Abstract
Defekt IFN signaliserer resulterer i tap av medfødt immunitet og sensitizes celler til forbedret cytolytisk drap etter vestikulær Stomatitt virus (VSV) infeksjon. Undersøkelse av medfødt immunitet status av de normale humane bronkiale epitelceller Beas2B og 7 lungekreftceller viste at oppheving av IFN-signalering i kreftceller er forbundet med større følsomhet for å VSV infeksjon. Den forstyrrelse av IFN veien i lungekreftcellelinjer og primære tumorvev er forårsaket av epigenetisk stanse av kritisk interferon responsive transkripsjonsfaktorer IRF7 og /eller IRF5. Selv om 5-aza-2′-deoksycytidin behandling unnlater å reaktivere IRF7 og IRF5 ekspresjon eller for å beskytte celler mot VSV infeksjon, manipulere IFN signalisering ved å forandre ekspresjon IRF endrer den virale følsomhet av disse cellene. Lungekreft celler kan være delvis beskyttet mot virus drap hjelp IRF5 + IRF7 overekspresjon, mens IFN pathway avbrudd ved transfeksjon av siRNAs til IRF5 + IRF7 øker cellenes sårbarhet for virusinfeksjon. Derfor IRF5 og IRF7 er sentrale transkripsjonsfaktorer i IFN sti som bestemmer viral følsomhet av lungekreftceller; den epigenetiske svekket IFN sti i lungekreft vev gir potensielle biomarkører for vellykket selektiv avliving av kreftceller ved onkolytiske viral behandling
Citation. Li Q, Tainsky MA (2011) epigenetiske stanse av IRF7 og /eller IRF5 i Lung kreft celler fører til økt følsomhet for Onkolytiske virus. PLoS ONE 6 (12): e28683. doi: 10,1371 /journal.pone.0028683
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 15 august 2011; Godkjent: 13 november 2011; Publisert: 14.12.2011
Copyright: © 2011 Li, Tainsky. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Barbara og Fred Erb Velsignet Chair in Cancer genetikk Dr. Tainsky, midler fra Karmanos Cancer Institute, molekylærmedisin og genetikk Applied Genomics Technology Center ved Wayne State University, og Genomics og biostatistikk kjerner av Karmanos Cancer Institute , P30CA022453. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Som den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet hos både menn og kvinner, er lungekreft ansvarlig for godt over 1 million dødsfall på verdensbasis årlig. Selv om diagnostisering og behandling har blitt forbedret, er fem års overlevelse bare 14% i stor grad på grunn av svikt i svulst debulking kirurgi og systemisk kjemoterapi. Forbedringen av lungekreft behandling er et stort folkehelse mål. Nylig, naturlig forekommende eller genetisk omkonstruert onkolytiske virus, inkludert meslinger virus, Newcastle Disease Virus (NDV), VSV, adenovirus, reovirus og Herpes simplex-virus gir en effektiv og lovende alternativ terapeutisk tilnærming for å bekjempe denne sykdommen [1]. Anvendes alene eller i kombinasjon med kjemoterapi, onkolytiske virus selektivt ødelegger tumorceller ved å angripe kreft defekter i store reaksjonsveier, slik som p53 tumor suppressor, ras signaltransduksjon og IFN signalveier [1], [2]. Foreløpig effektiviteten og sikkerheten av ulike onkolytiske virus i behandling av ulike kreftformer blir evaluert i prekliniske dyremodeller og fase kliniske I-III studier [3]. Blant dem, et negativ tråd-RNA-virus VSV, som kan utløse medfødt immunitet mekanismer, er blitt vist å være effektiv mot ondartede glioma, melanom, leukemier, hepatocellulær, bryst, blære og prostata cancer som har defekte antivirale responser. [4], [5], [6], [7].
type I IFN signalveien aktiveres av VSV infeksjon i første linje medfødte immunrespons for å beskytte normale vev fra virale dreping, og derfor tumorceller som har mistet sin antivirale reaktivitet representerer selektive mål for VSV. Den primære respons på virusinfeksjon og opptak av dobbelt-trådet RNA er TLR3 aktivering som er mediert av IRF-3, cJUN /ATF-2, og NFKB, for derved å fremkalle produksjon av øyeblikkelig-tidlige responsgener primært IFNβ. De tidlige respons IFN binde seg til type I IFN reseptorer (IFNAR) i en autokrin eller parakrint måte å aktivere STAT1 og induserer uttrykk for sekundære antivirale responsgener inkludert transkripsjonsfaktor IRF7 som deretter fremmer uttrykk andre IFN stimulert gener (ISGs). Til slutt, den tertiære transcriptional bølgen av IFNα etablerer en antiviral tilstand [8], [9].
svekkelse av IFN signalering er knyttet til en økt risiko for svulst utvikling [10], [11], [12 ] som IFN pathway viser også antiproliferative og immuntilsynsoppgavene mot kreft. Følgelig flertallet (~80%) av NCI 60 panel kreftcellelinjer skjerm forstyrret medfødt immunitet svar [9]. Vi har vist at IFN signalveien ble opphevet under spontan immortalization i fibroblaster fra Li-Fraumeni syndrom (AKU) pasienter som er disponert for tidlig debut og flere svulster på grunn av bakterie linjer mutasjoner i p53. Som en viktig epigenetisk kontroll mekanisme, DNA hypermethylation av CPGs i promotorområdene undertrykker genuttrykk både under utvikling og tumorigenesis. Flere ISGs ble nedregulert av epigenetisk stanse under immortalization, en tidlig og nødvendig skritt i kreftutvikling, og noen av de samme ISGs ble oppregulert på replicative senescence [13], [14], [15]. Behandling av de udødelige AKU-cellelinjer med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-DC), en hemmer av DNA metyltransferaser restaurert IFN signalering og induserte en senescence lignende tilstand [13], [15].
IFN-induserbare transkripsjonsfaktorer, IRFs, er viktige formidlere av IFN-respons. Mangel på
IRF7
uttrykk samsvarer med avvikende arrangøren hypermethylation av CpG øyer i sin promotor og ble også identifisert som en av metylering-forstummet gener i flere krefttyper, inkludert lunge, hepatocellulær, mage og bukspyttkjertel kreft [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Redusert ekspresjon av IRF5, en annen viktig faktor transkripsjon av IFN-reaksjonsveien, ble også observert i hematologiske maligniteter, noe som er konsistent med sin rolle for å indusere G2-M vekststans og apoptose [20]. Epigenetisk inaktivering av
IRF5
ble likeledes observert i hepatocellulær og magekreft [21], [22]. Som direkte indusere av IFN vei, IRF7 og IRF5 indusere overlapp ISG transkripsjons profiler, men forskjells uttrykk mønstre og kinetikk ISGs tiltalt at de har nonredundant og distinkte roller i medfødte immunresponser. Sammenlignet med IRF7, er IRF5 en mye sterkere aktivator av de tidlige antivirale gener inkludert IFNβ [23]. I en nylig rapport demonstrerte vi at økt ekspresjon av IRF5 og /eller IRF7 kunne aktivere IFN-relaterte gener, hemme cellevekst, og induserer begynnende alderdom [15]. Stanse av disse essensielle IRFs og vekst-undertrykkende IFN veien kan være en nødvendig tidlig begivenhet i utviklingen av kreft, særlig knyttet til immortalization.
Selv om kreftceller, med sin IFN-sti-avskaffet, kan ha ervervet en vekst /overlevelse fordel over sine vanlige kolleger, de samtidig svekke deres antivirale beskyttende evne. Her er nye terapeutiske paradigmer involverer onkolytiske RNA-virus for å målrette den defekte medfødte immunsystemet i kreftceller blir utforsket. Vi har funnet at følsomheten til onkolytisk VSV ble sterkt og signifikant assosiert med ødeleggelse av IFN signalveien. En unnlatelse av å opp-regulere ISG uttrykk på dsRNA stimulering viste en svekket antiviral respons sensibiliserende lungekreftcellelinjer til VSV-indusert onkolytiske celledød. Men ikke alle lungekreftceller kan bli drept av VSV infeksjon, som noen av dem har en relativt normal medfødt immunitet sti og derfor er motstandsdyktig mot VSV-mediert viral drapet. Bisulfite sekvensering avslørt promoter hypermethylation av enten
IRF7 Hotell og /eller
IRF5
i flere lungekreftcellelinjer. Tilsvarende når vi undersøkt DNA fra Dypfryst lungekreft vev, observerte vi promoter metylering av
IRF7 Hotell og /eller
IRF5
, noe som tyder på at deres IFN antiviral respons ble også epigenetiske stille da funksjonell IRF7 og IRF5 er nødvendig for en intakt IFN svei. Men 5-aza-dC behandling klarte å reaktivere IRF5 eller IRF7 uttrykk eller redningslungekreftceller fra VSV infeksjon. Endre medfødt immunitet ved å manipulere IRF uttrykk endret viral følsomhet normal Beas2B bronkial epitelceller eller lungekreft celler. Celler uten en funksjonell IFN svar er delvis beskyttet mot virus følgende IRF5 og IRF7 overekspresjon, mens avbrudd av IFN signalering ved å målrette IRF5 og IRF7 hjelp sirnas økt Beas2B cellenes sårbarhet for cytolytiske effekten av VSV. Derfor IRF5 og IRF7 er svingbare faktorer i IFN bane som bestemmer den virale følsomhet av cellene til onkolytiske virus. Den svært selektive VSV drap av lungekreftceller med nedsatt IFN vei på grunn av epigenetiske nedregulering av IRFs indikerer at disse genene er ideelle biomarkører for å bestemme i hvilken grad svulster å onkolytiske viral terapi.
Resultater
IFN signaliserer mangel er forbundet med VSV følsomhet
IFN pathway styrer cellulære svar på virusinfeksjon og dsRNA. Celler som har en fullt funksjonell medfødt antivirale systemet er i stand til å beskytte seg mot virus, hovedsakelig på grunn av induksjon av IFN signalkaskade. Vi har vist at IFN-reaksjonsveien ble epigenetiske inaktivert i fibroblaster fra AKU pasienter etter spontan immortalisering [14]. Undersøkelse av medfødt immunitet status i normal bronkial epitelcellelinje Beas2B, etter sine
ras forvandlet avledede celler og 2 tumorigene kloner avdekket at så IFN signaliserer aktivitet redusert følsomhet for VSV drapet økte i løpet lunge tumorigenesis (Li og Tainsky, upublisert data). Fordi funksjonell inaktivering av IFN veien har vært et fellestrekk for mange kreftformer, brukte vi 7 langsiktige lungekreft cellelinjer (4 adenokarsinomer: CRL5800, CRL5807, CRL5810 og CRL5872, 2 plateepitel karsinom: HTB172 og CRL5928 og en liten cellekreft: CRL5869) for å studere endringer i deres medfødte immunsystemet.
ved hjelp av en representant sett ISGs i Q-RT-PCR-analyser, vi undersøkte både baseline ISG uttrykk nivåer og deres uttrykk etter stimulering av IFN veien ved syntetisk dsRNA polyI: C, som etterligner viral RNA [15]. Vi har funnet nedre referanse ekspresjon av et ISGs testet for alle lungecancercellelinjer sammenlignet med Beas2B-celler (tabell 1). IFN veien kan bli aktivert i celler som Beas2B 12 ut av 14 gener som var induserbar med polyI: C stimulering. I kontrast, polyI: C klarte å indusere mRNA av alle 14 gener testet i CRL5810 celler, mens induksjons mangler av essensielle antivirale responsgener variable som
IFNα
,
IFNβ
,
IRF7
,
IRF5 Hotell og
STAT1
ble påvist i CRL5800, CRL5807, CRL5872 og CRL5869 celler. Overraskende, Q-RT-PCR demonstrert polyI:. C induserbar ekspresjon av 10 av 14 ISGs i HTB182 og CRL5928 celler ved samme nivåene Beas2B indikerer en forholdsvis normal antiviral respons i de to lungekreftceller (tabell 2)
Fordi svekket medfødte immunsignale ofte fører til økt følsomhet for viral slakting ble VSV følsomhet undersøkt for å fastslå om den manglende ISG aktivering tilsvarer forhøyet sårbarhet til onkolytisk viral dreping i lungekreftceller. Som forventet, Beas2B celler med intakt IFN respons motsto VSV infeksjon viser liten endring i celle levedyktighet. I tillegg HTB182 og CRL5928 var forholdsvis motstandsdyktig i forhold til andre lungekreftceller som mer enn 60% av cellene var fremdeles i live ved høye doser VSV (MOI5) selv uten eksogent IFNα forbehandling (figur 1A). I motsetning til resten av lungekreft cellelinjer løst mistet sin evne til å beskytte seg mot VSV. Et økende antall av IFN-signale-manglende lungekreftceller (fra ~ 30% til ~70%) ble drept ved å øke dosen av VSV eksponering og tilsette IFNα til mediet ikke klarte å inhibere cytotoksisitet av høy dose VSV (MOI5) i CRL5800, CRL5810 CRL5869 og celler (figur 1A). Interessant, reduserte basale nivåer av de fleste ISGs i alle lungekreftcellelinjer foreslått noen sammenheng mellom VSV mottakelighet og basal ISG nivåer (tabell 1). Den variable følsomhet for viral dreping samsvarer med differensial opphør av IFN responsen i lungekreft cellelinjer. De selektive virolytic effektene av VSV var mest betydningsfulle i CRL5810 celler i samsvar med de mest alvorlige mangler i deres medfødte anti-virus system (Tabell 2 og Figur 1a). Vi identifiserte også 5 ISGs (
IRF5
,
IRF7
,
STAT1
,
IRF3 Hotell og
IFI16
), som uttrykk var karakteristisk forhøyet tre ganger i respons til poly i: C-behandling bare i VSV-resistente cellelinjer (tabell 2 og figur 1A). Western blot-analyse bekreftet at den forhøyede ISG mRNA-ekspresjon ved polyI: C induksjon resulterte i oppregulert proteinnivåer i VSV-resistente celler. Ser727 fosforylering av STAT1 bare kan induseres ved IFNβ men ikke ved IFNα [24], og ble benyttet som en spesifikk markør for tidlig reaksjon genaktivering av IFN veien. En sterk polyI: C-induksjon av fosforylert-STAT1 (p-STAT1, Ser727), STAT1, IRF5 og IRF7 proteinnivåene var i overensstemmelse med den motstand av normale Beas2B celler, og de to kreftceller, HTB182 og CRL5928, til VSV infeksjon og vice versa for viral følsomme lungekreft cellelinjen. Mild Ser727 fosforylering av STAT1 kan påvises i CRL5807 celler som indikerer relativt normal tidlig IFN signalisering i denne cellelinje sammenlignet med andre VSV-sensitive cellelinjer. IRF5 og IRF7 proteinnivåer var jevnt ikke induserbar på polyI: C behandling i alle virus-sensitive lungekreft cellelinjer (figur 1B). Ingen signifikant endring i IRF3 protein ble observert av polyI: C behandling blant alle lungekreftceller kanskje fordi dets aktivitet er i hovedsak regulert post-translasjonelt ved forandringer i fosforylering (data ikke vist). Derfor våre observasjoner støttet invers assosiasjon mellom onkolytiske følsomhet for VSV og induserbarheten av IFN-signalering i normale bronkial epitelceller Beas2B og lungekreft celler.
A. Selektiv cytotoksisitet av VSV i lungekreft celler med defekt IFN veien. Beas2B og 7 lungecancercellelinjer ble evaluert for deres evne til å indusere antiviral respons på VSV infeksjon med eller uten IFNα forbehandling av viruset-indusert cytopathicity ved hjelp av MTT-analyse. Verdiene ble normalisert til en verdi av kontroll-ikke-infiserte celler, som ble satt til 100% fra minst to uavhengige eksperimenter (
n
= 3) med SD AT 10%. (-): Ingen VSV infeksjonskontroll. MOI0.05: multiplisitet av infeksjon 0,05, lav dose av VSV infeksjon. MOI5: multiplisitet av infeksjon fem, høy dose av VSV infeksjon. B. protein uttrykk nivåer av flere ISGs i polyI: C behandlet Beas2B og lungekreft celler ble sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av vestlige blotter. Brett endringer av IRF5 og IRF7 uttrykk etter polyI: C behandling ble angitt. Tubulin ble brukt som en normalisering kontroll.
epigenetisk stanse av kritiske transkripsjonsfaktorer
IRF7 Hotell og
IRF5
resultater i oppheving av IFN pathway
Arrangøren hypermethylation er en epigenetisk mekanisme av genregule kjent til taushet genuttrykk i mekanismer for celle skjebne besluttsomhet og kreftutvikling. Vi har tidligere rapportert at IFN veien har blitt opphevet ved epigenetisk stanse av en nøkkel antivirale forsvar mekler IRF7 i udøde AKU fibroblaster [14], [15]. Interessant, en annen studie fant sigarettrøyk eksponering førte til undertrykkelse av IFN signalering på grunn av
IRF7
promoter hypermethylation, noe som resulterte i redusert antivirale forsvar av respiratorisk epitel [25]. Derfor undersøkte vi om arrangøren metylering av
IRF7
kan også være årsaken til IFN pathway avbrudd i lunge kreft cellelinjer. DNA-sekvensering av natriumbisulfitt behandlet genomisk DNA avslørte
IRF7
promoter hypermethylation i to lunge kreft cellelinjer (CRL5810 og CRL5869), noe som antyder at epigenetisk stanse av
IRF7
har spilt en rolle i avbrudd av IFN signalering i disse cellelinjer (figur 2A). Siden IRF5 induserte en sterkere transkripsjon profil av de tidlige antivirale gener [23] og har nylig blitt identifisert som en roman metylering markør for kreft [21], [22], vi videre undersøkt metylering status for
IRF5
promoter regioner i lungekreftceller. Økende
IRF5
hypermethylation ble funnet i CRL5800, CRL5807, CRL5872 og CRL5810 cellelinjer (figur 2B), og dermed lignende virus mottakelighet for
IRF7
-unmethylated CRL5800, CRL5807, CRL5872 celler var konsekvensen av epigenetisk
IRF5
inaktivering. Videre arrangøren hypermethylation av både
IRF7 Hotell og
IRF5
forklarte den høyeste følsomhet for VSV manifestert av CRL5810 celler. I motsetning til promoter-regioner av verken
IRF7
heller
IRF5
ble funnet å være metylert i Beas2B, CRL5928 og HTB182-cellelinjer i samsvar med deres intakt medfødt immunitet og motstand mot onkolytisk viral dreping. Helt den selektive tap av viral beskyttelse i lungecancerceller var relatert til epigenetisk inaktivering av minst en av de IRFs implicating nødvendigheten av både IRF7 og IRF5 å være aktiv for en funksjonell IFN bane.
metylering av status CpG øyer i
IRF7 Hotell og
IRF5
promoter regioner i Beas2B, humane lungekreftcellelinjer og primære vev ble undersøkt ved sekvensering av bisulfit behandlet genomisk DNA. A. IRF7. B. IRF5. Lukkede sirkler, metylert C i CpG dinukleotider; åpne sirkler, unmethylated C i CpG dinukleotider. TSS, transkripsjon start stedet.
Fordi epigenetiske hendelser kan forekomme ved langtids kultur, som ikke var til stede i den opprinnelige kreft, undersøkte vi IRF-promoter metylering mønstre i fersk-frosne primær lungekreft vev .
IRF7
arrangøren var fullt metylert i 6 av 20 NSCLCs, mens 5 andre svulster hadde 5′-delvis metylering (figur 2B) som en innledende hendelse som kan spre seg til nærliggende CpG områder [26]. Parallelt har vi funnet tung metylering i 4 av 20 NSCLC prøver og 11 andre hadde delvis metylering av
IRF5
promoter regioner. Totalt 15 av 20 pasientprøver hadde arrangøren metylering av enten en eller begge IRFs, til hendelser tilstrekkelig dempe sin IFN respons. Ingen avvikende
IRF7
eller
IRF5
hypermethylation ble oppdaget i de matchende buffy coat DNA fra de samme pasientene som indikerer at IRF arrangøren hypermethylation ikke hadde resultert fra bakterie linjer epigenetiske forandringer. Derfor metylering
IRF7
eller
IRF5
arrangører funnet i lungekreft cellelinjer sannsynligvis hadde sin opprinnelse i svulsten snarere enn å være et arrangement valgt under til cellekultur. Våre resultater viste at økt mottakelighet for viral infeksjon er mediert av epigenetiske mekanismer ned-regulerer viktige antivirale forsvar pathway regulatorer IRF5 og IRF7. Forekomsten av epigenetisk stanse av IRFs og sin tette tilknytning til VSV følsomhet gjør dem ideelle theranostic biomarkører for å skjerme lungekreftpasienter for mulig onkolytiske viral terapi.
Manipulering av IFN signalveien målretting IRFs endrer VSV viral følsomhet
Vi har tidligere vist at 5-aza-dC demetylering behandling kan gjenopprette genuttrykk av epigenetiske forstummet
IRF7 Hotell og annen ISGs dermed reaktivere IFN signalveien i udøde AKU fibroblast cellelinjer [14], [15] . Til vår overraskelse, forble IRF7 og IRF5 ekspresjonsnivåene fraværende (figur 3A, mindre enn 1,5 ganger økning for både IRF5 og IRF7) i lungekreft cellelinjen CRL5810 etter 5-aza-dC behandling så lenge som fire uker. Bemerkelsesverdig, sekvensering av sulfitt-behandlet DNA på
IRF5 Hotell og
IRF7
promoter regioner viste at langvarig 5-aza-dC søknad var ikke i stand til å reversere arrangøren hypermethylation av IRFs i CRL5810 celler (data ikke vist). Lik motstand mot 5-aza-dC behandling ble funnet med andre IRF7-metylerte lungekreft cellelinjen CRL5869 (data ikke vist). Som et resultat av forlenget demetylering behandling med 5aza-dC var ute av stand til å påvirke den VSV-følsomheten CRL5810 celler (figur 3B) og ytterligere indikerer at IRF5 og IRF7 er to av de fundamentale faktorer i IFN-signalering som kan regulere onkolytisk virale følsomhet.
A. Western blot viste ingen økning på IRF7 eller IRF5 protein uttrykk etter 5-aza-dC behandling av CRL5810 celler. Brett forandringer av IRF5 og IRF7 ekspresjon ble angitt på toppen av 5-aza-dC behandlet kolonne. B. CRL5810 celler var fortsatt følsomme for VSV cytolyic effekter etter 5-aza-dC behandling.
Ingen av disse to IRF transkripsjonsfaktorer var i stand til å bli indusert i VSV-sensitive lungekreftceller (tabell 2 og figur 1B), mens overekspresjon av IRF5 og /eller IRF7 i udøde AKU fibroblaster oppregulert annen ISGs, manifestert en raskere og sterkere medfødte immunsignale på dsRNA stimulering, som er tilstrekkelig til å indusere senescens [15]. For å gjenopplive den deaktiverte IFN respons i lungekreftceller, ble IRF5 og IRF7 alene eller i kombinasjon stabilt transfektert inn i CRL5810 celler, hvori vedvarende 5-aza-dC behandling ikke hadde noen effekt på demetylering av IRF-promoteren. Western blot analyse bekreftet forhøyet basal protein uttrykk for IRFs i IRF5 og IRF7 overekspresjon celler (figur 4A). Individuell restaurering av IRF-ekspresjon delvis beskyttet CRL5810 celler fra cytolyse VSV med den største økningen av cellelevedyktighet fra -50% til mer enn 85% ved MOI0.05, og fra ~ 30% til -50% ved MOI5 av VSV infeksjon i celler som overuttrykker både IRF5 og IRF7 forhold til vektorkontrollceller (figur 4B). Vi forklarte beskjeden gevinst for viral beskyttelse også etter IRF5 og IRF7 kombinert transfeksjon av alvorlig tap av andre viktige ISGs i CRL5810 celler som indikert ved mangel på virkning på eksogent IFN.
A. Protein uttrykk nivåer av STAT1, IRF5 og IRF7 ble analysert ved western blot i IRF stabilt transfektert CRL5810 celler. Anti-flag-antistoff ble brukt for å påvise Transfekterte IRF proteinnivåer, mens IRF5- og IRF7-spesifikke antistoffer ble anvendt for total IRF-proteinekspresjon. B. Overekspresjon av IRF5 og /eller IRF7 delvis økte CRL5810 cellenes resistens mot VSV infeksjon med de mest økningen i den kombinerte trasfection. * P 0,02, ** p. 0,001
Den selektive replikering av VSV i svulster med kompromittert IFN pathway er hjørnesteinen for klinisk anvendelse som onkolytiske viral terapi. Men ikke alle lungekreft pasientenes kreft er mangelfull i sin medfødte immun vei. For å overvinne denne hindringen og ødelegge disse VSV-resistente celler, ble sirnas å IRF5 (siIRF5) og IRF7 (siIRF7) brukes til å undertrykke IFN respons i celler med aktiv IFN veien. Sammenlignet med Beas2B celler transfektert med kontroll egge siRNA, celler transfektert med siIRF5 eller siIRF7 resulterte i en reduksjon i IRF5 og IRF7 induksjon etter polyI: C behandling, mens transfeksjon av både siIRF5 + siIRF7 fullstendig eliminert IRF-aktivering (figur 5A). Transfeksjon av siIRF5 alene signifikant hemmet polyI: C-aktivering av både IRF5 og IRF7, noe som kan forklares ved en vesentlig rolle for IRF5 som en sterk induktor av IFNβ [23]. Redusert IRF5 uttrykk ved siIRF5 resulterte i mye mindre IFNβ produksjon fører til redusert stimulering av sekundær respons genet IRF7. Som forventet, undertrykkelse av disse 2 gener ved sirnas resulterte i signifikant tap av beskyttelse mot VSV infeksjon med de mest cytotoksisitet øker til nesten 40% ved høyere dose VSV eksponering i kombinasjons knock-out sammenlignet med kontroll siRNA (figur 5B). ble observert lignende funn i parallelle transfeksjon studier av VSV-resistente CRL5928 celler, som har relativt intakt IFN signale (data ikke vist). Dette viser klart at IRF5 og IRF7 er funksjonelt essensielt for medfødt immunitet som bestemmer den virale følsomhet av disse cellene.
A. Oppheving av IRF5 og /eller IRF7 induksjon sirnas ved polyI: C treatmentwas vist av western blot. Brett endringer av IRF5 og IRF7 uttrykk etter polyI: C behandling ble angitt. Si (-): kontroll siRNA. B. IRF5 og IRF7 er viktige faktorer som bestemmer viral sensitivitet av cellene. Inhibering av disse 2-gener førte til tap av beskyttelse mot VSV infeksjon med de mest cytotoksisitet økningen i kombinasjon knockdown. * P 0,03, ** p. 0,001
I sammendraget, er nødvendig og tilstrekkelig for økt følsomhet for drap etter onkolytiske virus tap av IFN signalering. Manipulering av IFN vei gjennom transkripsjonsfaktorene IRF5 og IRF7 forandret cellenes respons på VSV infeksjon. Analyse av IFN veien ved hjelp av disse IRF metylering biomarkører kan gi nye theranostic biomarkører for å bestemme en pasients følsomhet for onkolytiske virus.
Diskusjoner
En funksjonell medfødte immunantiviral system beskytter celler mot virusinfeksjon, hovedsakelig på grunn av induksjon av IFN egen signalkaskade, som synes å være grunnlaget for virus motstand og immunstimulerende egenskaper. Her har vi vist en sterk og overbevisende omvendt forhold mellom effektiv iboende antiviral respons og onkolytisk virale følsomhet ved hjelp av lungekreft cellelinjer. Videre transkripsjon faktorer IRF5 og IRF7 ble identifisert som kritiske regulatorer av medfødte immunsystemet og nyttige biomarkører for onkolytiske virus mottakelighet lungekreftceller som begge må være induserbar for en funksjonell IFN sti. Inaktivering av enten IRF5 eller IRF7 svekket antiviral respons med den mest betydelige tap når begge IRFs ble epigenetiske stilnet i CRL5810 celler. Den varierende grad av cytolytisk død var knyttet til differensialalvorlighetsgraden av IFN-spredningsveier defekter. Til tross for tilstedeværelsen av eksogent IFNα, CRL5810 cellene er ikke-responsive og være utsatt for VSV drepe svarende til den fullstendige avbrytelse av IFN veien aktivitet.
Tap av svulsthemmer-gen-ekspresjon ved avvikende promotor metylering er et tidlig og felles epigenetisk hendelse i løpet av utbruddet og progresjon av kreft [27]. Vi har vist epigenetisk stanse av
IRF5 Hotell og
IRF7
CpG øyene promoter regioner i lungekreft. Farmakologisk målretting av avvikende epigenetiske endringer ved demetylering agenter har vist klinisk effekt i flere hematologisk kreftsykdom [28]. Imidlertid kan de metylering hemmere ikke hindre gjentakelse av hypermethylation og vi har presentert bevis for at epigenetisk deregulering ikke kan være fullt tilbakestilt om en serie av lungekreftcellelinjer. Svikt i demetylering midler for å gjenopprette avgjørende ISG uttrykk indikerer at disse lungekreftceller er ideelle mål for onkolytiske viral terapi.
Selv om basale nivåer av de fleste ISGs ble redusert i alle lungekreftcellelinjer i forhold til normal bronkial epitelial celler, er onkolytiske viral følsomhet bare forbundet med polyI: C-induserbar uttrykk nivåer av visse viktige ISGs som IRF7 og IRF5. Imidlertid IRF5 og IRF7 overekspresjon er ikke tilstrekkelig til fullstendig å gjenopprette IFN bane og bare delvis reddet fra cellene viral infeksjon på grunn av mangel av andre viktige ISGs. Unnlatelse av å indusere Ser727 fosforylering på polyI: C behandling foreslått ytterligere medfødt immunitet defekter i flere VSV sensitive cellelinjer (Figur 1b). I tillegg er mRNA fra 3 andre ISGs (STAT1, IRF3 og IFI16, tabell 2) gjennomgående induseres i VSV-resistente celler. Videre studier er nødvendig for å bekrefte dem som theranostic biomarkører og kan identifisere ytterligere ISGs som biomarkører i lungekreft hvis aktiveringen kan skille virus-resistente virussensitive kreftformer.
Vi presenterte bevis for at funksjonell inaktivering av IRF5 og IRF7 er hovedmekanismen for å forstyrre IFN signalering i lungekreftceller. Likevel forskjellige maligniteter båtplass ulike molekylære defekter av denne veien. Deregulerte JAK3 og RNase L trasé i LNCaP prostatakreftceller [29], defekt STAT1 og STAT2 aktivering i fibrosarkom og melanomceller [30], [31] og nedregulert IFNAR i høy klasse blærekreft [32] har alle blitt rapportert til deaktivere det medfødte immunsignalering. Totalt sett er IFN sti ofte nedregulert i løpet tumorigenesis selv om forskjellige sett med ISGs blir undertrykt av ulike mekanismer i en kreft-type-spesifikk måte.
En unnlatelse av å aktivere medfødt immunitet svar på onkolytiske RNA-virus infeksjon fører til den svært selektive clearance av IFN-nonresponsive tumorceller. I tillegg til VSV, andre RNA-virus slik som NDV [33] og influensavirus [34] har også blitt vist å ha tumor-selektive cytotoksisitet ved bruk av samme mekanisme for å målrette celler med nedsatt IFN-aktivitet. Kliniske studier av intravenøs administrasjon av NDV (PV701) viste sin innledende onkolytiske effekter i flere solide tumorer [35]. I tillegg stammer VSV med M-proteinet mutasjoner (AV1 og AV2) utløses mer robust antiviral respons på grunn av deres defekter i evnen til avslutnings IFN signalering; disse mutanter selektivt ødelagt i IFN-responsive celler ved en lavere terapeutisk dose mens resterende høyt lytisk i kreftceller [9]. Ekspresjon av immunstimulerende proteiner, slik som interleukin-2 (IL-4) eller IFNβ i genetisk modifiserte VSV har også blitt generert for å fremme virale cytolytiske respons [5], [6]. Derfor vil forsterke antivirale responser i normale celler forbedre onkolytisk selektivitet i IFN-nonresponsive tumorer.
Selv om en redusert antiviral respons kan være et vanlig trekk ved en rekke kreftformer, den onkolytisk effekten av naturlig forekommende RNA virus kan fortsatt være relativt lav, slik noen svulster manifest robuste medfødt immunitet svar som hemmer virusreplikasjon og spredning.
