nye terapeutiske mål og strategier for HCC terapi. Nylig har autofagi veien dukket opp som et lovende nytt mål i kreftbehandling. Autophagy er kjent som en homeostatisk mekanisme for å opprettholde cellulær integritet og er en katabolsk prosess som innebærer nedbrytning av cytoplasmiske komponenter via det lysosomale maskineri [2]. Autophagy spiller flere roller i kreft: det kan fremme kreft celledød eller overlevelse, avhengig av komplekse samspill mellom metabolsk stress, veier av apoptose og autofagi [3], [4], [5]; og forstyrrelse av autophagy kan også bidra til tumorgenese [3], [6]. En bedre forståelse av autofagi forskrift kan forenkle oppdagelse av nye potensielle terapeutiske mål i HCC.
bortezomib er den første i sin klasse dipeptid boronate proteasominhibitor spesielt utpekt til å målrette 26S proteasomet [7], [8]. Bortezomib er godkjent for behandling av multippel myelom og mantelen celle non-Hodgkins lymfom (NHL) og er under klinisk undersøkelse for bruk i andre kreftformer [9], [10]. I tillegg til dens virkning på apoptose induksjon, cellesyklus hemming (G2-M fasen arrestasjon) og mange andre cellulære mekanismer forbundet med proteasomhemmingen [10], [11], [12], bortezomib har nylig blitt vist å indusere autofagi i hypoksisk HeLa livmorhalskreft celler i respons til aktivert endoplasmatiske retikulum (ER) spenning [13], i menneskelige prostata kreft celler gjennom EIF-2α fosforylering [14], og i menneskelige hode og hals plateepitelkarsinom celler i forbindelse med proteasome avhengig JNK aktivering og BCL-2 fosforylering [15]. Selv om disse studiene ofte foreslår bortezomib-indusert autofagi korrelerer med sin proteasomhemmingen [13], [14], [15], den eksakte mekanismen for bortezomib-indusert autofagi er ikke fullt ut forstått.
Det er vel kjent at mammalian target of rapamycin (mTOR) er en viktig regulator av cellevekst og autofagi [16]. Videre er aktivert mTOR kompleks 1 (mTORC1), en av de to hovedkomponenter mTOR, aktiveres S6K og fosforylerer 4EBP-1 (for derved å frigjøre 4EBP-1 fra eIF4E) fremme mRNA oversettelse [17]. I tillegg mTORC1 samhandler direkte med og hemmer ULK1 kompleks, en essensiell komponent i autofagi initiering [18]. Formidling av vekstfaktor signalering av mTOR er først og fremst som følge av den fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt sti [19]. Akt har en avgjørende rolle i kreftcelleoverlevelse og apoptose regulering, og nylige studier har vist at inhibering av Akt fremmer også autofagi [20], [21], [22]. I HCC har Akt pathway blitt vist å være konstitutivt aktivert og korreleres med en dårligere prognose [23]. Vår tidligere studie viste også at nedregulering av p-Akt er en viktig molekylær determinant av bortezomib-indusert apoptose i HCC celler [24]. Det er bemerkelsesverdig at negativ regulering av Akt signalering kan oppnås ved fosfataser, slik som fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti (PTEN) og proteinfosfatase 2A (PP2A). PTEN er en dobbel protein /lipid fosfatase som motvirker PI3K /Akt signalering ved dephosphorylating fosfatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PIP3) i 3-stillingen [20]. I motsetning til dette, er PP2A en serin /treonin protein fosfatase som kan direkte dephosphorylate p-Akt og p-ERK [25]. PP2A består av katalytisk C subenhet (PP2Ac), stillaser A subenhet (PR65) og regulatoriske B subenheter [26]. PP2A har blitt foreslått å være en tumor suppressor [27]. For eksempel kan økes PP2A aktivitet indusere apoptose ved inaktivering av Bcl-2 eller aktivering av Bad [28]. PP2A også regulerer cellesyklus, celle overlevelse og spredning av enten direkte eller indirekte hemmer cdc2, MAPK og Akt kinaser [28]. Våre nyeste dataene viste også at bortezomib øker PP2A aktivitet og dermed downregulating p-Akt og indusere apoptose i HCC celler [29]. Videre har flere cellulære hemmere av PP2A, for eksempel SET [30] og CIP2A blitt identifisert [31]. CIP2A har dukket opp som en roman oncoprotein og et økende antall rapporter viser at det er overuttrykt i mange humane maligniteter, inkludert HCC [32], [33], [34], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39]. CIP2A har vist seg å stabilisere c-Myc oncoprotein ved å hemme PP2A aktivitet overfor c-Myc, og dermed fremme forankringsuavhengig cellevekst og
in vivo
tumordannelse [31]. Nylig har vi videre vist at CIP2A, gjennom hemming av PP2A avhengig p-Akt inaktivering, formidler apoptotisk effekten av bortezomib i HCC celler [40].
I denne studien rapporterer vi en proteasome uavhengig mekanisme som bortezomib induserer autofagi i HCC. Vår nåværende arbeid antyder at bortezomib induserer autofagi i HCC gjennom en CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 veien.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
bortezomib (Velcade®) ble vennlig levert av Millennium Pharmaceuticals. For
in vitro-studier
, bortezomib ved forskjellige konsentrasjoner ble oppløst i DMSO og deretter tilsatt til cellene i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 5% føtalt bovint serum (FBS). Den endelige DMSO konsentrasjonen var 0,1% etter tillegg til medium. Calyculin A og 3-metyladenin (3-MA) ble kjøpt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Antistoffer for immunblotting slik som anti-akt1, ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (San Diego, California). Andre antistoffer som anti-LC3, -P-Akt (Ser473), -4EBP1, -P-4EBP1, -P-mTOR, -mTOR, -P-S6K, -S6K, anti-S6, -P-S6, – NF-kB, -IκB-α, -ATG3, -ATG5, -ATG7, og -Beclin en var fra Cell Signaling (Danvers, MA).
Cell kultur og western blot analyse
SK-Hep1 og Hep3B cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Den Huh-7 HCC cellelinjen ble innhentet fra helsevitenskap Forskning Resources Bank (Osaka, Japan, JCRB0403). Celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycin-sulfat, og 25 ug /ml amfotericin B i et 37 ° C fuktet inkubator og en atmosfære av 5% CO
2 i luft. western blot analyse ble utført som tidligere rapportert
Autophagy analyse
Legemiddelutløst autofagi ble vurdert av flere analyser inkludert:. (1) Western blot analyse av microtubule-assosiert protein en lett kjede 3 ( LC3-II) som beskrevet tidligere; (2) Immunofluorescens av LC3-II. Kort sagt ble Huh7-celler sådd ut på en 6 cm plate. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble cellene behandlet med 800 nM bortezomib i 16 timer, og fiksert med iskald 4% paraformaldehyd. De fikserte celler ble deretter inkubert med det primære antistoff kanin-anti-LC3II (1:200, # 3868, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i blokkeringsløsning (1% bovint serumalbumin i TBST) i 1 time ved romtemperatur og deretter farget med anti-kanin IgG (H + L) F (ab «) 2 fragment (Alexa Fluor® 488 konjugat, # 4412, Cell Signaling) og DAPI. Celler ble undersøkt under et LEICA DM2500 fluorescens mikroskop; (3) Strømningscytometri-analyse av LC3-II. Kort sagt ble Huh7 og Hep3B utsådd på en 6 cm plate. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble cellene behandlet med 800 nM bortezomib i 16 og 24 timer, fiksert med iskald 4% paraformaldehyd, og deretter behandlet med is-kald 100% metanol. De fikserte celler ble deretter inkubert med det primære antistoff kanin-anti-LC3II (1:100, # 3868, Cell Signaling) i blokkeringsløsning (1% bovint serumalbumin i TBST) i 1 time ved romtemperatur, og deretter farget med anti- kanin IgG (H + L), F (ab «) 2 Fragment (Alexa Fluor® 488 konjugat, # 4412).
Immunofluoresence av LC3-GFP og acridinoransje
Huh7 celler, dyrket på dekkglass, ble transfektert med EGFP-LC3 plasmid, etterfulgt av 400 nM bortezomib behandling i 24 timer. Cellene ble deretter raskt vasket med PBS og fiksert ved romtemperatur i 15 minutter med 4% paraformaldehyd. Etter å ha blitt vasket to ganger med PBS, ble cellene blokkert med 1% bovint serumalbumin i TTBS og så montert. Den subcellulære fordeling av EGFP-LC3 ble observert under et fluorescens mikroskop (Leica DM2500). For akridin orange farging ble SK Hep1-celler utsådd i et 6-cm plate. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble cellene behandlet med 800 nM bortezomib i 16 timer, fiksert med iskald 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved værelsestemperatur og deretter farget med acridin oransje (5 ug /ml) i 5 minutter ved romtemperatur. Celler ble undersøkt under et LEICA DM2500 fluorescens mikroskop
HCC celler med konstitutivt aktiv CIP2A
CIP2A cDNA (KIAA1524) ble kjøpt fra Origene (RC219918, Rockville, MD).. I korthet, etter transfeksjon, ble cellene inkubert i nærvær av G418 (0,78 mg /ml). Etter 8 ukers seleksjon, overlevende kolonier, dvs. de som oppstår fra stabilt transfekterte celler, ble valgt ut og individuelt forsterket. HCC celler med stabil uttrykk for CIP2A-myc ble deretter behandlet med medikamenter, høstet, og behandlet for western blot analyse.
Xenotransplantat tumorvekst
Mann NCR atymiske nakne mus (5-7 uker alder) ble hentet fra National Laboratory Animal senter (Taipei, Taiwan). Musene ble huset i grupper og holdt under standard laboratoriebetingelser på en 12-timers lys-mørke-syklus. De fikk tilgang til sterilisert mat og vann
ad libitum
. Alle eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av disse musene ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Laboratory Animal Care og bruk komité National Taiwan University (Permit Number: 20080205). Hver mus ble inokulert s.c. i den dorsale flanke med 1 x 10
6 Huh-7 celler suspendert i 0,1 ml serumfritt medium inneholdende 50% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Når tumorer nådde 200-300 mm
3, mus mottok en intraperitoneal injeksjon av bortezomib (1 mg /kg kroppsvekt) eller ΔBtz (1 mg /kg kroppsvekt) to ganger ukentlig for varigheten av behandlingen. Controls mottatt kjøretøy.
Statistisk analyse
Tumor vekst datapunkter er rapportert som gjennomsnittlig tumorvolum ± SE. Sammenligninger av gjennomsnittsverdier ble utført ved hjelp av uavhengige utvalg
t
test i SPSS for Windows 11.5 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
bortezomib induserer autofagi i HCC
for å undersøke effekten av bortezomib på autofagi i HCC, vi først undersøkte uttrykk for microtubule-assosiert protein en lett kjede 3 (LC3-II), en LC3-fosfatidyl-etanolamin konjugat, som er et kjennetegn på autofagi. Som vist på fig. 1A, bortezomib indusert autofagi i en konsentrasjonsavhengig måte å starte i en konsentrasjon på 200 nM i Huh-7, Sk-Hep1 og Hep3B celler, noe som gjenspeiles av økningen i LC3-II. I tillegg utførte vi en tidsavhengig analyse av bortezomib-indusert autofagi. Våre data viser at bortezomib oppregulert ekspresjonen av LC3-II på en tidsavhengig måte (fig. 1B). Deretter vi oppdaget at ekspresjonen av LC3-II ved strømningscytometri. Som vist på fig. 1C
forlot
, bortezomib økte nivåer av LC3-II betydelig etter behandling med bortezomib på 24 timer. Videre bortezomib-indusert autofagi ble også bekreftet av LC3-II immunofluoresence farging (Fig. 1C
midt
). Den stimulerende effekt av bortezomib på autophagy ble bekreftet ved en økning av GFP-LC3 punkter i cellene behandlet med medikamentet, som undersøkt ved GFP-LC3 analysen (fig. 1D
øverst
), og også ved en økning i acridinoransje farging for sure vesikulær organeller (fig. 1D
nederst
). Disse dataene indikerer at bortezomib aktiverer autofagi i HCC betydelig.
En doseavhengig effekt av bortezomib-indusert autofagi. HCC celler ble behandlet med bortezomib ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Cellelysater ble fremstilt for immunblotting av mikrotubulus-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3). B, tidsavhengige effekter av bortezomib-indusert autofagi. Celler ble utsatt for bortezomib ved de angitte konsentrasjoner i 24 eller 48 timer. C, effekter av bortezomib på LC3-II.
Venstre, etter analyse av LC3-II farging av flowcytometri. Cellene ble behandlet med bortezomib på 800 nM i 16 eller 24 timer.
Høyre, etter analyse av LC3-II immunfluorescens. Hep3B celler ble behandlet med bortezomib ved 800 nM i 24 timer. D,
topp, etter LC3-GFP farging.
Bottom,
acridinoransje flekken.
Hemming av CIP2A-Akt-4EBP1 signalveien er assosiert med bortezomib-indusert autofagi i HCC
Vårt tidligere arbeid identifisert som hemming av CIP2A er den viktigste determinant av bortezomib-indusert apoptose i HCC celler. For ytterligere å undersøke mekanismen som bortezomib indusert autofagi i HCC, neste undersøkte vi om CIP2A spiller en rolle i bortezomib-indusert autofagi i HCC. Som vist på fig. 2A og B, bortezomib downregulated proteinnivåer CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 og indusert autofagi i alle HCC cellelinjer, inkludert Huh-7, Sk-Hep1 og Hep3B, i en treringstrinnet og tidsavhengig måte. Videre bortezomib ikke signifikant påvirker uttrykket nivåer av andre autofagi relaterte proteiner inkludert ATG7, ATG5, Beclin 1, ATG3, P-S6K, og S6K (Fig. 2C). Disse resultatene foreslår at inhibering av CIP2A-Akt-4EBP1 er forbundet med bortezomib-indusert autophagy i HCC celler.
A, doseavhengig analyse av CIP2A, Akt og 4EBP1 i HCC celler. Celler ble utsatt for bortezomib ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. B, tidsavhengig analyse av CIP2A, Akt og 4EBP1 i HCC celler. Celler ble utsatt for bortezomib ved de angitte konsentrasjoner i 24 eller 48 timer. C, doseavhengig analyse av Autophagy-relaterte proteiner. Celler ble utsatt for bortezomib på de angitte konsentrasjoner i 24 timer.
Target validering av CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1
For å validere den rollen CIP2A i formidling effekten av bortezomib på autofagi i HCC, overexpressed vi CIP2A i HCC. Vi fant at ektopisk uttrykk for CIP2A beskyttet celler fra bortezomib-indusert autofagi i Huh-7 og Hep3B celler, noe som indikerer at CIP2A spiller en sentral rolle i formidling av autophagic effekten av bortezomib i HCC celler (fig. 3A). I tillegg legger calyculin A, en PP2A hemmer, reduserte effekten av bortezomib på CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 og autofagi i Huh-7 (Fig. 3B
forlot
). overekspresjon av akt1 avskaffet bortezomib-indusert autofagi signifikant (Fig. 3B
midten
). Ektopisk uttrykk for 4EBP1 redusert også effekten av bortezomib på autofagi i Huh-7. Disse dataene indikerer at CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 signalveien spiller en nøkkelrolle i formidling av bortezomib effekt på autofagi i HCC. Videre undersøkte vi effekten av en kombinasjon av bortezomib og rapamycin, en mTOR-hemmer, på autofagi. Våre data viste samtidig behandling med rapamycin og bortezomib økt autofagi betydelig (Fig. 3C
forlot
). Videre 3-MA, en autofagi inhibitor, reverserte autophagic effekten av bortezomib i Huh-7 celler (Fig. 3C
høyre
). Spesielt, har vi utført alle forsøkene ovenfor (figur 3) i hver HCC cellelinjer og har funnet at det var ingen signifikant forskjell mellom disse cellelinjene med hensyn til effekten av bortezomib på validerte mål. Bare noen av de representative data har vist her.
A, ektopisk uttrykk for CIP2A-myc opphever effekten av bortezomib på autofagi i Huh-7 og Hep3B celler. -Celler ble transfektert med CIP2A-myc og ble valgt ut for 8 uker ved G-418. Analyse av autophagy ble utført ved western blot (WB) etter at cellene ble utsatt for sekvensielt DMSO eller bortezomib (200 nM eller 400 nM eller 800 nM) i 24 timer. B,
igjen, etter samtidig behandling med calyculin A, en PP2A inhibitor, reverserer effekten av bortezomib på CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 og autofagi. Celler ble behandlet med calyculin A (1 mM) eller bortezomib (800 nM) i 24 timer.
Middle, etter ektopisk uttrykk for akt1 redusert effekten av bortezomib på autofagi i Huh-7 celler.
Høyre,
ektopisk uttrykk for 4EBP1 redusert effekten av bortezomib på autofagi i Huh-7 celler. C,
igjen, etter samtidig behandling med rapamycin, en mTOR-hemmer, forbedret bortezomib-indusert autofagi i Huh-7 celler. Celler ble behandlet med rapamycin (100 nM) og /eller bortezomib (400 nM) i 24 timer.
Høyre, etter Co-behandling med autofagi hemmer 3-metyladenin (3-MA) redusert bortezomib-indusert autofagi. Huh7 celler ble behandlet med bortezomib (800 nM) og /eller tre-MA (1 mm) i 16 timer.
Effekten av bortezomib på autofagi og CIP2A er uavhengig av proteasome
for å undersøke om effekten av bortezomib på autofagi og CIP2A er relatert til sin proteasomhemmingen aktivitet, syntetisert vi en bortezomib derivat (ΔBtz), som er lik bortezomibmetabolitter strukturelt, bortsett fra at det mangler en borsyre funksjonell gruppe, en kritisk bidragsyter til proteasome aktivitet (fig. 4A
forlot
). Sammenlignet med bortezomib, ΔBtz hadde liten effekt på proteasomhemmingen (Fig. 4A
midten
) eller på NF-kB hemming (Fig. 4A
midt
). NF-kB er en kjent proteasominhibitor mål. Interessant, viste ΔBtz signifikante effekter på CIP2A, P-Akt, og P-4EBP1 i en treringstrinnet og tidsavhengig måte i HCC ligner bortezomib (fig 4B
forlot
.
midten
). Co-behandling med autofagi inhibitor 3-MA redusert autophagic effekten av ΔBtz (Fig. 4B
midt
). ΔBtz økt uttrykk for LC3-II (fig. 4C
venstre
), og også økt acridinoransje farging for sure vesikulær organeller (fig. 4C
midten
). Ved hjelp av en elektronmikroskopi teknikk, ble antallet autophagic vakuoler vist å være markert økt i Sk-Hep1 celler behandlet med 800 nM eller bortezomib ΔBtz, men ikke i kontroll (fig. 4C
høyre
). Videre undersøkte vi effekten av andre proteasomhemmere MG132 og laktacystin, på autofagi og CIP2A. Våre data viste at verken MG132 eller laktacystin hadde signifikante effekter på autofagi eller CIP2A (fig. 4D
forlot
). Men som forventet, disse to proteasomhemmere utstilt betydelig proteasomhemmingen aktivitet (fig. 4D
midt
). Disse data tyder på at effekten av bortezomib på autofagi er uavhengig av proteasome.
A,
igjen, etter kjemiske strukturer av bortezomib og ΔBtz.
Middle,
effekten av bortezomib og ΔBtz på proteasomhemmingen.
Høyre,
effekten av bortezomib og ΔBtz på NF-kB. B,
igjen,
doseavhengige effekter av ΔBtz på CIP2A, Akt og LC-3.
Middle,
tidsavhengige effekter av ΔBtz på CIP2A, Akt og LC-3.
Høyre, etter Co-behandling med autofagi hemmer 3-MA redusert ΔBtz-indusert autofagi. C,
forlot
, effekter av ΔBtz på LC3-II immunofluoresence.
Middle
, effekter av ΔBtz på acridinoransje farging.
Høyre, etter Sk-Hep1 celler behandlet med bortezomib (800 nM) eller ΔBtz (800 nM) eller kjøretøy ble høstet, fast og innebygd i anspore harpiks. Sytti nanometer tynne snitt ble kuttet og undersøkt ved 120 Kv med en JEM-1400 transmisjonselektronmikroskop. Pilene viser autophagic vakuoler. D, gjorde andre proteasomhemmere ikke indusere autofagi i HCC.
Venstre
, effekter av MG-132 og laktacystin på CIP2A og LC-3.
Høyre
, effekter av bortezomib, MG-132 og laktacystin på proteasomhemmingen.
Effekt av bortezomib og ΔBtz på HCC xenograft tumor
For å bekrefte om effekten av bortezomib på autofagi har potensielt relevante kliniske implikasjoner, vurdert vi
in vivo
effekten av bortezomib på HCC xenografttumorer. Tumor-bærende mus ble behandlet med kjøretøy eller bortezomib eller ΔBtz. Begge stoffene ble injisert intraperitonealt i 1,0 mg /kg to ganger per uke i 2 uker. Alle dyr tolererte behandlinger godt uten observerbare tegn på toksisitet og hadde stabile kroppsvekt i løpet av studien. Ingen grove patologiske forandringer ble observert ved obduksjon. Våre data indikerer at bortezomib og ΔBtz viste lignende effekter på Huh-7 tumorvekst. Størrelsen av tumoren ble redusert signifikant etter to ukers behandling. Å relatere biologisk respons med virkningsmekanismen identifisert
in vitro
, effekten av bortezomib på autofagi i HCC svulster ble undersøkt. Som vist på fig. 5B og 5C, behandling av ΔBtz redusert proteinnivå CIP2A og P-Akt og betydelig indusert LC3 i Huh-7 celler som ligner på bortezomib. Disse dataene viser at ΔBtz hadde betydelige anti-tumor effekter
in vivo Hotell og, viktigst av alt, tyder på at bortezomib induserer autofagi i HCC via en proteasome uavhengig mekanisme.
a, tumor vekstkurver av Huh -7. Poeng, mener (n = 6); barer, SE. *
P
0,05; **
P
0,01. B, western blot analyse av CIP2A, P-Akt, akt1 og LC-3 i Huh-7 svulster. C, immunoblot ble skannet ved en UVP BioSpectrum AC-bildesystem og kvantifisert ved å bruke VisionWork LS programvare for å bestemme forholdet mellom nivået av CIP2A til aktin.
Kolonner
, mener;
barer
, SD (n = 3, *
P
0,05). D, oppsummering av modusen for handlingene til bortezomib.
Diskusjoner
Denne studien viser en ny mekanisme som bortezomib induserer autofagi i HCC celler (dvs. CIP2A-PP2A-Akt -4EBP1 sti), og øker forståelsen av onkogene proteiner som Ras, Akt og ERK som regulerer autofagi [6], [41]. Interessant, ved anvendelse av forbindelsen ΔBtz som ligner bortezomibmetabolitter i kjemisk struktur, men mangler signifikant proteosomet hemmende evne, viste vi at dette CIP2A-avhengig regulering av bortezomib-indusert autofagi er ikke nødvendigvis er avhengig av proteasomhemmingen. Bortezomib antas å inhibere proteasomer 20S kjernepartikkel ved dannelse av et stabilt tetraeder borsyre mellomproduktet med den N-terminale rest treonin av de aktive p-subenheter av 20S kjernepartikkel [7]. Basert på viktigheten av borsyre funksjonell gruppe i blokaden av proteasome, erstattet vi bortezomib med ΔBtz som skiller seg fra bortezomib i sin boronate gruppe (Figur 4A). ΔBtz viste faktisk litt proteasomhemmingen men likevel fremkalte CIP2A avhengig autofagi i en lignende måte som bortezomib (figur 4). Dette proteasome uavhengig CIP2A hemming og autofagi formidlet av bortezomib ble ytterligere støttet av funn som andre proteasomhemmere (MG132 og laktacystin), ikke signifikant påvirker autofagi og CIP2A (figur 4D
forlot
.) Tross viser betydelig proteasome hemming aktivitet (fig. 4D
midt
). Disse data indikerer klart at effekten av bortezomib på autofagi kan være uavhengig av proteasomhemmingen. Spesielt, responsen fra hver cellelinje til induksjon av LC3-I /LC3II ved bortezomib var forskjellig (fig. 1A), og var ikke identiske med de i henhold endringer i CIP2A og P-Akt (fig. 2A). En mulig forklaring er at disse forskjeller kan være forbundet med forskjellige genetiske bakgrunner mellom cellelinjer. Men det er fortsatt mulig at nye mål eller veier (unntatt CIP2A /Akt sti) kan også spille en rolle som formidler effekten av bortezomib på autofagi.
proteasome og autofagi-lysosome trasé er regnet som to hovedruter for eukaryote intracellulært protein klaring og deres kobling og interaksjoner har vært de siste emner av interesse [42], [43], [44]. Det anses at disse to cellenedbrytningssystem er funksjonelt koplet og undertrykkelse av proteasom-reaksjonsveien aktiveres autofagi gjennom indusert ER stress [43], [45]. I denne sammenheng, til aktivering av Autophagy funksjoner kompensere for den reduserte nedbrytningen av ubiquitinmolekyler protein indusert av proteasomhemmere og lindrer ER stress [14], [45]. Følgelig kan autophagy beskytte celler fra giftigheten av proteasomhemmere. På den annen side, kan inhibering av autophagy kompromiss nedbrytning av ubiquitin-proteasom-spredningsveier substrater [46]. Bevis har vist at en kombinasjon av Autophagy inhibitorer og proteasomhemmere fremmer celledød gjennom både apoptose og nekrose [14]. Med vår HCC modell, har vi vist at bortezomib indusert autofagi gjennom en proteasome-uavhengig mekanisme. Tidligere har vi bekreftet at bortezomib kan indusere apoptose gjennom en CIP2A-PP2A-p-Akt mekanisme, som også er skilt fra proteasomhemmingen bortezomib [40]. Vi viste at bortezomib indusert autofagi i HCC cellelinjer (dvs. Sk-Hep1, Hep3B, og Huh-7) som også er følsomme for bortezomib-indusert apoptose. Ved hjelp av vår HCC modellen er det klart at gjennom hemming av CIP2A bortezomib utløser både apoptose og autofagi, som begge er uavhengige av proteasomhemmingen. Videre bevis på at CIP2A spiller en viktig rolle som formidler bortezomib indusert apoptose og autofagi i HCC celler antyder at CIP2A kan være et potensielt nytt medikament mål i HCC og at forbindelser /stoffer som fungerer som CIP2A hemmere kan ha terapeutisk potensial i HCC. Enten kjente autofagi hemmere som bafilomycin A1, 3-MA eller chloraquine kan synergize med disse CIP2A hemmende midler for å drepe kreftceller garanterer fremtidige studier.
I tillegg til funn som onkogene CIP2A formidler bortezomib indusert autofagi, denne studien identifiserte p-4EBP-en som deltaker i bortezomib indusert autofagi nedstrøms p-Akt. Rollen som p-4EBP1 ble validert ved ektopisk uttrykk for 4EBP1, noe som resulterte i en økning i p-4EBP1, og deretter reduseres effekten av bortezomib på autofagi (figur 3B). 4EBP-en er kjent som nedstrøms effektor av PI3K /Akt /mTOR signalisere at i ikke-fosforylert skjema binder tett til eIF4E og hemmer et viktig steg i oversettelse initiering [47], [48]. EIF4E er en nøkkelfaktor i cap-avhengige oversettelse initiering (inkludert flere viktige teinene som c-myc, cyclin D1, hypoksi-induserbar faktor 1, og Mcl-1) som styrer tumorcellevekst og overlevelse. Våre data tyder på at bortezomib downregulated CIP2A-PP2A-p-Akt forbundet p-4EBP1. Det er mulig at nedregulering av p-4EBP1 trykt eIF4E avhengig oversettelse og dermed fremme bortezomib-indusert autofagi. Denne antakelsen støttes av en fersk undersøkelse som viser at undertrykkelse av 4EBP1 uttrykk resulterte i re-sensibilisering av MYC-uttrykke prostata kreft celler til rapamycin-indusert autofagi [49]. Ja, vi har også lagt merke til at bortezomib også undertrykkes uttrykk for 4EBP-1 i Sk-Hep1, og Hep3B celler (Figur 2A), som også kan bidra til bortezomib-indusert autofagi. Alternativt kan PP2A direkte dephosphorylate eIF4E og bidra til bortezomib-indusert autofagi [50]. Likevel er den eksakte mekanismen som p-4EBP1 deltar i autofagi aktivering i HCC å bli belyst og videre studier er nødvendig. Til tross for dagens resultater, forblir den detaljerte mekanismen som bortezomib hemmer CIP2A ukjente og videre mekanistiske studier er nødvendig. De mulige mekanismer gjennom hvilke bortezomib kan påvirke transkripsjon av CIP2A inkluderer direkte eller indirekte promoter regulering av CIP2A mRNA, epigenetisk regulering av
CIP2A
genet ved DNA metylering eller mikro-RNA maskiner, eller påvirker andre hittil ukjente molekyler som kan regulere CIP2A uttrykk
i konklusjonen, induserer bortezomib autofagi i HCC celler gjennom en roman proteasome uavhengig mekanisme. CIP2A avhengig p-4EBP-en nedregulering. Denne studien identifiserer romanen oncoprotein CIP2A som en viktig formidler av HCC celler til bortezomib-indusert autofagi og antyder at CIP2A kan være et potensielt nytt medikament mål i HCC. Videre kan oppdagelsen av forbindelser /legemidler som virker som CIP2A inhibitorer har terapeutisk potensial i HCC terapi.
