Abstract
Ervervet chemo-motstand er en av de viktigste årsaksfaktorer i kreftdødsfall. Emerging bevis tyder på at miRNA og epitelial-mesenchymale overgang spiller avgjørende roller i chemo-resistens i kreft. Her viste vi foreningen av paclitaxel-resistens med MIR-375 over-uttrykk og epitelial-mesenchymale overgang tilskyndelse i livmorhalskreft. Ved hjelp av ulike livmorhalskreft cellemodeller, har vi funnet at paclitaxel forbigående indusert oppregulering av MIR-375 uttrykk, hemming spredning, overgang fra epitelial til mesenchymale fenotype, og dermed svekket paclitaxel følsomhet. Tvunget overuttrykk av MIR-375 kan undertrykke Ecadherin uttrykk ved en direkte rettet mot veien, noe som førte til paclitaxel motstand. Derimot har re-uttrykk for Ecadherin delvis reversert epitel-mesenchymale overgang fenotype og MIR-375 indusert paclitaxel-motstand. Våre funn tyder på at paclitaxel-indusert MIR-375 over-uttrykk forenkler epitelial-mesenchymale overgangsprosessen via direkte rettet mot Ecadherin, hemming spredning, og dermed resulterer i chemo-motstand i livmorhalskreftceller. En reversering av MIR-375 eller Ecadherin uttrykk kan være en roman terapeutisk tilnærming for å overvinne cellegift-motstand i livmorhalskreft
Citation. Shen Y, Zhou J, Li Y, Ye F, Wan X, Lu W, et al. (2014) MIR-375 mediert ervervet Chemo-Resistance i livmorhalskreft ved å tilrettelegge EMT. PLoS ONE 9 (10): e109299. doi: 10,1371 /journal.pone.0109299
Redaktør: Zhi-Ming Zheng, National Institute of Health – National Cancer Institute, USA
mottatt: 28 oktober 2013, Godkjent: 10 september 2014; Publisert: 16 oktober 2014
Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke kontinuerlig økonomisk støtte fra Natural Science Foundation National of China (bevilgning nr 81172475 og 81172474), Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina Natural Science (gi No. Z2110056, LQ13H160005 og Y2110206). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Emerging bevis har vist at chemo-motstand er assosiert med epitelial mesenchymale overgang (EMT) i kreftceller, og oppkjøpet av cellegift-motstand i kreftceller er ledsaget av en overgang fra en epitelial til mesenchymale fenotype [ ,,,0],1] – [3]. For eksempel, forskjellige legemiddelresistente cancertyper som oxaliplatin-resistente kolorektale cancerceller [4], paclitaxel-resistente eggstokkreft celler [5], og gefitinib-resistente lungekreftceller [6], frem overgangen fra epiteliale til mesenchymale fenotype langs med et tap av epitel adhesjonsmolekyl Ecadherin og en gevinst på mesenchymale markører som vimentin, Ncadherin, og fibronektin. Nyere studier har også vist at kjemoterapi kan lette epiteliale til en mesenchymal fenotypisk forandring i rest overlevende kreftceller, som kan være en av de kritiske trinn i ervervet resistens i-kreft [7], [8]. Dermed blir tilegnelsen av EMT en viktig prosess som bidrar til ondartet fenotyper av kreftceller i resistens mot kjemoterapi. Derfor har intervensjonen av EMT prosessen blitt foreslått som en terapeutisk tilnærming mot ervervet cellegift-motstand.
microRNAs (mirnas) fungere som viktige gen regulatorer i menneskelige genomer og deres avvikende uttrykk kan fremme ikke bare Tumori-genesis og svulst aggressivitet men også motstand mot kjemoterapi [9]. Mer nylig, har studier vist at mirnas spille en vesentlig rolle i modulering av EMT, såsom MIR-200s som regulerer EMT gjennom inhibering ZEB1 /2, en repressor transkripsjon av Ecadherin [1], [10], [11]. Vi har nylig rapportert at uttrykket av MIR-375 ble redusert i livmorhalskreftceller [12] og håndheves over-uttrykk for MIR-375 signifikant hemmet spredning og blokkert G1-S cellesyklusen overgang [13]. I en annen studie vi videre observert at MIR-375 ble oppregulert i paclitaxel-behandlede cervical celler og vev, og tvunget over-uttrykk for MIR-375 sank paclitaxel følsomhet i livmorhalskreft [14]. Imidlertid gjenstår det nøyaktige molekylære mekanismen streke MIR-375 regulert legemiddelresistens å bli utforsket. Ved miRNA rettet genet prediksjon, fant vi en bindingssetet mellom MIR-375 og Ecadherin 3′-UTR, som indikerte at Ecadherin var en potensiell direkte mål på MIR-375. Derfor antar vi at MIR-375 kan delta i EMT regulering og ervervet paclitaxel-resistens i livmorhalskreftceller.
I denne studien fant vi for første gang at paclitaxel hemmer spredning, induserer EMT, og opp -regulates MIR-375 uttrykk samtidig i livmorhalskreftceller. Og MIR-375 over-uttrykk direkte hemmet Ecadherin uttrykk og tilrettelagt paclitaxel-motstand. Dermed er det en tydelig positiv feedback mekanisme blant paclitaxel, MIR-375, og EMT som fører til ervervet cellegift-motstand fenotyper i livmorhalskreftceller. Slike en regulerende feedback loop resultater i Mir-375 over-uttrykk, epiteliale til en mesenchymale fenotypisk transformasjon, og dermed tilegnelsen av paclitaxel-resistens. Uansett, det kan antas at en pause på en slik feedback loop ville, i hvert fall delvis, overvinne chemo -resistance i livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
De prøver av kreft vev ble samlet inn fra 23 til livmorhals plateepitelkarsinom pasienter med FIGO (2009) stadium IB
2 eller IIA
2 som gjennomgikk neo-adjuvant kjemoterapi etterfulgt av type III radikal hysterektomi mellom 1 november 2008 og den 30 mai 2010 i Women Hospital, School of Medicine, Zhejiang University. Samlingen av alle prøvene ble godkjent av etisk komité for klinisk forskning fra kvinner Hospital, School of Medicine, Zhejiang University og skriftlig informert samtykke ble innhentet.
Alle pasientene gjennomgikk 2 sykluser av intravenøs neo-adjuvant kjemoterapi ( paclitaxel 135 mg /m
2 og cisplatin 75 mg /m
2, 3 ukers intervall) før operasjonen. Effekten av kjemoterapi ble evaluert i henhold til de Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) [15] som tidligere beskrevet
14. Av alle 23 pasienter, gjennomsnittsalder var 36,5 år (spredning 20 til 65 år), hadde pre- og post-kjemoterapi livmorhalskreftprøver. Den angitte sammensetningen av hver prøvene ble bestemt av en erfaren patolog.
Cell kultur og EMT tilskyndelse
To menneskelivmorhalskreft cellelinjer, Siha og CaSki ble dyrket som beskrevet tidligere
14. Human rekombinant TGF-β1 og EGF-β ble oppnådd fra ProSpec-Tany Techno Ltd Gene (Israel), henholdsvis anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 5 ng /ml og 2 ng /ml. De kreftcellelinjer ble sådd ut 1 x 10
5 /brønn på 6-brønners plater og inkubert i serumfritt medium over natten, og deretter behandlet med TGF-β1 eller EGF-β i 72 timer henholdsvis, for å indusere EMT.
RNA Utvinning og real-Time RT-PCR
Totalt RNA inneholder mirnas ble hentet fra flytende nitrogen bevart vev eller de høstes cellene ved hjelp av en ml TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) følge produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert med PrimeScript RT reagent Kit (Takara Otsu, Shiga, Japan). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) for miRNA og mRNA ble utført som beskrevet tidligere
14. Sekvensene til alle primere er gitt i tabell 1.
Cell Proliferation Assay og MTS analysen
For å bestemme effekten av MIR-375 og paclitaxel på spredning av livmorhalscellelinjer, celle proliferasjon ble bestemt ved MTT-analyse og CellTrace CFSE celleproliferasjonsanalyse ved 24, 48, 72, henholdsvis 96 timer og 5 dager. For levedyktighet eksperimenter, livmorhalskreft celler med eller uten 10 nM paclitaxel-behandling i 72 timer ble platet ut (Siha, 3 x 10
3 /brønn i 96-brønners plate, og 2 x 10
5 /brønn i 6-brønns plate ; CaSki, 2 x 10
3 /brønn i 96-brønns plate og 1 x 10
5 /brønn i 6-brønn plate) og dyrket over natten. I MTT målings absorbansen av prøvene ble målt med et spektrofotometer avleser ved 490 nm. CellTrace CFSE celle proliferasjonsanalyse ble utført ved farging av aktiverte livmorhalskreft med CellTrace CFSE celleproliferasjon fargestoff (2,5 uM) (Invitrogen) og analyseres ved hjelp av flow cytometri med 488 nm eksitasjon og emisjonsfiltre. En in vitro paclitaxel chemo-følsomhet av livmorhalskreft-celler ble evaluert ved bruk av MTS-analyse (Promega, Madison, WI) som tidligere beskrevet [12]. Fire replikere brønner ble anvendt for hver analyse, og minst tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Western Blot analyse
Til sammen 50 mg protein ble separert ved denaturering 8-15% SDS-polyakrylamid- gelelektroforese. Western-analyse ble utført som tidligere beskrevet [12]. Filmene ble analysert ved densitometri med en VersaDoc Imaging System; Modell 3000 (BioRad) ved hjelp Antall ett-maskinen. Variansanalyse med Bonferroni korreksjon for flere tester ble anvendt for å bestemme signifikans. De primære antistoffer som ble brukt var anti-Ncadherin (1:5000), anti-Ecadherin (1:2000), anti-fibronektin (1:1000), anti-vimentin (1:1000) og anti-aktin (1:2000) som en endogen kontroll, alt fra Epitomics Bioteknologi (Epitomics).
Immunohistochemistry
Profiler (6 mikrometer tykke) av svulstvev ble kuttet fra paraffinised 23 par av selv-paret pre-og post-kjemoterapi livmorhalskreft prøver, og immunhistokjemi analyse og scoring ble beskrevet tidligere
12. De primære antistoffer som brukes for immunhistokjemi analyse var anti-Ecadherin antistoff (1:1000) og anti-aktin antistoff som en endogen kontroll (1:2000), begge fra Epitomics Bioteknologi (Epitomics).
Lentivirus konstruksjon og transfeksjon
For å generere MIR-375 og Ecadherin over-uttrykk stabile transfektanter ble livmorhalskreftceller transfektert med lentiviral uttrykke vektorer. Plasmidet konstruksjon og lentivirus pakken ble fullført i GENECHEM Company. De pre-MIR-375 sekvenser ble forsterket og klonet inn i pGCsil-GFP vektor ved hjelp av følgende primere: (fremover) HSA-pre-MIR-375-XhoI-F, ACCGCTC GAGCCCCGCGACGAGCCCCTCGC; (Revers) HSA-pre-mi-R-375-MfeI-R, ACCGCAATTGAAAAAGCCTCACGCGAGCCGAACG. HSA-CDH1 (CDS) genet ble forsterket og klonet inn i en PGC-FU-GFP vektor ved hjelp av følgende primere: (fremover) 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAG-3 «, (revers) 5′-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTCGTCCTCGCCGCCTCCGTACATG-3». Virus emballasje ble utført i HEK 293 T-celler etter kotransfeksjon av 20 mg pGCsil-GFP-pre-MIR-375 vektoren eller PGC-GFP-CDH1 vektor med 15 mg av emballasje plasmidet pHelper 1,0 vektor og 10 mg av konvolutten plasmidet pHelper 2,0 vektor bruker Lipofectamine 2000. virus ble høstet 48 timer etter transfeksjon, og virale titere ble bestemt. Den titer av viral brukt i denne studien var i størrelsesorden 5 × 10
8~2 × 10
9 TU /ml.
For å generere MIR-375 og Ecadherin over-uttrykk stabil transfektanter, livmorhalskreft-celler ble transfektert med lentivirale vektorer som uttrykker, som tidligere beskrevet [12]. En MOI = 5 ble anvendt for Siha og MOI = 10 ble anvendt for CaSki. Etter 4~7 d av transfeksjon ble stabile kloner valgt med GFP av flowcytometri og høstet for videre eksperimentering. En tom PGC FU-GFP-NC-LV vektor ble brukt som en negativ kontroll.
Luciferase aktivitetsanalyse
For å undersøke om CDH1 uttrykk ble regulert av MIR-375, en psicheck-to dual -luciferase miRNA target ekspresjonsvektor (psicheck-2 -UTR vektor) ble brukt til å utføre luciferase aktivitetsanalysen. Villtypen og mutante 3′-UTR av CDH1 inneholdende forutsagte MIR-375-bindingssete ble syntetisert og satt inn i det 3′-UTR-regionen nedstrøms for ildflue luciferase genet av psicheck-2 vektor (psicheck-2 -UTR) ved hjelp av Xho I og NotI I restriksjonsseter. Alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Etter kotransfektert med Mir-375 etterligner (20 UM) og reporter vektorer (0,2 mikrogram /ml), ble luciferase aktiviteter målt til 24 timer ved hjelp av en Dual-Glo luciferase assay system (Promega). Relativ luciferase aktivitet i alle tallene refererer til ildflueluciferase aktiviteter normalisert til Renilla luciferase. Verdier celler med tom psicheck-2 vektor ble satt likt for 1.
Statistical Analysis
Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. En uavhengig t-test eller en ANOVA ble brukt til å sammenligne kontinuerlige variabler. Pearsons korrelasjonskoeffisient test ble brukt til å vurdere korrelasjonen mellom to kontinuerlige variabler. P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Paclitaxel indusert EMT og hemmet spredning samtidig i livmorhalskreftceller
Når morfologi av rutinemessig dyrkede livmorhalskreftceller behandlet med eller uten paclitaxel ble undersøkt ved mikroskopi, observerte vi at Siha celle vokste så tett-pakket «brostein» -lignende epitelceller, mens celler behandlet med paclitaxel virket en spindel-lignende form flat og mistet de fleste av sine celle-celle kontakter. (Figur 1a) Samtidig ekspresjon av Ecadherin protein ble redusert (10,5% ~66.6% og 43,75% ~67.6% etter 5 nM til 20 nM paclitaxel behandling henholdsvis), og de uttrykk for Ncadherin og fibronektin protein ble øket på en dose-responsive måte. (Figur 1b) Lignende effekter ble også observert i CaSki celler. (Figur 1b, Figur S1).
(a) Synlige morfologiske endringer fra «brostein» -lignende til «fibroblast» -lignende celler ble observert i Siha etter 72 h paclitaxel behandling. De representative celler med morfologiske forandringer ble merket (b) Immunoblotting målte ekspresjonen av Ecadherin og andre EMT beslektede proteiner (vimentin, Ncadherin, og fibronektin) i cervikale kreftceller (Siha og CaSki) under forskjellige mengder (0, 5, 10, 20 nM) av paclitaxel-behandling. Ekspresjon av Ecadherin protein ble redusert og uttrykkene vimentin, Ncadherin, og fibronektin-protein ble øket i celler behandlet med paklitaxel i 72 timer på en doseresponsiv måte. Alle uttrykk for proteinene ble normalisert til ß-aktin, og dataene i stolpediagrammene er presentert som gjennomsnittet av trippelprøver fra tre uavhengige eksperimenter. Alle feilfelt angitt standardavvik (** P≤0.01, * p≤0.05). (C, d) forbigående inhibering celleproliferasjon og morfologiske endringer indusert av paclitaxel ble observert. Endringene spredning i Siha og CaSki-celler etter paclitaxel administrering ble analysert ved CellTrace CFSE celleformering (c) og MTT-analyse (d) ved 24 h, 72 h, 96 h, dag 5, dag 7, dag 14 og dag 21, henholdsvis. Spredning frekvensen av paclitaxel behandlet Siha og CaSki celler ble betydelig redusert på dag 7 og restaurert på dag 21 etter paclitaxel administrasjon. De overlevde CaSki celler ble restaurert til normal morfologi på dag 21 etter paclitaxel administrasjon.
Videre kan en forbigående celleproliferasjon hemming indusert av paclitaxel ble observert av flowcytometri og MTT. Siha og CaSki-celler ble rutinemessig dyrket med 10 nM paclitaxel, etter 72 timer, den paclitaxel ble fjernet og cellene ble dyrket med komplett medium kontinuerlig, hvorpå forandringene spredning i Siha og CaSki-celler før og etter paclitaxel administrering avslørt ved 24 timer, 72 h, 96 h, dag 5, dag 7, dag 14 og dag 21, henholdsvis. Som vist i figur 1c, 1d, formeringshastigheten av paclitaxel behandlet Siha og CaSki-celler på dag 7 ble signifikant redusert (Siha, p = 0,002 og p = 2,3 x 10
-5; CaSki, p = 3,1 x 10
-4 og p = 1,2 x 10
-5 henholdsvis), sammenlignet med den til blank kontroll, og tilbake til nivåene før behandling på dag 21. på samme tid, den «brostein» -lignende morfologiske endringer indusert av paclitaxel i levde celler ble også gjenopprettet til normal morfologi på dag 21. disse fakta indikerer at paclitaxel forbigående hemmer spredning og induserer EMT samtidig i livmorhalskreftceller, men alle disse paclitaxel-indusert forandringer reversert etter seponering.
paclitaxel up-regulerer MIR-375 under induserende EMT og spredning hemming
Vi hadde utforsket Mir-375 uttrykk skiftende involvert i paclitaxel indusert EMT og spredning hemming i livmorhalskreftceller, og den klare doseavhengig effekt av paclitaxel på MIR-375 over-uttrykk ble observert
14. Videre progressive oppregulert uttrykk for MIR-375 nådde en topp på dag 7 etter paclitaxel administrasjon, sank gradvis etter paclitaxel fjernet og restaurert til nivået før behandling på ca dag 21
14. I tillegg var det en sterk negativ korrelasjon mellom uttrykket av MIR-375 og den relative spredning andel av livmorhalskreftceller (Siha, r = -0,472, p = 1,52 × 10
-3, CaSki, r = -0,835 , P = 3,03 × 10
-4). (Figur S2) Våre data viste at paclitaxel oppregulert Mir-375 uttrykk og hemmet spredning samtidig i livmorhalskreftceller, men både paclitexel skapte endringer reversert etter seponering av legemidlet, noe som tyder på at noen av livmorhalskreftceller overleve i paclitaxel, sannsynligvis om opp- regulere MIR-375 uttrykk og anskaffe ondartede mesenchymale fenotyper, deretter utvikle et potensiale til å redusere spredning og motstå narkotika toksisitet. Disse korrelasjon tyder på at Mir-375 over-uttrykk kan ha en kausal rolle i kjemoterapiindusert EMT.
MiR-375 formidler EMT ved direkte rettet mot Ecadherin
Etter miRDB og TargetScan søkeprogrammer analyse, vi funnet en anslått binding av MIR-375 med CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR, som indikerte at Ecadherin var en potensiell direkte mål på MIR-375 (figur 2c). For ytterligere å konstatere at Ecadherin er et mål gen av MIR-375, vi først analysere forholdet mellom Ecadherin og Mir-375 uttrykk i livmorhalskreftceller under forskjellige mengder av paclitaxel behandling. Som vist i figur 1b og fig S2, MIR-375-ekspresjon i celler som var markert uregulert på en doseavhengig måte i løpet av paclitaxel-indusert EMT prosess, så vel som Ecadherin protein og MIR-375-ekspresjon ble omvendt korrelert (r = -0,752, P = 2,32 × 10
-4). Da vi videre brukt luciferaseaktiviteten Assay for å bekrefte binding av MIR-375 til det 3′-UTR av Ecadherin. (Figur 2c).
(a) Fase kontrast av livmorhalskreftceller infisert med pre-MIR-375 eller negativ lentivirus vektor og blank kontroll. (B) Immunoblotting måling av Ecadherin og EMT relaterte proteiner i livmorhalskreft tercells infisert med pre-MIR-375 eller negativ lentivirus vektor. (C) En spådd duplex dannelse mellom menneske CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR og MIR-375. En redusert luciferase-aktivitet ble observert etter kotransfeksjon av Ecadherin 3′-UTR villtype vektor med MIR-375, men ikke mutert eller tom vektor (p = 0,014). Dataene i a-c ble presentert som gjennomsnitt av tripletter prøver fra uavhengige eksperimenter. Alle feilfelt angitt standardavvik (** P≤0.01, * p≤0.05).
For å teste om oppregulering av MIR-375 bidro til paclitaxel-indusert EMT, effekter av MIR-375 over-uttrykk på disse hendelsene ble evaluert. Uttrykket av MIR-375 ble analysert ved real-time PCR på den andre uken, tredje uke og første måned etter pre-miRNA lentiviral stabil transfeksjon. Som vist i figur 2a og 2b, er tvunget over-ekspresjon av MIR-375 indusert EMT prosess i cervikale kreftceller, karakterisert ved anskaffelse av fibroblast-lignende cellemorfologi, undertrykkelse av Ecadherin uttrykket (65% ~69.2%), og forbedring av vimentin, Ncadherin, og fibronectin uttrykk, i likhet med de effektene som er observert i paclitaxel behandlede celler.
Dermed våre funn tyder på at Mir-375 over-uttrykk fremmer paclitaxel-indusert EMT dels ved direkte rettet mot Ecadherin i livmorhalskreft celler.
EMT regulerer paclitaxel sensitivitet, men ikke Mir-375 uttrykk
for å avgjøre om EMT kan regulere Mir-375 uttrykk omvendt, ble det neste settet med eksperimenter utført. Vi indusert EMT av TGF-β1 eller EGF-β i livmorhalskreftceller (Siha og CaSki) og observert påvirkning av EMT på paclitaxel følsomhet og Mir-375 uttrykk. Stimuleres av TGF-β1 eller EGF-β, cervikale kreftceller gikk EMT medfølgende synlige morfologiske endringer (figur 3a), slik som utseende av en spindellignende form i celler, og EMT markør endring, herunder redusert Ecadherin proteinekspresjon (28,5% ~ 65,8% for TGF-β1 og 47,5% ~67.6% for EGF-β), samt økt Ncadherin, vimentin, og fibronektin proteinekspresjon (figur 3c). Men uttrykket av MIR-375 ble ikke endret i løpet av TGF-β1 eller EGF-β indusert EMT prosess i livmorhalskreftceller (Siha,
p
= 0,538; CaSki
p
= 0,542) (Figur 3d).
(a) Synlige morfologiske endringer i Siha og CaSki henhold TGF-β1 eller EGF-β tilskyndelse. (B) MTS analyse av paclitaxel-følsomhet i livmorhalskreftceller. (C) Immunoblotting analyse av Ecadherin og andre EMT beslektede proteiner etter TGF-β1 eller EGF-β induksjon. (D) MIR-375 uttrykk i Siha og CaSki henhold TGF-β1 eller EGF-β tilskyndelse. Dataene i b-d ble presentert som gjennomsnitt av tripletter prøver fra uavhengige eksperimenter. Alle feilfelt angitt standardavvik (** P≤0.01, * p≤0.05).
Videre avgrenset vi stoffet følsomheten av celler som gjennomgår EMT bruker MTS analysen. Paclitaxel følsomhet ble signifikant redusert i Siha og CaSki-celler etter TGF-β1 eller EGF-β stimulering sammenlignet med serumfritt kultur kontroller (figur 3b). IC50-verdiene ble økt i Siha og CaSki med 5 ng /ml TGF-β1 (95,81 ± 2,53 henholdsvis nM og 66,66 ± 2,32 nM, Siha,
p
= 0,032; CaSki,
p
= 0.023) eller 2 ng /ml EGF-β stimulering (96,74 ± 2,47 henholdsvis nM og 94,78 ± 1,72 nM, Siha,
p
= 0,038; CaSki
p
= 0,028) sammenlignet med serum -Gratis kultur kontroller (24,54 ± 1,37 nM, og 23,98 ± 2,62 nM henholdsvis).
Våre funn tyder på at TGF-β1 eller EGF-β induserer EMT men dose ikke endre Mir-375 uttrykk i livmorhalskreftceller, og mesenkymale cellelignende cervikale kreftceller indusert ved TGF-β1 eller EGF-β er typisk paclitaxel resistente. Den betydelig oppregulert uttrykk for MIR-375 i paclitaxel behandles livmorhals Caner celler indusert av paclitaxel men ikke EMT.
Ecadherin over-uttrykk demper evnen MIR-375 for å megle EMT og paclitaxel-motstand
Ecadherin er ikke bare en viktig molekyl i initiering av EMT men også et kjennetegn for EMT og MIR-375 formidler EMT ved direkte rettet mot Ecadherin.To undersøke hvilken rolle Ecadherin i EMT og paclitaxel følsomhet og for å teste om oppregulering ofEcadherin kan demper effekten av MIR-375 på EMT og paclitaxel-resistens i livmorhalskreftceller; den Ecadherin over-uttrykt lentviral PGC-flagg-CDH1 vektor ble brukt. Vi henholdsvis transfektert Ecadherin over-uttrykt lentviral vektor og negativ kontroll i Siha og CaSki celler med og uten Mir-375 over-uttrykk, og observerte at effekten av tvang over-uttrykk Ecadherin på EMT og paclitaxel-motstand. I Ecadherin overuttrykkende kloner med og uten MIR-375-over-ekspresjon, var det en markert og betydelig økning i ekspresjonen av Ecadherin (figur 4a). I celler uten Mir-375 over-uttrykk, ble det ikke observert noen bemerkelsesverdige forskjeller i morfologi og mesenchymale markører i Siha og CaSki celler etter Ecadherin over-uttrykk, som sannsynligvis fordi foreldre cellene allerede utstilt en epitelial fenotype. Derimot har i celler med MIR-375-over-ekspresjon, var det en overgang fra isolerte fibrino-blastcellene til «brostens» -lignende epitelceller. I mellomtiden uttrykk for Ncadherin, vimentin, og fibronektin ble signifikant redusert etter Ecadherin over-ekspresjon (figur 4a, 4c).
Immunoblotting (a) og MTS (b) analyse av Ecadherin og andre relaterte proteiner i EMT Siha med og uten Mir-375 overekspresjon etter Ecadherin-uttrykke eller negativ lentivirus vektor transfeksjon. Data i (a) og (b) ble presentert som gjennomsnitt av tripletter prøver fra uavhengige eksperimenter. Alle feilfelt angitt standardavvik (** P≤0.01, * p≤0:05). (C) Morfologiske endringer i Siha med og uten Mir-375 over-uttrykk etter Ecadherin-uttrykke eller negativ lentivirus vektor transfeksjon. De representative celler med morfologiske endringer hadde blitt merket.
paclitaxel kjemoterapi-følsomhet ble deretter evaluert av MTS analyser. Som ventet ble paclitaxel følsomhet betydelig økt i Ecadherin lentvirus-transfekterte celler med og uten Mir-375 overekspresjon sammenlignet med kontrollceller. IC50-verdiene ble redusert i Siha og CaSki med Ecadherin overekspresjon (12,82 ± 2,54 nM og 7,62 ± 0,93 nM henholdsvis Siha,
p
= 0,043; CaSki,
p
= 0,038) sammenlignet med negative kontroller (20.73 ± 1.23 nm og 11,68 ± 0,62 nM henholdsvis Siha,
p
= 0,028; CaSki,
p
= 0,021). Videre paclitaxel motstanden var betydelig svekket etter Ecadherin var effektivt over-uttrykt i livmorhalsen med over-uttrykt MIR-375 sammenlignet med negativ kontroll (figur 4b). IC50-verdiene ble redusert i Siha og CaSki med henholdsvis Ecadherin og MIR-375 kotransfeksjon (22,82 ± 3,54 nM og 13,68 ± 0,64 nM, Siha,
p
= 0,033; CaSki,
p
= 0,038) sammenlignet med henholdsvis Siha og CaSki med negativ kontroll og MIR-375 kotransfeksjon (82,83 ± 2,23 nM og 20,31 ± 3,01 nM, Siha,
p
= 0,032; CaSki,
p
= 0,025 ). Våre resultater viste at Ecadherin over-ekspresjon betydelig forbedret paclitaxel følsomhet i livmorhalskreft celler med eller uten MIR-375-over-ekspresjon, noe som tyder på at Ecadherin overekspresjon øker dramatisk paclitaxel følsomhet, ytterligere, re-ekspresjon av Ecadherin reverseres, i det minste delvis, EMT fenotype og paclitaxel-resistens mediert av MIR-375 i livmorhalskreftceller.
MIR-375 over-uttrykk korrelerer med Ecadherin uttrykk i post-kjemoterapi menneskelige livmorhalskreft vev
For å etablere kliniske relevansen av MIR-375 mellom Ecadherin uttrykk henhold kjemoterapi effekter, vurdert vi MIR-375 og Ecadherin uttrykk i 23 par av selv sammen før og etter kjemoterapi menneskelige livmorhalskreft vev. Den immunofarging for Ecadherin åpenbart mer omfattende og sterkere ekspresjon i pre-kjemoterapi enn det i post-kjemoterapi tumorvev (figur 5). Samtidig ble MIR-375 markert oppregulert (4,67 ganger) i paclitaxel-behandlede livmorhalsprøver, ble Ecadherin og Mir-375 uttrykk omvendt korrelert i alle vev, inkludert pre-og post-kjemoterapi (r = -0,905, p = 1,81 × 10
-3) (tabell S1).
(a) Ecadherin og Mir-375 uttrykk ble omvendt korrelert i alle vev, inkludert pre-og post-kjemoterapi (r = -0,905, p = 1,81 × 10
-3). (B) Farging av human-spesifikke Ecadherin uttrykk i tre representanter (1 PD og 2 PR) (× 200). En redusert Ecadherin uttrykk ble vist i vev etter kjemoterapi (p = 0,0023).
Av alle 23 pasienter, 19 var chemo-sensitive og 4 chemo-motstand, er oppregulert uttrykk for MIR-375 mer betydelig i chemo-motstand pasienter sammenlignet post-kjemoterapi vev med deres selv paret før kjemoterapi vev (6,7 ± 2,3 ganger i chemo-motstand og 4,35 ± 0,63 fold i kjemosensitiv pasienter henholdsvis
p
= 0,033) . Men det skal sies at det ikke er nok strøm til å konkludere med at Mir-375 uttrykk er høyere i chemo-motstand pasienter, delvis på grunn av liten utvalgsstørrelsen for cellegift-motstand pasienter (N = 4).
diskusjon
Chemo-motstand er en av de viktigste årsaksfaktorer kreft tilbakefall og progresjon. Flertallet av kreftceller reagerer godt i første omgang å kjemoterapi, men etter hvert utvikler resistens følgende legemiddeleksponering. Vekst bevis har vist at kreftcellene gjennomgår EMT fremmer celleoverlevelse og motstandsdyktighet overfor kjemoterapi [3]. Selv om det har blitt rapportert at mirnas kan spille en viktig rolle i modulering av EMT [16]; imidlertid fortsatt detaljert forskriftskomité uutforsket. MIR-375 ble opprinnelig funnet å bli uttrykt i pankreatisk øy, hvor det regulerer sekresjonen av insulin og metabolisme av glukose [17]. Nylig ble MIR-375 identifisert som en viktig regulator i tumorgenesis og kreft progresjon; imidlertid presise funksjoner av denne miRNA fortsatt i stor grad uklar. MIR-375 ble identifisert som en tumor suppressor i de fleste kreftformer, som magekreft [18], [19], leverkreft [20], hode og nakke plateepitelkarsinom [21] og prostata kreft [22], men spiller et onkogen rolle i ERα-positiv brystkreft [23], i lunge adenokarsinom pasienter [24], og i HBV positiv HCC pasienter [25]. Dermed disse motstridende rapporter om sammenhengen mellom MIR-375 nivå og kreft foreslått en mer kompleks og muligens kreft spesifikke forhold. I en annen studie av oss, observerte vi sammenhengen mellom MIR-375 over-uttrykk og paclitaxel -resistance i livmorhalskreft
16. Her har vi direkte kobling MIR-375 til kjemoterapi-indusert EMT prosess i livmorhalskreft. Vi fant for første gang at paclitaxel hemmer spredning, induserer EMT, og opp-regulerer Mir-375 uttrykk på en doseavhengig måte samtidig i livmorhalskreftceller, men alle disse paclitaxel-indusert forandringer reversert etter seponering. Mekanistisk, ektopisk over-uttrykk for MIR-375 resulterte i redusert Ecadherin uttrykk og ledsaget av ervervet mesenchymale egenskaper og cellegift-motstand i livmorhalskreftceller. Dermed våre funn antydet at paclitaxel ikke eliminere alle livmorhalskreftceller og noen av gjenværende cellene kan overleve under legemiddeleksponering. Under denne prosedyren, de resterende livmorhalskreftceller med oppregulert Mir-375 uttrykk sannsynligvis ha et potensial til å erverve mesenchymale fenotyper, tregere spredning, og motstå narkotika toksisitet.
