Abstract
Bakgrunn
Thyroid knuter er vanlig, og omtrent 5% av disse knuter er ondartet. Pleiotrofinprotein (PTN) er et heparin-bindende vekstfaktor som er overuttrykt i mange kreftformer. Uttrykket av PTN i papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) er ukjent
Metode og funn
74 pasienter (alder 47 ± 12 y, 15 menn) som hadde thyroidectomy med en histologisk diagnose:. 79 godartede knuter og 23 PTCs (10 klassiske, 6 høye celle, 6 follikulær variant og en ubestemte). Fine-nål aspirasjon (FNA) Prøver ble tatt
ex vivo
fra kirurgisk skåret vev og analysert for PTN og tyreoglobulin (Tg). Immunhistokjemi (IHC) ble utført på vevssnitt. I FNA prøver, PTN konsentrasjon normalisert til Tg var signifikant høyere i PTC enn godartede knuter (16 ± 6 vs 0,3 ± 0,1 ng /mg, p 0,001). I follikulær variant av PTC (n = 6), PTN /Tg-forhold var også høyere enn i benigne noduler (1,3 ± 0,6 vs. 0,3 ± 0,1 ng /mg,
P
0,001, respektivt). IHC viste cytoplasma lokalisering av PTN i PTC celler.
Konklusjon
I
ex vivo
FNA prøver, PTN å thyroglobulin forholdet var høyere i PTCs, inkludert follikulær variant PTC, enn i godartet skjoldbrusk knuter. Funnene heve muligheten for at måling av PTN til Tg forholdet kan gi nyttig diagnostisk og /eller prognostisk informasjon i vurderingen av skjoldbrusk nodules
Citation. Jee YH, Sadowski SM, Celi FS, Xi L, Raffeld M, Poser DB, et al. (2016) Økt pleiotrofinprotein Konsentrasjoner i papillær skjoldbruskkjertelen. PLoS ONE 11 (2): e0149383. doi: 10,1371 /journal.pone.0149383
Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES
mottatt: 6 august 2015; Godkjent: 01.02.2016; Publisert: 25 februar 2016
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:.. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av utført forskningsprogrammer av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and human Development (NICHD), National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer (NIDDK), Center for Cancer Research, National Cancer Institute (NCI) og Clinical center of National Institutes of Health
Konkurrerende interesser. YHJ og JB er co-oppfinnere på en patentsøknad innlevert av National Institutes of Health som dekker måling av midkine og pleiotrofinprotein i FNA prøver (US patentsøknad No. 61/728 624 innlevert 20. november 2012. HHS. Referanse: E-016-2013 /0-US-01 på analysen for å måle midkine eller pleiotrofinprotein nivå for diagnostisering av en vekst Oppført oppfinnere: Baron og Jee). Forfatterne har ingen andre relevante erklæringer knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling eller endrede produkter. Dette endret ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Ellers forfatterne erklære at det ikke er noen interessekonflikt som kan oppfattes som foregriper den upartiskhet forskning rapportert.
Innledning
Thyroid knuter forekommer ofte i den generelle befolkningen med en forekomst på omtrent 3-7% for palpable massene [1, 2]. Omtrent 5% av skjoldbrusk knuter er ondartet [3], og den mest vanlige typen er histologisk papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) [1]. To store utfordringer klinikere er å skille ondartede fra godartede knuter og å identifisere de skjoldbrusk maligniteter som er aggressive [1]. Tynn nål aspirasjon (FNA) cytologi representerer den primære preoperativ diagnostisk verktøy for evaluering av skjoldbrusk nodules [4], men det er mangelfulle i opptil 30% av pasientene [5]. Spesielt er follikulær variant PTC vanskelig å skille fra benigne lesjoner follikulære ved cytologi [6, 7].
pleiotrofinprotein (PTN) og midkine (MDK) er relatert polypeptid heparin-bindende vekstfaktorer [8, 9] . PTN og MDK er overexpressed i ulike kreft hos mennesker, hvor de er tenkt å fremme celle overlevelse, spredning og angiogenese, bidrar til tumorvekst [10, 11].
Vi har nylig rapportert at konsentrasjonen av MDK i FNA prøver er forhøyet i PTCs sammenlignet med benigne knuter [12]. I den studien den MDK-konsentrasjonen var normalisert til konsentrasjonen tyroglobulin (Tg), som justert for vev innhold og også forbedret avstanden mellom ondartede og godartede prøver på grunn av lavere Tg-konsentrasjoner i ondartede knuter. Imidlertid ble hverken MDK-konsentrasjonen eller den MDK /Tg-forhold forhøyet i den follikulære variant av PTC undergruppe [12], noe som begrenser den potensielle diagnostiske verdien av denne tilnærmingen.
PTN ble tidligere rapportert å være overuttrykt i medullær thyroid kreft [13], men et uttrykk for PTN i PTCs er ikke undersøkt. Vi antok at PTN konsentrasjon og PTN /Tg konsentrasjonsforholdet er høyere i PTCs enn godartede knuter.
Materialer og metoder
Tema og prøvetaking
Sytti-fire voksne personer (alder 47 ± 12 y, 15 menn) med skjoldbrusk knuter som gjennomgikk thyroidectomy ved National Institutes of Health (NIH) klinisk Senter ble inkludert i analysen. Studieprotokoller ble godkjent av National Institute of Diabetes og Digestive og nyresykdom Institutional Review Board, og alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke til å delta i studien. Etter at skjoldbruskkjertelen ble skåret, ble valgt knuter med omkringliggende vev delt i to for innkjøp og deretter
ex vivo
FNA ble utført ved å sende en 25-gauge nål inn i knuter. Nålen ble ført 10 til 20 ganger. Ingen sug ble brukt. Vevet innenfor nålen ble vasket ut med 0,5 ml PBS inneholdende 1% BSA. Prøvene ble alikvotert og lagret umiddelbart ved -80 ° C inntil analyse. Multiple
ex vivo
FNA prøver (gjennomsnitt, 3,0 prøver) ble oppnådd per nodule. Vi først forsøkt å måle PTN i
in vivo
FNA utvaskingsprøver, etter nålen innholdet hadde blitt utvist for cytologi, men ofte finnes ikke målbare PTN konsentrasjoner, noe som indikerer utilstrekkelig vev igjen i nålen (data ikke vist).
Det er totalt 103 knuter ble samplet. Av disse ble 62 nodule prøver tidligere analysert for MDK konsentrasjon og inngår i en tidligere rapport [12].
pleiotrofinprotein Sandwich ELISA-analysen
En PTN-sandwich ELISA ble utviklet i vårt laboratorium (se S1 fremgangsmåte for analyse detaljer). Den intra-assay var CV 6,9% for høy konsentrasjon (1,3 ng /ml) og 9% for lav konsentrasjon (0,2 ng /ml). Den inter-assay CV var 8,8% ved 0,2 ng /ml og 12,3% ved 0,6 ng /ml. Deteksjonsgrensen var 10 pg /ml. Det var ingen kryss-reaktivitet med opp til 50 ng /ml av MDK (S1A Fig). PTN konsentrasjoner i PBS inneholdende 1% BSA holdt seg stabil i plast, men ikke glassrørene i løpet av 2 timer ved romtemperatur og med gjentatte fryse-tine-sykluser (S2 Fig). Analysen viste god parallellitet (S3 figur).
Midkine Sandwich ELISA-analysen
MDK-sandwich ELISA ble utført som tidligere beskrevet ved hjelp av et kommersielt kit (Biovendor, Tsjekkia) med modifikasjoner [12]. Intra-assay var CV 3,4% ved høy konsentrasjon (0,7 ng /ml) og 5,2% ved lav konsentrasjon (0,25 ng /ml). Inter-assay CV var 12,3% ved lav konsentrasjon. Deteksjonsgrensen var 0,009 ng /ml. Det var ingen kryssreaktivitet med opp til 50 ng /ml PTN (S1B figur).
Thyroglobulin analysen
50 mL buffer som inneholder skjoldbruskkjertelen vev fra en FNA nål ble fortynnet 10 ganger i normalt saltvann og konsentrasjonen av Tg ble målt med en kjemiluminescerende immunometrisk assay (Immulite 2000XPi, Siemens, UK) i henhold til produsentens instruksjoner og som tidligere beskrevet [12].
BRAF mutasjon analyse
DNA ble ekstrahert på en Qiacube semiautomated robotenhet (Qiagen, Valencia, CA) ved hjelp av enten QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) fra 17 FNA utvasking prøver og 6 prøver frosne vev, eller QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) for parafin -embedded vevssnitt, i henhold til instruksjonene fra produsenten.
BRAF
T1799A (V600E) mutasjonsanalyse ble utført ved hjelp av PrimePCR ddPCR mutasjonsdeteksjon analyse (BIO-RAD, Hercules, CA) på en BIO-RAD QX200 dråpe digital PCR (ddPCR) system. Hver reaksjon inkludert 10 mL av 2x ddPCR SuperMix for prober (ingen dUTP), 1 mL av
BRAF
V600E primer /probe mix (FAM), 1 pl BRAF villtype primer /probe mix (HEX), og 40-100 ng genomisk DNA. Tilstedeværelsen av mutasjon og den fraksjon overflod av det mutante allelet ble bestemt med QuantaSoft v.1.7 (BIO-RAD).
pleiotrofinprotein Immunhistokjemi
Vevene ble formalin-fiksert, innstøpt i parafin, og kuttet i 5-mikrometer tykke seksjoner som ble deparaffinized og rehydrert i gradert alkohol. For antigen gjenfinning ble snittene plassert i citratbuffer ved 120 ° C ved anvendelse av et pressuer komfyr i 10 minutter. Etter blokkering med 1,5% normalt kaninserum i tris-bufret saltvann og Tween 20 (TBST) i 60 minutter ved romtemperatur, ble platene inkubert med et geit polyklonalt antistoff dannet mot humant PTN (Cat # AF-252-PB, R 0,001, S4 fig). Etter denne korrelasjonen sannsynligvis oppstått fordi begge PTN og Tg-konsentrasjoner i utvaskingsvæsken var avhengig av mengden av skjoldbruskkjertelen vev er tilstede i prøven, PTN nivåene var normalisert til Tg-nivåer som PTN /Tg, ng /mg, for å korrigere for mengden tyroideavev.
PTN konsentrasjoner og PTN /Tg forhold i ex vivo FNA prøver
PTN konsentrasjoner i PTC var betydelig høyere enn i godartede knuter (0,1 ± 0,01 vs 0,05 ± 0,01 ng /ml, gjennomsnitt ± SEM, p 0,001). PTN konsentrasjoner i undergruppe av follikulær variant papillær skjoldbruskkjertelkreft (FVPTC) var også høyere enn i godartede knuter (0,12 ± 0,03 vs 0,05 ± 0,01 ng /ml, p 0,001, fig 1A).
Prøver ble innhentet av
ex vivo
tynn nål aspirasjon; PTN og Tg ble målt ved immunanalyse. PTN konsentrasjoner (gjennomsnitt ± SEM) var høyere i PTC (inkludert alle undertyper), og i den undergruppe av follikulær variant PTC (FVPTC) enn i benigne knuter (A). Tilsvarende, PTN /Tg var større hos PTC (inkludert alle undertyper), og i den undergruppe av FVPTC enn i benigne knuter (B). PTN konsentrasjoner var ikke signifikant forskjellig mellom klassisk, høye celle variant, og FVPTC (C). PTN /Tg tendens (
P
= NS) å være lavere i FVPTC enn i andre undergrupper (D). Spredningsplott som viser PTN /Tg-verdier av alle knuter. Lukkede symboler, PTC; åpne symboler, godartede knuter (E). Verdier mindre enn 0,001 vises som lik 0,001.
Tg konsentrasjonene var lavere i PTC enn i godartede knuter (112 ± 30 vs 926 ± 88 ug /ml,
P
0,001, figur 1B og 1E), og også betydelig høyere i FVPTC enn godartede knuter (1,3 ± 0,6 vs. 0,3 ± 0,1 vs ng /mg,
P
0,001) (figur 1B). PTN /Tg var også forhøyet i en klump inneholdende medullær thyroid kreft (2,9 ng /mg).
Blant PTCs, var det ingen forskjell i PTN konsentrasjoner blant klassiske, høye cellevariant og FVPTCs (0,09 ± 0,02, 0,12 ± 0,03 og 0,12 ± 0,03 ng /ml, henholdsvis,
P
= NS) (figur 1C). Men FVPTC hadde de laveste de PTN /Tg forhold (24,5 ± 11,7, 42,1 ± 23,3 og 1,3 ± 0,6 ng /mg, henholdsvis
P
= 0,06) (figur 1D).
av 10 godartede knuter med høyest PTN /Tg ratio, 2 forekom hos pasienter med Graves «sykdom (2 av 2 pasienter med Graves» sykdom), 1 i et fag med en follicular adenom (en av fire personer med follikulær adenom), en hos en pasient med kronisk lymfatisk tyreoiditt (en av tre pasienter med kronisk lymfatisk tyreoiditt), en i en godartet knute i tilknytning til PTC og 5 i godartede knuter uten andre vesentlige histologiske funn.
PTN /Tg forholdet hadde ingen tilknytning nodule størrelse eller tilstedeværelse av lymfeknutemetastase (data ikke vist).
Association mellom PTN /Tg og MDK /Tg og bivariat analyse
Begge MDK /Tg og PTN /Tg ble målt i 22 PTCs og 77 godartede knuter. Det var ingen sammenheng mellom PTN /Tg og MDK /Tg blant godartede knuter. Men det var en positiv korrelasjon mellom MDK /Tg og PTN /Tg blant PTCs (R
2 = 0,44,
P
= 0,001) (figur 2A).
Sammenheng mellom PTN /Tg og MDK /Tg forholdstall mellom alle PTC knuter studert (A). PTN /Tg og MDK /Tg var positivt korrelert (R
2 = 0,44,
P
= 0,001). Bivariat analyse av PTN /Tg og MDK /Tg forholdstall (B). Alle PTCs hadde MDK /Tg høyere enn 0,2 ng /ml (horisontal stiplet linje) og PTN /Tg som er større enn 0,13 ng /ml (vertikal stiplet linje). Verdier mindre enn 0,001 vises som lik 0,001. Lukkede sirkler, PTC; åpne sirkler, godartede knuter.
En bivariat tomt på alle knuter med både PTN /Tg og MDK /Tg målt avslørte at alle PTCs hadde MDK /Tg større enn 0,2 ng /ml og PTN /Tg større enn 0. 13 ng /ml (figur 2B). Av de 35 knuter som oppfylte begge disse kriteriene er 23 ondartet (100% av PTC) og 12 var godartet (15% av benigne noduler), hvilket ga en følsomhet på 100% og en spesifisitet på 85%.
Sammenheng mellom PTN /Tg forhold og BRAF mutasjon
Blant 23 PTC knuter, 16 hadde
BRAF
V600E mutasjon. Den PTN /Tg forholdet tendens til å være høyere i
BRAF
-positivt enn i
BRAF
-negative knuter, men forskjellen var ikke statistisk signifikans (21,5 ± 7,9 vs. 1,8 ± 0,8,
P
= 0,095).
bekreftelse på PTN uttrykk ved hjelp av immunhistokjemi
Immunhistokjemisk farging av vevssnitt viste at PTN farging var mer intens i de neoplastiske thyroid epitelceller innenfor PTCs enn i de nærliggende normale skjoldbrusk epitelceller. (Fig 3A-3C). Enkelte spredte stromale celler i tilstøtende bindevevet viste også immunhistokjemisk farging. Innenfor thyroid epitelceller PTN flekker var først og fremst cytoplasma og perinukleær (Fig 3C).
A) Histologiske snitt inneholder høye cell variant PTC ble immunostained for PTN (brun farge) og kontra med hematolxylin (lilla farge). Immunhistokjemisk farging var mer intens i de neoplastiske thyroid epitelceller innenfor PTCs (lukkede piler) enn i i omgi normale thyroid epitelceller (åpne piler). Noen av stromale celler i tilstøtende bindevevet viste også immunhistokjemisk farging. B) Høyere forstørrelse av PTC og normalt vev fra samme seksjon som i panel A. C) Immunhistokjemisk belastende av klassisk PTC som viser perinukleær plasseringen av PTN (piler). Størrelse bar, 100 mikrometer.
Diskusjoner
Vi fant at PTN var målbar i FNA prøver tatt
ex vivo
fra tyreoidektomipasienter prøver og at PTN konsentrasjonene var høyere i PTC enn godartede knuter. Tilsvarende PTN /Tg forholdet var større i PTC enn godartede knuter. Vi valgte å begynne med å bruke Tg som et mål på vev innhold. Imidlertid har vi funnet at nivået av Tg i prøver fra PTC var lavere enn i prøver fra benigne knuter, hvilket antyder at Tg ekspresjon kunne være lavere i ondartede celler, i samsvar med en tidligere studie [14], og derfor Tg kan ikke bare være en mål på vev innhold. Men fra et pragmatisk ståsted, er denne effekten tilfeldig fordi normalisering av PTN til Tg forsterket avstanden mellom ondartede og godartede prøver.
PTN uttrykk ved PTCs ble bekreftet av immunhistokjemi. De immunhistokjemiske funn tyder på at PTN er overuttrykt av neoplastiske thyroid epitelceller seg, først og fremst i en perinukleær og cytoplasma lokalisering som rapportert i andre vev [15-16]. Imidlertid farging for PTN ble også observert i de tilstøtende stromale celler heve muligheten for at andre celler kan også bidra til forhøyet PTN målt ved hjelp av ELISA i PTC.
Oppdagelsen av at PTN er forhøyet i PTC antyder at PTN overekspresjon kan fremme vekst av PTCs, som også er blitt foreslått for andre kreftformer, slik som ovarie [17], bukspyttkjertel [18], glioblastom [19], prostatakreft [20] og brystkreft [21]. For eksempel, i en brystkreft-modell, PTN overekspresjon stimulert ombygging av mikromiljøet, tumor angiogenese, og hurtig tumorvekst [22]. Men i vår studie, vi ikke observere en sammenheng mellom PTN /Tg forhold og størrelsen på knuter eller tilstedeværelse av lymfeknutemetastaser. Vi gjorde ikke også finne en signifikant sammenheng mellom PTN /Tg forhold og tilstedeværelsen av BRAF V600E mutasjon. Imidlertid er størrelsen på utvalget i vår studie utilstrekkelig til å definitivt utelukke assosiasjoner med sykdom aggressivitet eller genetisk etiologi.
Vi har tidligere funnet at konsentrasjonen av MDK, en heparin-bindende vekstfaktor knyttet til PTN, var høyere i PTC lignet med benigne noduler [12]. I denne studien fant vi at MDK /Tg og PTN /Tg var positivt korrelert i PTCs. Det er imidlertid en viktig forskjell at i FVPTC ble PTN /Tg opphøyet, mens den MDK /Tg viste verdier som overlapper de av benigne knuter. Dette funnet er av spesiell interesse fordi FVPTC er ofte vanskelig å skille fra godartede follikulære lesjoner ved cytologi, som ofte krever histologisk evaluering [7].
En bivariat tomt på PTN /Tg og MDK /Tg viste sterk gruppering av PTC prøver, slik at alle maligniteter hadde MDK /Tg høyere enn 0,2 ng /mg og PTN /Tg som er større enn 0,13 ng /mg. Kun 15% av godartede knuter fornøyd begge disse kriteriene (Fig 2B). Observasjonen at PTN /Tg forholdet og MDK /Tg forholdet er forhøyet i PTC forhold til godartede knuter øker muligheten for at måling av PTN, MDK, og Tg i skjoldbrusk FNA prøvene kan gi nyttig tilleggs diagnostisk informasjon til cytologic undersøkelse, som har blitt demonstrert av RNA profilering [23], mutasjonsanalyse [24] og andre molekylære tilnærminger [25]. Men for å etablere en klinisk nyttig tilnærming, det er viktige utfordringer som måtte løses, hvorav mange reflekterer begrensninger i denne studien. Først, for å måle PTN i FNA utvasking, må tilstrekkelig tyroideavev være til stede. Således kan en dedikert FNA pass, atskilt fra de som kreves for cytologi, være nødvendig for å oppnå tilstrekkelig vev som blir gjort med den kommersielt tilgjengelige genekspresjon klassifiseringstesten [23]. Alternative mulige tilnærminger inkluderer å utvikle en mer sensitiv analyse PTN eller vaske utvist nål med et mindre volum av buffer, og analysen utføres uten fortynning. For det andre, ble studien utført ved hjelp FNA prøver innhentet
ex vivo
etter tyreoidektomi. Enten lignende data ville bli observert med
in vivo
, er perkutan FNA prøvetaking ukjent. Vi gjorde ikke ta opp dette spørsmålet på grunn av utilgjengelighet av dedikerte
in vivo
FNA prøver i denne forskningsstudien. For det tredje kan vår tilnærming ikke være nyttig hos pasienter med Graves «sykdom eller kronisk lymfatisk tyreoiditt; Vi observerte forhøyede PTN /Tg forhold i godartede knuter i skjoldbruskkjertelen er berørt av disse autoimmune sykdommer. Fjerde, vil tilpasning av disse funnene i en tilleggs klinisk diagnostisk test krever en vesentlig større studie for å bestemme sensitivitet og spesifisitet hos personer med indeterminant cytologi. Den nåværende pilotstudien viser en ny observasjon av forhøyet PTN /Tg i alle typer PTC, men ble ikke laget for å strengt validere en diagnostisk test. Vår studie er designet for en proof-of-concept og brukes
ex vivo
FNA materialer. Derfor er ROC analyse ikke utført.
Konklusjoner
I konklusjonen, våre funn indikerer at PTN konsentrasjoner og PTN /Tg forholdet i
ex vivo
FNA prøver skille PTC fra godartede lesjoner, øke muligheten for at denne strategien kan ha tilleggsdiagnoseverktøy for å supplere cytologi og andre eksisterende molekylære metoder. Imidlertid vil flere større studier være nødvendig for å validere denne tilnærmingen.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
Supplemental Figur 1A. PTN kryssreaktivitet med MDK. Figur Supplemental 1B. MDK kryssreaksjon med PTN
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s001 plakater (docx)
S2 Fig.
Supplemental Figur 2A. Stabilitet i glass vs plastrør. Figur Supplemental 2B. Stabilitet ved romtemperatur og under fryse og tinesyklus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s002 plakater (docx)
S3 Fig. Supplemental Figur 3.
Parallellitet av PTN ELISA mellom standardkurve og serielt utvannet utvaskingsprøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s003 plakater (docx)
S4 Fig. Supplemental Figur 4.
PTN konsentrasjoner ble positivt assosiert med Tg konsentrasjoner i FNA utvaskingsprøver fra godartede knuter (analyse tatt med alle enkeltpass, R
2 = 0,04, P 0,001)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s004 product: (docx)
S5 fig. Supplemental Figur 5.
Positive og negative IHC kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149383.s005 plakater (docx)
S1 Method. Supplemental Metode
pleiotrofinprotein Sandwich ELISA-analysen
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0149383.s006 plakater (docx)
