Abstract
Det er stort behov for å identifisere nye prostata kreft narkotika mål fordi dagens hormon terapi til slutt mislykkes, fører til en multiresistent og dødelig sykdom kalt kastrering resistent prostatakreft. Å funksjonelt identifisere gener som, når forstummet, redusere prostatakreft celleproliferasjon eller induserer celledød i kombinasjon med antiandrogener, ansatt vi en RNA-interferens-baserte kort hårnål RNA strekkode skjermen i LNCaP menneskelige prostata kreft celler. Vi identifiserte og validert fire kandidatgener (
akt1
,
PSMC1
,
STRADA
, og
TTK
) som svekket vekst når forstummet i androgen reseptor positiv prostata kreftceller og forbedret antiproliferative virkningene av anti-androgener. Hemming av AKT med en farmakologisk hemmer også indusert apoptose når det kombineres med antiandrogener, i samsvar med nyere bevis for PI3K og AR sti crosstalk i prostatakreftceller. Gjenoppretting av hårnåler rettet mot en kjent prostatakreft pathway validerer nytten av shRNA bibliotek screening i prostata kreft som en bred strategi for å identifisere nye kandidat narkotika mål
Citation. Dahlman KB, Parker JS, Shamu T, Hieronymus H, Chapinski C, Carver B, et al. (2012) modulatorer av prostatakreft celleproliferasjon og levedyktighet Identifisert av Short-hårnål RNA bibliotek Screening. PLoS ONE 7 (4): e34414. doi: 10,1371 /journal.pone.0034414
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 20 september 2011; Godkjent: 27 februar 2012; Publisert: 11 april 2012
Copyright: © 2012 Dahlman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av AACR-Amgen, Inc. Fellowship i klinisk og translasjonell forskning (KBD); Prostate Cancer Foundation (www.pcf.org) (BSC); Howard Hughes Medical Institute (www.hhmi.org) (CLS); National Cancer Institute (www.cancer.gov) (CLS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. CLS er en av oppfinnerne av MDV3100 og eier aksjer i Medivation. KBD ble støttet av AACR-Amgen, Inc. mens dette arbeidet ble utført. JSP er ansatt i Expression Analysis. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De øvrige forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til død av kreft i amerikanske menn med anslagsvis 217,730 nye tilfeller og mer enn 32.000 dødsfall sykdommen i 2010 [1]. Mens de fleste tidlig stadium lokalisert sykdom kan bli behandlet ved strålebehandling og /eller kirurgi, men som presenterer med sent stadium metastatisk kreft har en median overlevelse på 3-7 år [2]. Videre vil så mange som 50% av pasientene som ble behandlet med lokalisert sykdom har lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser [2].
Dagens behandling for residiverende eller metastatisk sykdom inkluderer rettet mot androgen reseptor (AR) signaliserer gjennom bruk av antiandrogener , slik som bikalutamid, og midler som forhindrer produksjonen av androgener i testiklene og binyrene, slik som gonadotropin-frigjørende hormonagonister og ketokonazol [3]. Selv om disse aktuelle hormon terapi har innledende effekter for å redusere tumorbyrden, mange menn blir resistent mot disse terapi og utvikle kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Menn med CpRC har en dårlig prognose og står for det meste av dødsfall fra sykdommen.
Menn med CpRC ofte viser en økning i tumor androgen reseptor (AR) nivåer [4]. AR er et 110 kDa nukleær hormonreseptor som, i respons til androgener, aktiverer transkripsjon av mål-gener som er involvert i celle-proliferasjon, differensiering og overlevelse. I prostata luminal epitel, AR regulerer differensiering og spredning, og AR i prostata kreft celler fremmer cellecyklusprogresjonen [5]. Tidligere arbeid i vårt laboratorium viser at denne økte AR nivået er nødvendig og tilstrekkelig for progresjon av prostata kreft til CRPC og dens funksjon er viktig for å opprettholde tumorvekst [6]. I tillegg til CRPC,
AR
blir uttrykt i nesten alle prostatakreft og er nødvendig for tumor vedlikehold [4], [7], [8]. Samlet utgjør disse data tyder på at AR signale spiller en avgjørende rolle i hormon-sensitive og CRPC og er fortsatt et viktig mål for prostata kreftbehandling.
Identifisering av nye måter å behandle prostatakreft er et område med intens terapeutisk utvikling . Nylig abirateronacetat ble godkjent basert på en betydelig overlevelsesgevinst hos pasienter med CRPC, og de nye antiandrogener, MDV3100 og ARN-509, har blitt introdusert med lovende resultater; men de fleste tumorer ervervet resistens mot disse terapeutika [9] – [13]. Til dags dato blant kjemoterapeutika bare taxaner docetaxel og cabazitaxel har vist seg å forbedre total overlevelse hos pasienter med CRPC [14] – [16]. Som et resultat av mangel på midler som opprett prostatakreft regresjon, nye prostata kreft terapeutiske mål garanterer videre etterforskning.
For å avdekke potensielle prostatakreft terapeutiske mål, vi utført en objektiv multiplex shRNA skjerm som identifiserte modulatorer av prostatakreft celleviabilitet i nærvær av bikalutamid. Fire genene ble validert for å forsterke de antiproliferative virkningene av anti-androgener i en prostatakreft-cellelinje når stilnet. Disse dataene gir en generell strategi for å identifisere prostata kreft narkotika mål.
Resultater
shRNA multiplex skjermen for å identifisere modulatorer av bikalutamid følsomhet
For å identifisere gener som, når forstummet , redusere celleviabilitet alene eller i kombinasjon med anti-androgen, bikalutamid, benyttet vi en multiplex RNA interferens-baserte shRNA skjermen ved hjelp av en tidligere validert bibliotek (figur 1A). Denne teknologien benytter entydig strekkodet shRNAs, uttrykt fra en retroviral vektor, hvis mengde etter celle manipulering kan identifiseres ved microarray [17]. Biblioteket var sammensatt av ~6,000 shRNAs målrettet mot kinaser, gener som er involvert i cellesyklusregulering, og andre gener som er kjent å være involvert i kreft [17]. Analyse av ekspresjon av data fra 147 prostata tumorprøver [18] viste at 97% av genene målrettet av shRNAs i biblioteket blir detektert i minst 50% av tumorene. Vi utnyttet androgen reseptor (AR) -positivt LNCaP cellelinje for skjermen fordi de gjennomgår vekst arrest når de behandles med AR antagonist bikalutamid, vokser relativt raskt, og er lett infisert med retrovirus (figur S1). AR-negative PC3 menneskelige prostata kreft celler fungerte som en negativ kontroll av antiandrogen følsomhet (Figur S1). Sammenheng mellom biologiske replikere eksperimenter i hver celle linjen var høy og ikke endre på senere tidspunkter eller med bikalutamid behandling (tabell S1).
(A) Skjematisk av shRNA skjermen. Detaljer finner du i Materialer og metoder. (B) En heatmap ble generert ved gruppering basert på sonder som er utarmet eller anriket (log2 bicalutamid /kjøretøy ≤ +/- 0,58 og en p-value≤0.01) i bikalutamid (0,4 uM og 1,0 uM) -behandlet LNCaP-celler hos T = 1 og t = 2 i forhold til kjøretøy-behandlede celler på de samme tidspunktene. Den shRNA målgenet tilknyttet hver sonde er indikert til høyre på heatmap. Målgener som vises mer enn én gang på heatmap viser at mer enn en sonde scoret for at genet.
Mikromatrise-analyser viste at 23 sonder, assosiert med 15 gener, var unikt utarmet i bikalutamid behandlet LNCaP-celler, sammenlignet med bærer-behandlede celler (log2 bicalutamid /kjøretøy ≤-0,58, p≤0.01) (figur 1 B, tabell 1, og fig S2). Ingen forskjeller i utarmet prober ble observert i høy og lav bikalutamid doser eller tidlige og sene tidspunkter (dag 8 og dag 21); derfor dataene ble samlet for analysene. Av de 15 genene identifisert, 11 var kinaser (
TTK
,
MAST3
,
CIT
,
PRKACG
,
IGF1R
,
TSSK2
,
VEGFβ
,
MAPKAPK5
,
ABL2
,
PLK2
, og
akt1
) kjent å ha funksjoner i cellesyklusregulering eller celle-levedyktighet (tabell 1). Den høye frekvensen av utvinne kinase treff kan være relevant for biologien til prostatakreftceller, men også sannsynlig reflekterer en skjevhet i utvalget av gener for shRNA biblioteket. De resterende 4 genet treff har ulike funksjoner: calmodulin binding (
STRN3
), GTPase aktivering (
RABGAP1
), kinase adaptere (
STRADA
), eller involvert i proteasome (
PSMC1
). En parallell skjermen ble også utført i androgen-uavhengig cellelinje, PC3, og, spesielt, ingen av probene utarmet i LNCaP-celler ble tømt i PC3-celler i nærvær av bikalutamid å bruke samme cut-off, gir bevis for spesifisiteten i antiandrogen sensitive celler (tabell S2).
Validering av kandidatgener
for ytterligere å undersøke disse 15 kandidat gener, vi ansatt uavhengig knockdown teknologi (siRNA transfeksjon hjelp sirnas rettet mot sekvenser forskjellige fra dem brukes i shRNA skjermen) på en andre AR avhengige cellelinje (VCap), som har vist seg å være resistente mot bikalutamid, men følsomme for den andre generasjon antiandrogen MDV3100 [19]. Stanse av genene ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 2B). Som en positiv kontroll ble VCap-celler transfektert med AR sirnas og, som forventet, stanse av AR redusert cellelevedyktighet (figur 2A). Stanse av
akt1
,
STRADA
,
PSMC1
, og
TTK
forbedret veksthemmende virkning av MDV3100 i Vcap celler (figur 2A, venstre panel ), i samsvar med effektene observert med bikalutamid i den opprinnelige skjermen i LNCaP-celler. Interessant, tie
akt1 Hotell og
PSMC1
i Vcap celler også redusert celle levedyktighet i fravær av antiandrogen (figur 2A, venstre panel).
Kandidat målgener fra LNCaP skjerm sonder som ble oppbrukt i nærvær av bikalutamid ble selektivt målrettet hjelp sirnas. (A, venstre panel), ble VCap-celler transfektert med sirnas at scores i LNCaP medikament skjermen og ble inkubert med 1 uM MDV3100 eller kjøretøy, og antallet levedyktige celler ble målt 6 dager etter behandling. (A, høyre panel), VCap-celler ble transfektert og behandlet som i (A, venstre panel), bortsett fra Caspase 3/7 aktivitet ble målt etter 3 dagers behandling.
PLK1
siRNA transfeksjon ble anvendt som en positiv kontroll. Stiplede linjene indikerer nivået av veksthemming eller apoptose indusert av MDV3100, for sammenligning. NT, ikke-måls siRNA. (B) Gene stanse (10-50%) ble bekreftet ved RT-qPCR 6 dager etter transfeksjon av Vcap celler med siRNA SMARTpools. Reaksjonene ble gjort i tre eksemplarer og normalisert til RPL27 for hver cDNA og deretter normalisert til kjøretøy behandlet NT. Standardfeil av gjennomsnittet ble beregnet. Bic, bikalutamid.
Vi undersøkte deretter effekten av stanse
akt1
,
STRADA
,
PSMC1
, og
TTK
på apoptose, ved hjelp av
PLK1
sirnas som en positiv kontroll. Stanse av
AR
,
AKT
, og
i kombinasjon med MDV3100 behandling indusert Vcap celle apoptose i løpet av kontroll sirnas (NT) behandlet med MDV3100 panel STRADA plakater (figur 2A, rett ). Med unntak av AR, testet ingen av sirnas indusert apoptose i fravær av MDV3100 (figur 2A, høyre panel). Selv kneble av
TTK
i kombinasjon med MDV3100 ikke indusere apoptose over NT celler med MDV3100, gjorde kombinasjonen redusere antall levedyktige celler mer enn MDV3100 alene i NT celler (figur 2A, venstre panel). Til sammen
AKT
,
STRADA
, og
TTK
sirnas synergize med MDV3100 å redusere Vcap celle levedyktighet. Mens
akt1 Hotell og
STRADA
lyddemping reduserer celle levedyktighet, i hvert fall delvis, på grunn av økt apoptose når den kombineres med MDV3100,
TTK
synes å fungere gjennom en alternativ vekst hemmende mekanisme . Selv
PSMC1
ikke scorer i PC3 cellene i den innledende shRNA bibliotek skjermen, siRNA knockdown av
PSMC1
nedsatt levedyktighet PC3 celler, øke muligheten for at disse antiproliferative effekter kan ikke være spesifikke for AR-positive prostatakreftceller (Figur S3). Av denne grunn har vi ikke forfølge videre karakterisering av
PSMC1
.
Overuttrykte
TTK
er assosiert med økt sannsynlighet for biokjemisk tilbakefall
For å utforske enten
akt1
,
STRADA
, og
TTK
endres i human prostatakreft, vi vurderte kopiantall og uttrykk status av disse genene i en tidligere rapportert menneskelige prostata kreft datasett [18]. Av de 218 prostatakreft, hadde 34,4% redusert uttrykk for
STRADA
, 18,3% utstilt overekspresjon av
TTK
, 11,7% enten uttrykt eller hadde redusert uttrykk for
akt1
, og 15,6% av svulster overuttrykt eller hadde forsterket
AR plakater (tabell 2). Overekspresjon ble definert som z-score≥2 og redusert ekspresjon ble definert som z-poeng mindre enn 2, sammenlignet med ekspresjon i normale prostata prøver. I motsetning til
AR
,
STRADA
,
TTK
, og
akt1
viste lite bevis for genamplifisering eller tap i menneskelige prostatakreft. Det store antallet prostatakreft med endringer i
STRADA
,
TTK
, og
akt1
uttrykk ledet oss til å se på deres korrelasjon med biokjemisk tilbakefall. Interessant, overekspresjon av
TTK
oppviste en signifikant sammenheng med biokjemisk anfall (p = 0,003) (figur 3). TTK uttrykk var ikke signifikant korrelert med følgende kliniske kjennetegn:. Kirurgisk margin, lymfeknute status, sædvæske, Gleason score, behandling prostataspesifikt antigen (PSA), mener Ptil, eller extracapsular forlengelse (tabell S3)
Kaplan Meier plott av risikoen for biokjemisk tilbakefall hos pasienter (n = 131) med TTK overekspresjon prostatakreft (n = 20; grønn linje) kontra de uten TTK overekspresjon (n = 111; blå linje) svulster (p = 0,003, log rank test).
Blokkerings AKT samarbeider med bikalutamid å indusere LNCaP celle apoptose
for å undersøke den potensielle rolle disse genene som terapeutiske mål i prostatakreft videre, vi slått farmakologiske hemmere. Vi vurderte antallet levedyktige LNCaP-celler ved bruk av en akt1 /2-inhibitor, i nærvær og fravær av bikalutamid. Behandling med bicalutamid eller AKT-inhibitor redusert antall av levedyktige celler med 10% og 45%, respektivt (figur 4A). I motsetning til dette, ved å kombinere forbindelsene redusert celleproliferasjon med 100%, og induserte apoptose som vist ved en økning i PARP spalting (figur 4B). Disse dataene antyder at AKT kan være et terapeutisk mål for prostatakreft i kombinasjon med antiandrogen terapi, i tråd med nyere bevis hjelp PI3K hemmere [20].
(A) Antall levedyktige LNCaP celler behandlet over 5 dager med kjøretøy , bikalutamid (1 uM), akt1 /2 inhibitor (1 uM), eller en kombinasjon av bikalutamid og AKT-inhibitor. (B) Apoptose ble målt i LNCaP-celler ved immunblotting ved anvendelse av en PARP-antistoff i LNCaP-celler behandlet som i (A). Inhibering av fosforylert Akt (pakt (Ser473)) og fosforylert S6 (PS6) ble også målt. Actin ble brukt som en lasting kontroll.
Diskusjoner
Nåværende behandlingsformer for prostatakreft omfatter antiandrogener som bikalutamid og MDV3100. Selv om nesten alle pasienter har innledende reaksjoner på disse stoffene, mange svulster blir resistente mot disse terapi, noe som resulterer i CRPC. På grunn av den viktige rollen som AR spiller i grunnskolen prostatakreft og CRPC, AR fortsatt et relevant terapeutisk mål. Identifikasjon av nye tilnærmingsmåter for å behandle prostatakreft, inkludert utvikling av kombinasjonsterapier med anti-androgener, er et område av terapeutisk utvikling. Derfor henrettet vi en upartisk multiplex shRNA skjermen for å identifisere modulatorer av prostata kreft celle levedyktighet. Vårt mål var å identifisere gener som kan utnyttes for romanen målrettet terapi.
Fra shRNA skjermen og
in vitro
siRNA valideringsforsøk i en uavhengig cellelinje, vi identifisert og validert
akt1
,
STRADA
, og
TTK
som kandidat gener som synergize med antiandrogener (figur 1 og figur 2). Selv
akt1
,
STRADA
, og
TTK
scoret som hemmere av LNCaP celleproliferasjon i sammenheng med bikalutamid, validering med siRNAs i samme cellelinje avslørte at de kan reduksjon celleviabilitet i fravær av bikalutamid (figur S4A). Denne effekten var spesifikk for LNCaP og ble ikke observert i AR-negative PC3 celler. En forklaring på denne forskjell i fenotype er styrken av shRNA knockdown i skjermen versus siRNA i valideringsforsøk, ettersom sirnas vanligvis oppnå større knockdown enn shRNAs ved en MOI≤0.5. Faktisk, sirnas gjorde utviser en høy grad av genet Slå i valideringsforsøk (figur S4B).
Det vil være av interesse å forstå mekanismen som hemming av
akt1
,
STRADA
eller
TTK
forbedrer antiandrogen aktivitet. En mulighet er gjennom å regulere AR-avhengig transkripsjon, men vi klarte å observere en nedgang i mRNA nivåer av
AR
eller AR-målet gener (
TMPRSS2
,
FKBP5
,
NKX3.1
, eller
KLK3
) når disse genene ble helt stille på tribunen i LNCaP celler (data ikke vist). En annen mulighet er avbrudd i signalveien crosstalk, som illustrert ved siste bevis for gjensidig negative tilbakemeldinger som en forklaring på synergi observert med kombinert PI3K /AR sti hemming [20].
TTK, også kjent som mono spindel 1 (Mps1), er en serin /threonin og tyrosin-kinase som har vært implisert i opprettholdelsen av spindelenheten sjekkpunktet, og er nødvendig for riktig kromosom segregering under mitose [21], [22]. TTK er av spesiell interesse siden andre har rapportert at å redusere nivåene av
TTK
sensitive humane tumorceller til sub-dødelige doser av taxol, mens nontumorigenic celler ikke kunne sensibilisert for Taxol [23]. Her finner vi at det lyddemping
TTK
resulterte i sensibilisering av Vcap cellene til en potent antiandrogen. Det faktum at 18% av menneskelige prostata tumorer som over TTK og at disse svulstene har en annen klinisk resultat tyder på at TTK hemmere i kombinasjon med antiandrogener kan være av interesse.
STE20 relaterte kinase adapter alfa, eller STRADA, er en pseudokinase som er rapportert å være nødvendig for riktig aktivitet i tumor suppressor, lever kinase B1 (LKB1) [24].
STRADA
er nødvendig for funksjonen av LKB1 tumor suppressor; derfor stanse av
STRADA
kan forventes å fremme tumorigenesis. Våre funn at
STRADA
utstilt redusert uttrykk i en stor prosent av menneskelige prostata kreft er konsistent med en tumor suppressor rolle (tabell 2). Det er imidlertid mulig at STRADA har funksjoner uavhengig av LKB1 /AMPK signal som fremmer veksthemming i visse cellulære sammenhenger. Den potensielle rolle STRADA i prostata kreft progresjon og muligheten for LKB1 /AMPK uavhengige funksjoner garanterer ekstra oppmerksomhet.
akt1 er en serin-treonin kinase som releer signaler fra phosphatidylinositol 3 «kinase (PI3K) ved sin fosforylering av nedstrøms mål og deregulering av denne reaksjonsvei er kjent for å bidra til prostatakreft progresjon [25], [26]. Det er vel kjent at PI3K /Akt reaksjonsvei spiller en viktig rolle i sykdoms celleviabilitet og tumorgenese, og det blir for tiden studert som et terapeutisk mål [27], [28]. Tidligere rapporter har vist at AKT /PI3K sti regulerer LNCaP-cellevekst og ekspresjon av det konstitutivt aktiv AKT kan blokkere bikalutamid-indusert veksthemming [27], [29], [30]. Videre akt1 er vist å interagere med AR [31]. Tap av funksjon av fosfatase og tensin homolog (PTEN), en negativ regulator av PI3K /AKT vei, forekommer i minst 50% av avansert human prostatakreft [32] – [34]. Dette tap av funksjon PTEN resulterer i økt ekspresjon av fosforylert Akt og påfølgende aktivering av nedstrøms mål som er involvert i celleoverlevelse og proliferasjon [35], [36]. Hemming av AKT ved hjelp sirnas eller et farmakologisk inhibitor indusert apoptose i kombinasjon med bikalutamid eller MDV3100 i AR-avhengige prostatakreftceller (figur 2A, høyre panel og figur 4). Som et resultat av de rapporterte rollene til akt1 i prostata kreft tumorgenese, blir PI3K /AKT-reaksjonsveien blir nøye undersøkt som et terapeutisk mål [25]. Våre data støtter bruk av Akt hemmere i kombinasjon med antiandrogener til å behandle prostatakreft.
Materialer og metoder
Cell kultur og antiandrogens
Menneske prostata kreft cellelinjer (LNCaP, PC3, og VCap) og humane embryonale nyreceller (293T) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opprettholdt under 20 passasjer i laboratoriet. Celler ble dyrket i henhold til ATCC retningslinjer. Ingen unormaliteter ble observert i vekst eller morfologi for en hvilken som helst cellelinje under sine respektive vekstbetingelser. Bicalutamide ble kjøpt fra Astrazeneca Pharmaceuticals LP (Wilmington, DE) og MDV3100 ble syntetisert ved Memorial Sloan-Kettering Cancer Center ved organisk syntese Kjerne Facility [19].
Utarbeidelse av short-hårnål RNA bibliotek DNA og virus
Et plasmid bibliotek (pLMP) uttrykker ~6,000 kort hårnål RNA (shRNAs) rettet mot kinaser, gener som er involvert i cellesyklusregulering og andre gener som er kjent for å være involvert i kreft ble brukt i det aktuelle skjermbildet [17]. Den sammenslåtte plasmid-biblioteket ble amplifisert i TOP10 elektrokompetente celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) og plasmid-DNA ble isolert fra minst 1000 transformanter pr hårnål. Virus ble produsert i 293ft celler ved co-transfeksjon den pUMVC3-Gag-Pol uttrykk vektor (Addgene, Cambridge, MA), VSVG pantropisk konvolutt (Addgene), og shRNA biblioteket DNA isolert ovenfor.
shRNA interferens skjerm
shRNA interferens skjermen er avbildet i figur 1A. LNCaP og PC3-celler ble infisert med 6K shRNA sammenslått bibliotek virus (MOI≤0.5) i tre eksemplarer for å generere en total på 6 millioner infiserte celler per replikere, per cellelinje. Infeksjon av målceller ved MOI≤0.5 ble bekreftet ved fluorescens mikroskopi og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 48 timer etter infeksjon. LNCaP og PC3-celler ble valgt med 3 ug /ml puromycin, og cellene ble tellet og sådd ut i vekstmedia inneholdende 0,4 uM bikalutamid, 1,0 uM bikalutamid, eller bærer (DMSO). Celler ble passert, og bikalutamid og kjøretøy etterfylles, hver 4. dag uten at samløpet. LNCaP og PC3-celler fra hver replikat ble høstet og cellepelletene ble flash-frosset og lagret ved -80 ° C ved flere tidspunkter i løpet av skjermen. Cellene ble høstet 48 timer etter infeksjon (T = 0), og etter 8 dager (T = 1) og 21 dager (T = 2) med eksponering for kjøretøy eller bikalutamid.
Mikromatrise
genomisk DNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp av standardbetingelser. Strekkoder og halv hårnåler fra biblioteket plasmid DNA (opprinnelig ble brukt til å lage virus) og LNCaP og PC3 celle genomisk DNA isolert ovenfor ble PCR amplifisert ved å bruke de følgende primere: 5′-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3 «og 5′-AAAGCGCATGCTCCAGACTGCC-3» . PCR-produktene ble utsatt for gel-elektroforese, og de resulterende 350 bp bånd ble gel-renset ved anvendelse av QIAEX II-gel ekstraksjon kit (Qiagen, Valencia, CA) .Purified DNA-fragmenter (1,5 ug) fra LNCaP eller PC3-celler ble merket og microarray hybridisering var utføres ved hjelp av tilpassede Agilent chips som tidligere beskrevet [17].
Mikromatrise dataanalyse
Affymetrix exon array-data fra 147 tumorprøver [18] ble benyttet for å bestemme uttrykk nivåer av shRNA mål gener representert i biblioteket skjermen. Prober med bakgrunn justert normalisert intensitet større enn 50 ble ansett som oppdages.
Agilent Feature Extractor programmet ble brukt til å skanne microarray bilder. Feature Extractor normalisert Cy3 intensitet for hver gruppe ble utarbeidet og all videre behandling ble utført ved hjelp av statistiske programvarepakken R 2.8.1. Kvalitet ble vurdert gjennom ved hjelp av prinsipal komponent analyse og mer formelt ved å sammenligne det interkvartile området over arrays. Prøver med en log2 transformert indre kvartilområdet mindre enn seks ble betraktet som uteliggere og ikke vurdert i videre analyse. Når dobbeltprøver (tekniske replikater) forbli, ble den siste replikat av hvert brukt. De resterende prøvene var gjenstand for quantile normalisering. Prober som tilsvarer hårnåler ikke er tilstede i biblioteket ble anvendt som negative kontroller. 95-percentilen signalintensiteten av negative kontroller ble brukt som bakgrunn måle og ble anslått fra forhåndsvalg (T = 0) prøver. Prober ble fjernet fra videre analyse når de ikke oversteg prøven spesifikk bakgrunn anslag på et flertall av preseleksjon prøver. Statistiske tester ble utført for å identifisere hårnåler som har overflod variert over tid i ubehandlede prøver. Tidsforløpet Analysen gjennomføres i utvinning av differensiell genekspresjon (EDGE) programvare ble anvendt for denne analyse [37]. Å identifisere hårnåler hvor overflod ble forbundet med tilstedeværelse av bikalutamid de lineære modeller for microarray biblioteket i R 2.8.1 ble brukt [38]. Nærmere bestemt ble en lineær modell konstruert med betingelser for behandling, tidspunkt, og replikere. Denne modellen ble passer til hver probe, og brette endringer og p-verdier svarende til behandlingseffekten ble brukt for å identifisere prober av interesse. De to bikalutamid doseringer (0,4 uM og 1,0 uM) og de to tidspunkter oppsamlet post-seleksjon (T = 1 og T = 2) ble kombinert for analyse for å øke statistisk styrke. Signifikante forskjeller mellom bikalutamid doser og tidspunkter ble ikke observert. Kandidater som hadde en overflod endring som ble assosiert med tilstedeværelse av bikalutamid ble valgt som resulterte i en log2 bikalutamid /kjøretøy ≤-0,58 og en p-value≤0.01. Visualisering av kandidater ble utført med hierarkisk clustering og varmekart. All microarray data er MIAME kompatibel. Alle rådata har blitt deponert i GEO (serie ID GSE32261).
Cell levedyktighet og apoptose analyser
ON-TARGETplus ikke-måls (NT) siRNA og siRNA SMARTpools målretting
ABL2
,
akt1
,
AR
,
CIT
,
IGF1R
,
MAPKAPK5
,
MAST3
PLK2
,
PRKACG
,
PSMC1
,
RABGAP1
,
STRADα (STRADA)
,
STRN3
,
TSSK2
,
TTK
, og
VEGFβ
ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO). sirnas målretting
PLK1
ble brukt som en positiv kontroll for apoptose og ble hentet fra MSKCC høy gjennomstrømming Drug Screening Facility. Logg fase LNCaP, PC3, og Vcap celler ble transfektert med 100 nM siRNA hjelp DharmaFECT (Thermo Fisher Scientific). Celleviabilitet ble bestemt 3 og 6 dager etter inkubasjon med bikalutamid (1 UM), MDV3100 (1 UM), eller kjøretøy med Cell Titer-Glo Lysende celleviabilitet analysen (Promega). Apoptose ble analysert ved hjelp av caspase-Glo 3/7 analyse (Promega) og verdier ble normalisert til Dag 3 Cell Titer-Glo analysen. Analyser ble utført in triplo og standardfeil av middelverdien blir rapportert. Celleproliferasjon analyser ble også utført ved å inkubere celler med bærer (DMSO), bikalutamid (1 uM), AKT-inhibitor (1 uM) (Merck, Whitehouse Station, NJ), eller en kombinasjon av bikalutamid og AKT-inhibitor og å telle cellene. Forsøk ble utført i triplikat og standardavvikene er angitt.
Immunoblotting
Cellelysater for Western blot analyser ble fremstilt ved anvendelse av standard RIPA buffer. Antistoffene som brukes til western blot analyse og immunhistokjemi var Pakt Ser473 (Cell Signaling Technology, 1:1000 fortynning), Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1000 fortynning), PS6 Ser235 /236 (Cell Signaling Technology, 1: 1000 fortynning), PARP (Cell Signaling Technology, 1:1000 fortynning), og Actin (Cell Signaling Technology, 1:1000 fortynning).
Kvantitativ revers transkripsjon-PCR
LNCaP, PC3, og VCap-celler utsatt for siRNA transfeksjon ble høstet 4 dager eller 7 dager etter transfeksjon for å overvåke knockdown av mål-gen (e) ved kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) (se tabell S4). Reaksjonene ble gjort i tre eksemplarer og normalisert til RPL27 for hver cDNA og deretter normalisert til kjøretøy behandlet NT. Standard feil av gjennomsnittet ble beregnet.
Biokjemisk tilbakefall
genekspresjon og kopiere antall status for
STRADA
,
TTK
,
AR
,
akt1
,
SKT22B
,
PSMC1
, og
PRKACG
i grunnskolen og metastatisk human prostatakreft (n = 218) ble bestemt ved hjelp av MSKCC Cancer Genomics Pathway Portal [18]. Tjue av de 131 svulster
TTK
over-uttrykk definert som z-score≥2. Saker ble klassifisert som
TTK
høy og
TTK
normal /lav. Sannsynligheten for frihet fra biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi (BCR definert som 0,2 ng /ml og stigende prostata spesifikt antigen) ble rapportert ved bruk av Kaplan-Meier analyse. P-verdi ble beregnet ved bruk av log-rank test.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Bicalutamide hemmet LNCaP celleproliferasjon. Etter infeksjon med shRNA-biblioteket og puromycin seleksjon (A) LNCaP og (B) PC3-celler ble tellet, og sådd ut i vekstmedia inneholdende 0,4 uM bikalutamid, 1,0 uM bikalutamid, eller bærer (0 uM). Cellene ble telt og passert hver 4. dag for å overvåke vekst som svar på kjøretøy og bikalutamid. Resultatene er presentert som gjennomsnittlig antall levedyktige celler (toppfeltene) eller som prosent av levedyktige bikalutamid-behandlede celler sammenlignet med bærer-behandlede celler (bunnfelt) ved hvert tidspunkt i løpet av den 21 dagers tidsforløpet for hver behandling ± standard feil av 3 replikere eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034414.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
shRNA sonder utarmet i LNCaP celler. Boksplott av den relative overflod av sonder i bilen og bicalutamide- (narkotika) behandlet LNCaP celler. Data fra T = 2 og T = 3 ble kombinert for bilen eller bikalutamid behandlet boksplott.
