Abstract
Bakgrunn
Mincle, makrofag-induserbar C-type lectin , er medlem av C-type lectin reseptorer. Det spiller en viktig rolle i antimykobakteriell og anti-sopp immunitet. Videre registrerer det døde celler gjennom sitt primære ligand SAP130.
Materialer og funn
Vi har undersøkt ti uroteliale svulster i urinblæren av storfe. Åtte av dem uttrykt E5 cDNA fra bovin papillomavirus type 2 (BPV-2) og type 13 (BPV-13) som hører til slekten Deltapapillomavirus. To av dem ble ikke undersøkt for påvisning av E5 cDNA. Mincle uttrykk viste seg å forekomme i bare urothelial neoplastiske celler. Ingen mincle ekspresjon ble påvist i urotelialceller fra friske storfe. Mincle uttrykk var preget av en membran mønster i papillær uroteliale kreft; isolerte og /eller gruppert urotelialceller viser en sterk cytoplasma immunoreaktivitets ble primært sett i invasive urothelial kreft.
Konklusjon
Dette er den første studien om uttrykket av mincle i veterinær onkologi og den første rapporten som beskriver ekspresjon av funksjonell mincle reseptoren i neoplastiske celler i medisinsk litteratur. Som det har vist seg at urothelial kreftcellene har evnen til å fungere som antigenpresenterende celler (APC), kan det tenkes at mincle ekspresjon er involvert i presentasjonen av kreftcelleantigener til celler i immunsystemet. Videre, ettersom uttrykk for mincle bidrar til kontroll av
Mycobacterium bovis
BCG-infeksjon, denne studien har spennende kliniske implikasjoner i komparativ medisin med tanke på at Bacillus Calmette-Guérin (BCG) immunterapi er for tiden den mest effektive behandlingen av ikke-muskel invasiv blærekreft i mennesket. Mincle ekspresjon i urothelial tumorceller garanterer videre studier for å bedre forstå den rolle, om noen, av denne reseptoren i blærekreft. Fremtidige studier vil gi innsikt i rollen som mincle reseptoren av uroteliale kreftceller i antitumor immunterapi
Citation. Roperto S, Russo V, Esposito jeg, Ceccarelli DM, Paciello O, Avallone L, et al. (2015) Mincle, en medfødt immun Receptor, er uttrykt i urothelial Cancer Celler av papillomavirus-Associated urothelial Svulster av storfe. PLoS ONE 10 (10): e0141624. doi: 10,1371 /journal.pone.0141624
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: May 22, 2015; Godkjent: 28 september 2015; Publisert: 29 oktober 2015
Copyright: © 2015 Roperto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
C-type lectin reseptorer (CLRs) utgjør en stor super av proteiner i hovedsak uttrykt på myeloide celler hvor de effektivt fungerer som mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) [1]. CRL omfatte mer enn tusen identifiserte medlemmer fra flere dyrearter [2], og antas å være den fjerde familie av mønstergjenkjenning reseptorer [3]. CLRs gjenkjenne et variert utvalg av ligander fra «nonself «(patogen-forbundet molekylære mønstre-PAMPs),» skadet selv «(skade-forbundet molekylære mønstre-demper) eller» endret selv» (tumor-assosiert molekylære mønstre-tamps) [1 ].
Mincle, makrofag-induserbar C-type lectin (også kalt som CLEC4E), er medlem av CLRs. Det ble opprinnelig identifisert som en transkripsjonen mål av NF-interleukin-6 (IL-6) hovedsakelig uttrykt på profesjonell antigen-presenterende celler (APC), slik som makrofager, dendrittiske celler (DCS), B-celler og neutrofiler [4]. Ekspresjonsnivået av mincle i steady-state tilstand er meget lav; imidlertid, er det sterkt oppregulert etter eksponering for forskjellige inflammatoriske signaler [5]. Mincle synes å være selektivt forbundet med Fc-gamma-reseptor (FcγR) og aktiverer makrofager til å produsere inflammatoriske cytokiner og kjemokiner [6]. Mincle er et nøkkel-reseptor for mycobakteriell ledningen faktor trehalose dimycolate (TDM) og dermed være en viktig modulator av den antimikrobielle immunitet [7,8]. Mincle har en avgjørende rolle i soppdrepende immunitet som den gjenkjenner noen patogene sopp som
Candida albicans
,
Malassezia
arter og
Fonsecaea pedrosoi
, den utløsende agent for chromoblastomycosis [9 -11]. Videre registrerer mincle døde celler gjennom den primære ligand SAP130 (spliceosome-assosiert protein 130), en liten ribonucleoprotein frigjøres fra nekrotiske celler eneste [6]. Nylig har det vist seg at det naturlige produkt brartemicin, en inhibitor av kreftcelle invasjon, er et høy-affinitet ligand av karbohydrat-gjenkjenning domene (CRD) av mincle reseptor [12].
Mincle ble nylig funnet å bli uttrykt i ikke-immune celler så som neuroner og endoteliale celler etter iskemisk slag hos både mus og mennesker; Derfor har det vært antydet at mincle og dens ligand SAP130 delta i patogenesen av cerebral iskemi ved å initiere betennelse [13, 14].
urinblæren svulster er svært sjelden hos storfe utgjør 0,01% av alle storfe malignitet [15]. Tvert imot, blære svulster er vanlig hos voksne storfe som har beitet på beitemarker rik på Bracken Fern (
Pteridium
spp.) [16-19]. Ptaquiloside, en bregner sesquiterpenoid, og smittestoffer antas å være ansvarlig for blære celle transformasjon. Selv om mange bakterier er funnet i urinen bakterieflora av storfe rammet av blæren svulster [20], storfe papillomavirus (BPVs) fra Delta slekten synes å være de viktigste smittestoffer som er involvert i de etio-pathogenetic mekanismer for blære kreftutvikling. Særlig bovin papillomavirus type 2 (BPV-2) og skriver 13 (BPV-13) synes å være de mest rådende virus ansvarlig for blære tumor hos storfe [17, 21-26].
Formålet dagens papir er å rapportere uttrykk for mincle reseptor i uroteliale kreftceller av naturlig forekommende papillomavirus-forbundet uroteliale svulster hos storfe.
Materiale og metode
Etikk uttalelse
i denne studien vi ikke utføre dyreforsøk. Vi samlet inn prøvene direkte fra private og offentlige slakterier; dyrene ble slaktet etter en obligatorisk klinisk undersøkelse ante mortem undersøkelse som kreves av europeiske union (EU) lovgivning.
tumorprøver
Ti storfe uroteliale tumorprøver og fem blære prøver fra tilsynelatende friske kyr var innsamlet med tillatelse fra legemiddelmyndighetene i slakteriene som heter «Barbara Rocco sas» av Simbario (Calabria-regionen), «Macello Comunale» av Muro Lucano (Basilicata-regionen), «Cestari Carni srl» av Montesano sulla Marcellana (Campania-regionen), «Frigo Sud srl» av Nocera Superiore (Campania-regionen), «Ekte Beef srl» av Flumeri (Campania-regionen).
for å hindre mulig kryss forurensing, både neoplastiske og normal blære prøvene ble umiddelbart delt inn i flere deler . Noen deler ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C for påfølgende molekylær biologisk analyse. De resterende delene ble fiksert i 10% bufret formalin for mikroskopiske undersøkelser.
Histopatologi
vev faste i 10% bufret formalin ble rutinemessig forankret i parafinvoks. Histologisk diagnose ble vurdert på 5-mikrometer tykk haematoxylin-eosin (HE) -stained delene med morfologiske kriterier som foreslås i rapporten om den nye histologisk klassifisering av uroteliale svulster i urinblæren av storfe [19].
RNA ekstraksjon
Total RNA ble ekstrahert fra urin blærer av kyr bruker RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milano, Italia), i henhold til produsentens instruksjoner. Mengden og kvaliteten på RNA ble vurdert ved hjelp av NanoVue Plus og elektroforese på 1% agarosegel. Genomisk DNA ble fjernet fra RNA preparater som bruker RNase-fritt DNase I Fermentas miljø- og biovitenskap (Dasit, Milano, Italia).
revers transkripsjon (RT) -PCR for BPV-2, BPV-13 E5, Mincle, FcγR og CXCL2
Totalt RNA ble transkribert ved hjelp av iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia) og reaksjonen ble inkubert ved 25 ° C i 5 minutter, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 minutter, og deretter holdt ved 4 ° C i 5 minutter. Det syntetiserte cDNA ble analysert ved hjelp av PCR med spesifikke primere for BPV-2 E5 ORF (forover, 5′-CACTGCCATTTGTTTTTTTC-3 «, omvendt, 5′-GGAGCACTCAAAATGATCCC-3»), for BPV-13 E5 ORF (forover, 5 «- CACTGCCATTTGGTGTTCTT-3′, revers 5»- AGCAGTCAAAATGATCCCAA-3 «), for Mincle (forover-primer, 5′-GACTGAGGGTCAGTGGCAAT -3′; revers primer, 5»-GTCCCTTATGGTGGCACAGT-3 «), for FcγR (forover, 5» – TTTGGTTGAACAAGCAGCGG-3 «, 5’omvendt TGCAACTTGAGTCGGCAGTA -3′) og for CXCL2 (forover, 5»- GCCGCTCCCATGGTTAAGAA-3 «, 5’omvendt TCTGTAGGGGCAGGGTCTAC -3′). For å evaluere tilstrekkeligheten av cDNA prøvene, en kontroll PCR for storfe β-aktin sekvens ble utført ved hjelp av et sett med primere designet av Primer BLAST programvare (forover, 5»-GAGCGTGGCTACAGCTTCAC-3 «; omvendt, 5′-CATTGCCGATGGTGATGA-3» ). RT-PCR ble utført i en 25 ul reaksjonsblanding inneholdende 2,5 pl 10 X buffer, 2 mM MgCl
2, 2,5 U AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Life Technologies, Monza, Italia), 480 nM av hver primer og 200 mM av hver dNTP og 50 ng DNA ekstrakt. PCR programmet var 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 s og forlengelse ved 72 ° C i 1 min. En endelig forlengelsestrinn ved 72 ° C i 7 min ble utført i hver PCR-analyse. Gel-elektroforese av 20 pl amplifiserte DNA demonstrerte et produkt av den forventede størrelse. I hvert forsøk ble en blindprøve bestående av reaksjonsblandingen uten DNA inkludert. Såvidt BPV E5 cDNA analyse en positiv prøve som består av klonet BPV-2 (en slags gave av Dr. A. Venuti) og en BPV-13 positiv prøve (en slags gave av Dr A. A. Alfieri) ble benyttet. Amplified DNA ble renset gjennom silicagel membraner ved hjelp av QIAquick PCR kvantifisering kit i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Milano, Italia). RT-PCR-produkter, etter separasjon ved gel elektroforese, ble sekvensert ved hjelp av et Sanger metode basert automatisk sequencer (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies, Monza, Italia). Videre ble forsterket Mincle DNA fra friske og patologiske blærer klonet inn pGEM-T vektor med pGEM-T Easy Vector System (Promega, Milano, Italia) og sekvensert i automatiserte apparat (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies).
Kvantitativ real Time PCR-analyse (QRT-PCR) for Mincle
for QRT-PCR-analyse, 500 ng RNA ble revers-transkribert ved hjelp av iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Milano , Italia) og reaksjonen ble inkubert ved 25 ° C i 5 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 min, og deretter holdt ved 4 ° C i 5 min. Real Time reaksjoner ble utført ved hjelp av SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). For påvisning av Mincle spesifikke primere (som beskrevet ovenfor) ble anvendt. Alle reaksjoner ble utført in triplo og β-aktin ble benyttet som intern standard (forover primer 5′-TAGCACAGGCCTCTCGCCTTCG-3 «, revers primer 5′-GCACATGCCGGAGCCGTTGT-3»).
Western blot-analyse på blæren prøvene for mincle protein
friske og syke blærer ble oppløst i 2 timer ved 4 ° C i lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100. Umiddelbart før bruk, ble de følgende reagenser tilsatt: 1 mM DTT, 2 mM PMSF, 1,7 mg /ml aprotinin, 25 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4 (Sigma-Aldrich, Milano, Italia).
Lysates ble avklart ved 15000 rpm i 30 min. Proteinkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). For Western blotting, ble 100 ug lysat proteiner oppvarmet ved 100 ° C i 4X forblandet Laemmli-prøvebuffer (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). Proteiner ble utsatt for natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under reduserende forhold.
Etter elektroforese, proteiner ble overført på nitrocellulose filtermembraner (GE Healthcare og biovitenskap, Chalfont St. Giles, UK) i 1 time ved 10 V i 192 mM glycin /25 mM Tris-HCl (pH 7,5) /10% metanol ved anvendelse av en Trans-blot SD Semi Dry celle (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia) i henhold til produsentens instruksjoner. Membranene ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltoppløsning (TBS, pH 7,5) i 1 time ved romtemperatur, ble vasket med TBS-Tween 0,1%. Deretter ble filtrene probet med anti-Mincle (CLEC4E (P-15): sc-161486, (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) fortynnet 1: 1000 i 5% BSA for en inkubering over natten ved 4 ° C Etter tre vaskinger. i Tris-bufret saltvann, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-geite-IgG (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) i 1 time ved romtemperatur. etter passende vasketrinn, ble bundet antistoff visualisert ved hjelp av et forbedret kjemiluminescens system (Western Blotting Luminol Reagens, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Bilder ble kjøpt med bilde Lab Software versjon 2.0.1 (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia).
Immunohistochemistry
Alle patologisk prøvene ble immunfarget og deler av normal bovin urinblæren slimhinnen ble testet i parallell som kontroll ved bruk av avidin-biotin-peroksidasekompleks (ABC) metode med Vectastain ABC-kit (Vector Laboratories, Inc., CA, USA). Kort sagt ble parafinsnitt ble deparaffinized, og sperret for endogen peroksidase i 0,3% H
2o
2 i metanol i 20 min. Antigen forbedring ble utført ved forbehandling med mikrobølgeoppvarming (to ganger i 5 minutter hver ved 750 W) i citrat-buffer pH 6,0. Objektglassene ble vasket tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4, 0,01 M), deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med normalt kaninserum (Vector Laboratories Inc., CA, USA) fortynnet til 20%. Polyklonalt geite-anti-CLEC 4E, anti-Fc ε RIγ, anti-Card9 og et monoklonalt muse anti-Syk (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) primære antistoffer fortynnet ved en i 200, 1 400 i «1 i 300 og 1 i 50, henholdsvis, i fosfatbufret saltvann (PBS), ble påført over natten ved romtemperatur i et fuktig kammer. Objektglassene ble vasket tre ganger med PBS, og deretter inkubert i 30 minutter med passende biotinylert sekundært antistoff anti-geit (Vector Laboratories Inc., CA, USA) fortynnet 1 i 200 i PBS. Snittene ble vasket tre ganger med PBS og deretter inkubert med Vectastain ABC-reagens (Vector Laboratories Inc., CA, USA) i et fuktighetskammer ved romtemperatur. Fargeutvikling ble oppnådd ved behandling med 3, 3»-diaminobenzidin (Vector Laboratories Inc., CA, USA) i 2-10 min. Seksjoner ble kontra med Mayers hematoksylin. Den primære antistoff ble utelatt og erstattet med antistoffdiluent i negative kontroller der ingen bakgrunn farging ble oppdaget.
Resultater
Som mislykket infeksjoner av BPV-2 og BPV-13 er vanligvis forbundet med urothelial svulster i urinblæren av storfe, for det første, vi undersøkt om utskrifter av E5 protein, viruset store oncoproteinet, var til stede i svulstene. RT-PCR viste både BPV-2 og BPV-13 E5 transkripsjoner i bare kreftceller; ingen E5 transkripsjoner ble oppdaget hos friske blære prøver. Tilstedeværelse av BPV-2 og BPV-13 E5 RNA ble bekreftet ved sekvensering av amplikonene henhold til BPV-2-sekvensen M20219.1 og til BPV-13 sekvens JQ798171.1 (figurene 1 og 2). Mikroskopiske mønstre av urothelial kreft og påvisning av HPV-E5 transkripter er oppsummert i tabell 1.
Vurdering av BPV-2 E5 cDNA ved revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). M: 50 bp molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-3: sunne urinblæren prøver; 4-6: blære kreftprøver; 7: positiv kontroll (klonet BPV-2 DNA); 8: negativ kontroll (uten DNA som tilsettes). Pilen indikerer stillingen av 154 bp BPV-2 E5 PCR-produkt.
Vurdering av BPV-13 E5 cDNA ved revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). M: 50 bp molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-3: sunne urinblæren prøver; 4-6: blære kreftprøver; 7: positiv kontroll (BPV-13 DNA); 8: negativ kontroll (uten DNA som tilsettes). Pilen viser posisjonen til 153 bp BPV-13 E5 PCR produkt
Mincle protein ble avslørt både hos friske og patologiske prøver av western blot etterforskning.; proteinet syntes å være overuttrykt i tumorprøver som sammenlignet med friske prøver (fig 3). RT-PCR avslørte tilstedeværelsen av mincle utskrifter både i normale og kreftprøver. Etter kloning og sekvensering, mincle transkripsjoner viste en 98% og 99% identitet, henholdsvis med Bos taurus mincle genet deponert i GenBank under tilgjengelighetsnummeret XM_010827920.1 (fig 4). QRT-PCR påvist en statistisk signifikant økning av mincle mRNA-nivåer i patologiske prøver (figur 5).
(x) Western blot-analyse som viser en statistisk signifikant overekspresjon av Mincle proteinet i tumor blærer. Lanes 1-3: urinblæren fra friske dyr. Banene 4-6: neoplastisk vev fra representative tre dyr med papillomavirus-assosierte svulster i urinblæren. Aktin protein nivåer ble oppdaget for å sikre lik protein lasting. (Y) Kvantitativ densitometrisk analyse av filtrene ble utført med bilde Lab programvare (ChemiDoc, Bio-Rad Laboratories) og betydning bestemmes av Student T-test (*, p≤0.05)
Lane. M, Molecular massemarkør (1 kb DNA Ladder, Microtech). Lanes 2-4: Fire normal (kontroll) prøver fra friske kyr. Lanes 5-7: ni representative tumorprøver. Lane 8: negativ kontroll (uten DNA som tilsettes). De øvre og nedre del av figuren viser 99% og 98% homologi henholdsvis mellom rekkefølgen av amplikonene, etter kloning, og sekvensen av bovint MINCLE deponert i GenBank (XM_010827920.1).
Den relative uttrykk for MINCLE nivåer i neoplastiske vev. Relative mRNA nivåer, beregnet ved hjelp av ΔΔCT metoden, representerer fold endringer i forhold til blæreprøver fra friske kyr. Alle verdier ble normalisert til den interne kontrollen β-aktin. Resultatene representerer gjennomsnitt og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (*, P≤0.05, vs urinblæren fra friske dyr).
Morfologisk mincle protein ble oppdaget av immunhistokjemiske prosedyrer i uroteliale tumorceller, og ikke i normale urotelialceller. En membran mønster av mincle immunoreaktivitets ble sett i neoplastiske celler av både lav- og høy grad av papillær uroteliale tumorer (fig 6); i tillegg spredt og gruppert neoplastiske urotelialceller både lav- og høy grad av invasiv urothelial kreft viste en sterk immunoreaktivitets for mincle, prevalently i en cytoplasmatiske mønster utseende. Mincle uttrykk ble også påvist i betennelsesceller spredt blant kreftceller; Spesielt ble reseptorekspresjon sett i tumorassosierte makrofager (TAM) (figur 7).
A membranøs mønster av mincle ekspresjon ble observert i endoluminal urothelial celle proliferasjon (piler). Innfelt: Non immunoreaktivitets ble sett i normale urotelialceller. Mag. 40X; Bar. 100 mikrometer
Gruppert av neoplastiske celler viste en sterk cytoplasma immunoreaktivitets for mincle (svarte piler). Isolerte immunoreaktive neoplastiske celler ble også sett spredt i blæreveggen. Immunoreaktivitets var også tydelig i tumor-assosiert makrofager (TAM) (rød pil). Mag. 40X. Bar: 100 mikrometer
Det er kjent at Mincle forbinder med adapter protein FcγR som er nødvendig for initiering av signale ved å binde Syk som i sin tur aktiverer en signalkaskade gjennom Card9 og denne hendelsen fører. til induksjon av cytokin og chemokin eksempel CXCL2 [5, 6]. Derfor, undersøkte vi FcγR mRNA-ekspresjon i både normale og patologiske blære prøver ved RT-PCR. Amplikonene, sekvensering som viser seg å være FcγR utskrifter som viser en identitet på 97% med Bos taurus FcγRI (GenBank tilgangsnummer: AF316499.1), ble oppdaget i kreftprøver bare (fig 8). Morfologisk en sterk cytoplasmisk membran og immunoreaktivitet avslørende en uventet, avvikende ekspresjon av FcγRI var tydelig i urothelial kreftceller (figur 9). Deretter undersøkte vi hvorvidt en morfologisk ekspresjon av Syk-Card9 aksen kunne påvises i urotelialceller sunne og neoplastiske prøver. En sterk immunreaktivitet avslørende et tydelig Syk-ekspresjon ble tydelig påvist i urothelial kreftceller bare (Fig 10). Videre er også Card9 protein-ekspresjon ble immunhistokjemisk sett i urothelial tumorceller. Ingen immunreaktivitet for Card9 var åpenbar i urotelialceller friske prøver (Fig 11).
Vurdering av FcγR mRNA ekspresjon av revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). M: molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-4: sunne urinblæren prøver; 5-7: blære kreftprøver; 8: negativ kontroll (uten DNA som tilsettes). Den nedre del av figuren viser en identitet på 97% med Bos taurus FcγR1 (GenBank tilgangsnummer: AF316499.1).
En sterk cytoplasmisk membran og immunoreaktivitet som viser en avvikende ekspresjon av FcγR ble sett i uroteliale kreftceller. Innfelt: Ingen FcγR uttrykk ble påvist i normale urotelialceller. Mag. 40X; Bar: 100 mikrometer
En sterk immunoreaktivitets viser et tydelig uttrykk for Syk ble sett i urothelial kreftceller.. Innfelt: Ingen immunoreaktivitets for Syk ble oppdaget i normale urotelialceller. Mag. 40X; Bar. 100 mikrometer
En sterk cytoplasma immunoreaktivitets viser et klart uttrykk for Card9 ble sett i urothelial kreftceller. Innfelt: Ingen immunoreaktivitets for Card9 ble sett i normale urotelialceller. Mag. 40X; Bar. 100 mikrometer
Til slutt studerte vi mRNA uttrykk for CXCL2, en pro-inflammatorisk kjemokin. RT-PCR viste et nærvær av cDNA i cancerprøver bare; sekvenser hentet fra amplikonene bekreftet å være CXCL2 transkripsjoner som viste en 98% identitet med Bos taurus CXCL2 (GenBank tilgangsnummer: NM_174299.3). (Fig 12)
Vurdering av CXCL2 mnRNA uttrykk av revers transkriptase polymerase chain reaksjon (RT-PCR). M: molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-4: sunne urinblæren prøver; 5-7: blære kreftprøver; 8: negativ kontroll (uten DNA som tilsettes). Den nedre delen av figuren viser en 98% identitet med Bos taurus CXCL2 (GenBank tilgangsnummer: NM_1742993).
Diskusjoner
Vi oppdaget mincle uttrykk i papillomavirus-forbundet uroteliale svulster i urinblæren hos storfe. Dette er den første rapport av ekspresjonen av mincle i veterinær onkologi, og den første observasjonen som beskriver ekspresjon av funksjonell mincle reseptoren i neoplastiske celler i medisinsk litteratur. Morfologisk var mincle protein sett i urothelial neoplastiske celler bare, men ikke hos normale urotelialceller, noe som kan bety at nivået av mincle uttrykk er så lav i steady-state tilstand for ikke å bli oppdaget av immunohistokjemiske prosedyrer. Vi utelukker ikke at mincle påvist i friske blæren kommer fra klynger av lymfoide og makrofagceller som vanligvis er tilstede i blæreveggen av sunne kyr.
Det er mulig at genomiske forandringer som fører til feilregulering av enkelte CLR-gener kan bli ansvarlig for mincle samt FcγRI ekspresjon i urothelial tumorceller; Det er også tenkelig at mincle ekspresjon kan bli aktivert av noen endogene ligander fordi mange nekrotisk brennpunkter, som kan føre til utslipp av selv-komponenter er sett i urothelial svulster i urinblæren av storfe. Derfor kan mincle være involvert i induksjonen av en pro-inflammatorisk respons etter avføling av komponentene frigjøres fra døde celler. I henhold til Suzuki et al. [13], mange endogene ligander for mincle reseptoren er fortsatt å bli identifisert.
Det er blitt foreslått at urotelialceller (inkludert blærecancerceller selv) er i stand til å produsere cytokiner og kjemokin og er involvert i fremstillingen av kreftcelle antigener til celler i immunsystemet [27]. Faktisk har enkelte kjemokinreseptorer blitt oppdaget på uroteliale kreftceller [28]. Nylig har noen ligander for kjemokinreseptorer CXCR4 og CXCR7, har blitt funnet å bli utskilt av urothelial kreft i humane urinblæren [29]. Derfor har det blitt foreslått at urothelial kreftcellene har evnen til å fungere som antigenpresenterende celler (APC). Denne evnen ser ut til å være klinisk relevant som det ville påvirke tilbakefall av blærekreft [30].
Selv om mincle uttrykk i uroteliale tumorceller garanterer videre studier for å bedre forstå hvilken rolle denne reseptoren i blærekreft, har denne rapporten spennende kliniske implikasjoner i komparativ medisin. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) immunterapi er for tiden den mest effektive behandlingen av ikke-muskel invasiv blærekreft hos mennesker [31]. Selv om BCG har vært brukt til behandling av blærekreft i nesten 40 år, på hvilken måte den oppnår sin terapeutiske effekt forblir løpet av undersøkelsen [27]. Det har vist seg at blærecancercellelinjer er i stand til å internalisere BCG [32]. Det har blitt antatt at internalisering av BCG av blærecancerceller er styrt av tilstedeværelsen av visse ukjente onkogene avvik som aktiverer macropinocytosis [27]. Derfor kan blære kreftceller har en rolle i anskaffelse, og behandling av BCG, som fører til immunsystemet rekruttering; Imidlertid må patogenetisk mekanisme (r) bli belyst [27]. Toll-lignende reseptorer har blitt funnet på dyrkede normale og uroteliale tumorceller og kan ha en rolle i antitumor immunitet nonmuscle invasive svulster [33].
Mange spørsmål gjenstår fortsatt ubesvart og mange områder krever ytterligere etterforskning som studier har ikke evaluert ennå rollen som internalisering av BCG ved blærekreftceller
in vivo product: [27]. Vår studie gir oss mulighet til hypoteser om at funksjonell mincle reseptoren av neoplastiske urotelialceller kan ha en avgjørende rolle i å gjenkjenne og internalise BCG. Vårt forslag ser ut til å bli bekreftet av de siste rapportene viser at uttrykket av mincle bidrar til kontroll av
Mycobacterium bovis
BCG-infeksjon [34].
Fremtidige studier vil forhåpentligvis være svært nyttig å gi innsikt på rollen som mincle reseptoren av urothelial kreftceller i antitumorimmunterapi. I denne sammenheng kan mincle reseptoren bli undersøkt i dybden i naturlig forekommende bovine urothelial tumorer og kveg, kan tjene som en naturlig dyremodell. Det har vist seg at det er en høy grad av sekvensidentitet mellom det menneskelige og storfe form av mincle og de samhandler med ligander i en svært lik måte [35].
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. S1 sekvense etter kloning av Mincle fra heathy prøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0141624.s001 product: (PDF)
S2 Fig. S2 sekvense etter kloning av Mincle fra patologiske prøver
doi:. 10,1371 /journal.pone.0141624.s002 product: (PDF)
Takk
Vi takker professor A. Venuti , Istituto dei Tumori «Regina Elena», Roma, for å gi BPV-2 DNA plasmid; Prof. A.A. Alfieri, Laboratory of Animal virologi, Institutt for Veterinary Preventive Medicine, Universidade Estadual de Londrina, Brasil for å gi BPV-13 DNA-husing prøver og Dr G. Salvatore, Regione Basilicata, og Dr F. Luposella for deres teknisk hjelp.
