Abstract
Bakgrunn og Mål
Sporadisk tykktarmskreft (CRC) utvikling er en sekvensiell prosess viser alder-avhengighet, ukontrollert epitelproliferasjon og redusert apoptose. Under juvenil vekst cellulær proliferasjon og apoptose er godt balansert, noe som kan bli forstyrret på aldring. Vårt mål var å korrelere proliferative og apoptotiske aktiviteter i aldring menneskelig kolonepitelet og tykktarmskreft. Vi testet også den underliggende molekylærbiologi om proliferation- og apoptose regulerende genuttrykk endringer.
Materialer og metoder
Kolorektal biopsier fra friske barn (n
1 = 14), sunn voksne (n
2 = 10), voksne adenomer (n
3 = 10) og CRC (n
4 = 10) hos voksne ble testet for Ki-67 immunhistokjemi og TUNEL apoptose analysen. Mitosis- og apoptose-relatert genekspresjon ble også undersøkt i friske barn (n
1 = 6), voksne (n
2 = 41) prøver og i CRC (n
3 = 34) i HGU133plus2. 0 microarray plattform. Målte endringer ble bekreftet med RT-PCR både på avhengige og uavhengige prøvesett (n
1 = 6, n
2 = 6, n
3 = 6).
Resultater
mitotisk indeks (MI) var signifikant høyere (p 0,05) i intakt juvenile (MI = 0,33 ± 0,06) og CRC prøver (MI = 0,42 ± 0,10) sammenlignet med friske voksne prøver (MI = 0,15 ± 0,06). I motsetning til dette ble apoptotisk indeks (AI) ble redusert hos barn (0,13 ± 0,06), og signifikant lavere i kreft (0,06 ± 0,03) sammenlignet med voksne, friske prøver (0,17 ± 0,05). Åtte proliferation- (f.eks MKI67, CCNE1) og 11 apoptose knyttet gener (f.eks TNFSF10, IFI6) hadde endret mRNA uttrykk både i løpet av normal aldring og kreftutvikling, hovedsakelig indusere spredning og redusere apoptose i forhold til friske voksne. Åtte spredning assosierte gener inkludert CCND1, CDK1, CDK6 og 26 apoptose regulerende gener (f.eks SOCS3) ble ulikt uttrykt mellom unge og kreft gruppene stort sett støtter uttalt cellevekst i CRC.
Konklusjon
Kolorektal prøver fra barn og CRC pasienter kan være preget av tilsvarende økte proliferativ og redusert apoptotiske aktiviteter sammenlignet med friske colonic prøver fra voksne. Derfor cellekinetiske forandringer i løpet av kolorektal kreftutvikling viser ukontrollert rejuvenescence i motsetning til den kontrollerte cellevekst i juvenil kolonepitelet
Citation. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et al. (2013) Sporadiske tykktarmskreft Utviklingen viser Rejuvenescence Angå epitelproliferasjon og apoptose. PLoS ONE 8 (10): e74140. doi: 10,1371 /journal.pone.0074140
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 19 mars 2013; Godkjent: 29 juli 2013; Publisert: 03.10.2013
Copyright: © 2013 Leiszter et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av ungarske Scientific Research Fund (Országos Tudományos Kutatási Alapprogram /OTKA-K /) 105530. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den normale cellefornyelse av sunn kolonepitelet tar ca 5 dager, gjennom celledeling, differensiering og apoptose.. Plasseringen av forskjellige typer av epitel-celler i kryptene er svært vanlig. Prolifererende celler for det meste befinne seg på grunnlag av krypter, differensierte celler i den midtre sonen, mens de apoptotiske celler er nær den luminale overflaten. Flere molekylære reaksjonsveier spille viktig rolle i den fysiologiske selvfornyelse av epitelceller i den humane tykktarmen [1] – [4].
Imidlertid er regulering av proliferative og apoptotiske mekanismer kan endres under normal aldring og kolorektal kreftutvikling. Aldring er en fysiologisk mekanisme som begynner etter unnfangelsen. Det påvirker nesten hver eneste celle i organismen med mulig unntak av stamceller og tumorceller. Makroskopiske og mikroskopiske forandringer er til stede i den aldrende mage-tarmkanalen inkludert tykktarmen [5] – [6]. Endringer i proliferativ aktivitet i løpet av aldring er analysert i dyremodeller i tidligere studier [7] – [8]. Ifølge resultatene av
Mandir et al
, har den mest intensive epitel regenerering (spredning og apoptose) er påvist hos unge rotter.; og forfatterne konkluderte med at dramatiske endringer i ung kolonepitelet kan være knyttet til intestinal utvikling. Imidlertid har normal gastrointestinal aldring ingen innvirkning på epitelial fornyelse [7]. Tvert imot, i alderen dyrepopulasjoner økt celleproliferasjon og redusert apoptose i kolonepitelet ble observert og antatt å lette ukontrollert celleproliferasjon og tumorgenese, noe som kan forklare den høyere forekomsten av kolorektal kreft hos eldre menneske [8].
Videre, noen av disse endringene kan også være relatert til tykktarmskreftutvikling. Endringer i epitelial cellevekst og programmert celledød ble også tidligere studert i forskjellige stadier av tykktarmskreftutvikling, men resultatene er ikke konkordant. Celleproliferasjon og apoptose kan bli feilregulert og ubalansert celleproduksjon og celle tap bestemme oppførselen til premaligne eller maligne lidelser og tumorvekst [9] – [12]
oppklaringsprosenten av adenomer og forekomsten av avansert. colorectal adenomer og kreft kontinuerlig heve etter fylte 40-50, viser sterk alder avhengighet [13] – [14]. Sporadiske tykktarm kreft slår ut det meste i den eldre voksne befolkningen på samme måte som mange neoplastiske og forstadier til kreft. I henhold til Vogelstein modellen [15], utvikler kolorektal kreft fra normal epitel via pre-maligne adenom i en flertrinns prosess som tar flere år. Foruten de genene (f.eks APC, KRAS, DCC og TP53) tradisjonelt innblandet i denne kreft progresjon modellen, har nylig nye gener med å endre mRNA uttrykk også blitt foreslått å være bidra til malign transformasjon av tykktarms epitel [16] -. [18]
Det er flere genetiske og epigenetiske forandringer som kan vise til en mulig sammenheng mellom aldring og kolorektal kreftutvikling. Opphopning av DNA mutasjoner og skader, promoter hypermethylation, endringer i DNA-reparasjon, telomerase aktivitet og cellenes stoffskifte kan i økende grad påvirke alderen bestander som fører til forhøyet celleproliferasjon og redusert apoptose, som kan kulminere til malign transformasjon og ukontrollert celledeling [19].
samtidig, flere mennesker og dyr studier har avdekket motstander regulering av enkelte molekylære stier under normal aldring og kreftutvikling. I motsetning til normal aldring, prolifererende kreftceller viser økt metabolisme, karakterisert ved kontinuerlig proliferativ aktivitet og de-differensiering, kan de produsere embryonale proteiner og er potensielt udødelig ved å rømme apoptose [20]. Spesielt apoptose regulerende proteiner viser tydelig uttrykk i senescent og kreftceller kjennetegnet ved nedregulering av apoptose-induserende tumor suppressor p53 protein [21] og Fas /CD95 protein [22] og overekspresjon av antiapoptotic proto-onkogen BCL-2 i kreft i motsetning til normale aldringsceller [23] – [25]. Onkogener som Ras, transkripsjonsfaktorer f.eks Myc, og vekst signaloverføringsrelaterte tyrosin-kinase-reseptorer, f.eks medlemmer av EGFR familien er oppregulert ved noen kreftformer, mens nedregulert i senescent celler [26] – [28]
Cancer utvikling kan betraktes som en lokal, ukontrollert «foryngelse» som inneholder de samme molekylære reaksjonsveier. men med motstridende regulering. Deregulerte celleproliferasjon og apoptose trasé kan tillate overlevelse fordeler for kreftceller mot tilstøtende senescent celler, på grunn av tapt evne til kreft for normal aldring [20]. Økt epitelcelleproliferasjon i mage-tarmkanalen kan sees ikke bare i kolorektal cancer, men også i embryonisk og juvenil utvikling. En viktig vei som spiller fundamentale roller både i tarmen utvikling og i sporadiske eller familiær kolorektal kreft er den Wnt /β-catenin signale [29] -. [30]
Som vi er klar over, er det ingen studie med fokus på spredning og apoptose regulering i juvenile menneskelige kolorektal epitel i forhold til normal aldring og kreftutvikling. Hensikten med denne studien var å analysere den proliferative og apoptotiske aktivitet i human kolonepitelet i løpet av normal aldring og kolorektal kreftutvikling både protein og gen-ekspresjon nivå. Kolorektal biopsier representerer ungdoms kontrollert vekst stadium, den voksne sunn status og ukontrollert kolorektal kreftutvikling ble testet for mulige sammenhenger.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Etter informert samtykke, colorectal biopsiprøver ble tatt under rutinemessig endoskopisk inngrep på andre Institutt for indremedisin og første Institutt for pediatri, Semmelweis University, Budapest, Ungarn. Til sammen ble 44 vevsprøver analysert i immunhistokjemisk undersøkelse (14 friske barn, 10 friske voksne, 10 adenomer fra voksne og 10 CRC fra voksne); 81 biopsiprøver ble analysert i microarray analyse (6 friske barn, 41 friske voksne og 34 CRC fra voksne); og 36 biopsiprøver var involvert i real-time PCR validering (12 friske barn, 12 friske voksne og 12 CRC fra voksne). Syttifem mikromatriser (de voksne prøver) hadde blitt hybridisert tidligere; sine datafiler ble brukt i en tidligere publiserte studier ved hjelp av ulike sammenligninger [31] – [32] og er tilgjengelig i Gene Expession Omnibus database (serie tiltredelse Nummer: GSE10714 og GSE37364). Datasettene av de nylig hybridiserte 6 mikromatriser er registrert på GSE37267 seriesjonsnummer. Kontroll barn ble henvist til poliklinikken med rektal blødning, forstoppelse eller kronisk magesmerter. Ileocolonoscopy var en del av deres diagnostiske prosedyren (utelukke organisk sykdom) og lige snitt viste normal makroskopisk utseende og histologi. Hver prøve ble verifisert av histopatologer.
For immunhistokjemi kolorektal biopsiprøver ble rutinemessig fast i formaldehyd og innebygd i parafinvoks. For mRNA studier ble koloskopi prøvene lagret i RNAlater Reagent (Qiagen Inc., Germantown, USA) ved -80 ° C før total RNA ekstraksjon for genekspresjon analyse og Taqman RT-PCR studien. Etiske godkjenninger (Nr .: 69/2008 og 202/2009) for denne studien ble utstedt av Regional and Institutional Committee of Science og forskningsetikk av Semmelweis University (Budapest, Ungarn). Skriftlig informert samtykke ble innhentet på forhånd fra alle voksne deltakere og fra pårørende, vaktmester, eller foresatte på vegne av mindreårige /barn godkjent av etiske komiteer. Detaljert clinicopathological spesifikasjon av pasientprøvene er oppsummert i
Tabell 1 Hotell og
Tabell 2
.
Immunhistokjemi for celledeling
arkiv~~POS=TRUNC prøver fra 14 histologisk normale colonic biopsier fra barn, 10 normal colonic biopsier fra voksne, samt 10 voksne adenomer og 10 CRC ble samlet under rutinemessig endoskopi. 1 mm diameter kjerner ble stanset ut fra parafinblokker av voksen prøver og samlet inn microarray (TMA). Fire mikrometer tykke seksjoner skåret både fra TMA og fra de enkelte barn biopsiprøver ble avvokset og rehydrert for immunfarging.
Etter antigen gjenfinning i en pH 9,0 Tris-EDTA-buffer ved bruk av en mikrobølgeovnen ved 900 W i 10 min og deretter ved 370 W i 40 min, blokkering av endogene peroksidaser i 1% hydrogenperoksyd oppløst i metanol, og av ikke-spesifikke bindingssteder ved bruk av 1% bovint serumalbumin i 20 min hver ble utført. Glassene ble inkubert med muse-monoklonalt anti-Ki-67-antistoff (klon: MIB-1, 1:100, Dako, Glostrup, Danmark) i 60 minutter i et fuktet kammer og deretter med anti-mus IgG F (ab «)
2 Alexa Fluor 546 konjugert (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for 30 min.
apoptose deteksjon ved hjelp av TdT-mediert dUTP Nick End Merking (TUNEL) assay
etter spaltning med proteinase-K (20 pg /ml, 20 min), 50 ul TUNEL (TUNEL In Situ celledød Detection Kit, fluorescein, Roche, 11,684,795,910) reaksjons~~POS=TRUNC blandingen~~POS=HEADCOMP (5 ul TdT enzym + 45 ul dUTP) ble tilsatt til vevssnitt og TMA lysbilder. Deretter ble prøvene inkubert i et mørkt fuktet kammer ved 37 ° C i 120 minutter. Cellekjerner ble farget med Hoechst (5 pl Hoechst fargestoff + 10 ml TBS, 1 min, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA).
Opptelling av mitotisk og apoptotisk indeks i digitale lysbildene
Farget biopsiprøver og TMA lysbilder var digitalisert med et høyoppløselig digitalt scanner (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Ungarn) med flerlags fluorescerende skanning med høy numerisk apertur (0,8) × 20 objektiv og et stort dynamisk område AxioCam MRM Rev.3 svart-hvitt kamera koblet til skanneren. Digitale lysbilder ble tilgjengelig via en dataskjerm og analysert ved hjelp av Pannoramic Viewer-programvaren (versjon 1.11.43.0). Marker Counter programvaremodul som resulterer i permanente markeringer på de telte celler ble brukt til å beregne relative forholdet mellom proliferative, apoptotiske og normale celler.
Ki-67, tunel og Hoechst, positive dukket opp alt som sterke kjerne merking i lysbilder. Avhengig av utvalgsstørrelse, ble 500-1000 epitelceller telles i langsgående godt orientert krypter. Vi har bestemt proliferative-apoptotiske ratio (PAR: forholdet mellom proliferative og apoptotiske celler i krypter), den mitotiske indeksen (MI: forholdet mellom proliferative celler og totalt telte celler i krypter) og apoptotisk indeks (AI: Forholdet apoptotiske celler og totalt telles celler i krypter).
mRNA microarray uttrykk analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Antall isolert RNA ble karakterisert ved å måle absorbans (Nanodrop ND-1000 spektrofotometer, Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, USA). Kvaliteten på isolert RNA ble testet med kapillær gelelektroforese (2100Bioanalyzer og RNA 6000 Pico Sett /Agilent Inc., Santa Clara, CA, USA /). Biotinylated Crna prober ble syntetisert 1-8 mikrogram total RNA og fragmentert hjelp av One-Cycle Target Merking og kontroll Kit (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf), i henhold til Affymetrix beskrivelse. Tyve mikrogram av hvert fragmentert cRNA prøve ble hybridisert til HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) ved 45 ° C i 16 timer. Lysbilder ble vasket og farget ved hjelp av lufthåndtering Station 450 og antistoff forsterkning farging metode i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescent signalene ble oppdaget av Genechip Scanner 3000 (Affymetrix).
TaqMan RT-PCR
Etter microarray genekspresjonsanalyser, ble resultatene sammenlignet med andre tilgjengelige datasettene i Gene Expression Omnibus databank (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; serie sjonsnummer er GSE18105). TaqMan polymerase chain reaction ble brukt til å måle mRNA uttrykk av 12 utvalgte gener, som deltar i regulering av cellesyklus, spredning eller apoptose, på originale (6 histologisk intakte barn, seks histologisk intakt voksen og 6 CRC voksne prøver) og uavhengige sett med prøver ( 6 histologisk intakte barn, seks histologisk intakt voksne, 6 CRC voksne prøver). 18S ribosomalt RNA og GAPDH ble brukt som referanse.
Totalt RNA ekstraksjon, kvalitet og kvantitet kontroller ble utført som beskrevet tidligere. Bruke High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit med RNase Inhibitor, en mikrogram total RNA per prøve ble reverstranskribert (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Kvaliteten på cDNA ble sjekket av SDHA real-time PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Sveits). Da 16,7 ng cDNA mal per prøve ble brukt til uttrykk analyse av utvalgte gener med TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies). Målingen ble utført på LightCycler 480 (Roche) med hvitt Farge Hydrolyse Probe /UPL Probe deteksjon format. Etter denaturering ved 95 ° C i 10 minutter ble 40 PCR-sykluser utført (amplifisering ved 95 ° C i 15 sek, og ved 60 ° C i 1 min).
Statistisk vurdering
for statistisk analyse av Ki-67 farging og TUNEL RESULTATER ANOVA test og Tukey HSD post-test ble brukt. I begge metoder vesentlige kriterier var p. 0,05
For mRNA uttrykk profiler de Affymetrix uttrykk arrays ble hovedsakelig pre-behandlet av GCRMA bakgrunn korreksjonsmetode med quantile normalisering og median polsk samandrag. SAM analyse ble brukt for bestemmelse av proliferation- og apoptose regulerende gener med å endre mRNA uttrykk. Følgende SAM kriterier ble brukt: LogFC≥abs 1, p-verdi 0,05. Alle disse genene ble sammenlignet og forskjellig uttrykt som ble nærmere undersøkt. Uttrykket av hvert valgte gen mellom ulike utvalgsgrupper ble videre analysert ved ANOVA og post-test Tukey HSD
Datasettene er tilgjengelig i Gene Expression Omnibus databank (http:. //www.ncbi.nlm.nih gov /geo /), serien deponeringsnummer:. GSE10714, GSE37364 og GSE37267
For real-time PCR validering 12 prøver ble analysert i hvert trinn (barn, friske /normale voksne og voksen CRC). For normalisering, ble 18S ribosomalt RNA brukt som intern kontroll. For statistisk analyse ble brukt ANOVA test og Tukey HSD post-test. Følgende kriterier ble brukt: Brett change≤0.5 eller Fold change≥2 og p-verdi 0,05
Resultater
spredning og apoptose i juvenile, normal voksen, adenom og kolorektal karsinom prøver
prolifererende epitelceller ble hovedsakelig er lokalisert ved bunnen av kryptene samtidig apoptotiske celler var i nærheten av den luminale overflate i normal tarmslimhinne
(
Figur 1
)
. Proliferativ-apoptotiske forhold (PAR: forholdet mellom proliferative og apoptotiske epitel-celler i krypter) og MI var signifikant høyere hos barn (PAR = 3,51 ± 2,49, MI = 0,33 ± 0,06) og CRC prøver (PAR = 9,83 ± 7,72, MI = 0,42 ± 0,10) enn hos friske voksne prøver (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) (p 0,05). De viste kontinuerlig økning i løpet av adenom-karsinom-sekvensen (ACS). PAR var 3,99 ganger høyere hos friske barn kolonepitelet og 11,17 ganger høyere hos CRC som sammenlignet med friske voksne epitel; og PAR var 2,8 ganger høyere i CRC i motsetning til de juvenile prøvene. Basert på våre immunhistochemical resultater, MI var 2,2 ganger høyere hos barn og 2,8 ganger høyere i CRC forhold som til sunn normal, og 1,27 ganger høyere hos CRC i motsetning til unge prøver. Den høyeste PAR og MI ble funnet i kolorektal kreft prøver
(
Figur 2
)
.
blå flekker representerer kjernen av inaktive celler. Bilder ble tatt med digitalt mikroskop: normalt barn vev (Ch), normal voksen vev (N), adenom (Ad) og karsinom (CRC) i voksen. Mitotisk aktivitet avtar under aldring og øker i løpet av ACS i motsetning til apoptotisk aktivitet.
PAR og MI reduksjon under aldring og øker under kreftutvikling, i motsetning til AI.
AI ble redusert hos friske barn prøvene (0,13 ± 0,06), og signifikant lavere i kolorektal kreft prøvene (0,06 ± 0,03) enn i de histologisk intakte voksne colonic prøver (0,17 ± 0,05) (s 0,05). AI viste kontinuerlig nedgang i parallell med kolorektal ACS. Apoptotiske indeksen ble påvist 0,76 ganger lavere hos barn, og 0,35 ganger lavere i CRC sammenlignet med friske normale prøver; og det var 0,46 ganger lavere i CRC sammenligne med juvenile prøver. Den laveste AI ble påvist i kolorektal kreft prøver
(
Figur 1
–
2
).
Betydelig endring i proliferativ aktivitet ble ikke funnet mellom friske voksne colonic slimhinnen (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) og adenom prøver (PAR = 1,45 ± 0,89; MI = 0,13 ± 0,05); mens AI ble funnet å være betydelig lavere i adenom prøver (Normal AI = 0,17 ± 0,05; Adenom AI = 0,10 ± 0,04) (p 0,05).
Uttrykk for proliferation- og apoptose regulerende gener i juvenile , normal voksen og tykktarmskreft prøver
mRNA uttrykk av 117 spredningsregulerende gener ble undersøkt i HGU133 Plus2.0 mikromatriser. Genekspresjon av 5 prober (som hører til 4 gener) endres i løpet av aldring alene i histologisk intakt kolon mukosa; mRNA uttrykk av 18 prober (tilhørighet til 13 gener) ble endret i løpet av kolorektal kreftutvikling; og 11 sonder (som tilhører 8 gener /BRCA1, CCNB1, CCNE1, CDC20, Cdk1, CDKN2B, MKI67 og TFDP1 /) ble ulikt uttrykt i både gruppe av prøver (
figur 3A
). Tilsvarende genuttrykk av 534 apoptose regulerende gener ble også analysert i denne studien. mRNA-ekspresjon av 15 prober (som hører til 9 gener) endres i løpet av aldring alene i histologisk intakt kolon mukosa; 46 prober (som tilhører 32 gener) viste endringer i løpet kolorektal kreftutvikling; og 12 prober (som hører til 11 gener /ACVR1B, BRCA1, CHEK2, DYRK2, IFI6, SERPINB9, SFRP1, SOCS3, SST, TNFSF10 og Zak /) ble ulikt uttrykt i både gruppe av prøver
(
Figur 3B
)
.
på kartet varmen, er økt genekspresjon representert med røde linjer, mens redusert uttrykk med grønt. De første 6 prøvene med lyseblå viser gener hos barn, den mørkeblå er fra friske voksne, mens de siste prøvene i grønt er fra kreftpasienter.
genuttrykk endringer mellom juvenil og CRC prøver
Proliferation- og apoptose regulerende gener ble undersøkt videre for å finne gener med ulik mRNA uttrykk som kan forklare forskjellene mellom de kontrollerte og ukontrollerte celle spredning. Tolv sonder som tilhører 8 spredning kontrollerende gener (BCL2, CDKN2B, RAD9A, BRCA2, CCND1, Cdk1, CDK6 og RBL1)
(
4A
)
og 26 apoptose regulerende gener (AIFM2, AIFM3, BTK, CIDEB, CIDEC, DAPK2, MAL, NLRP1 (LOC728392), SFRP1, SIVA1, SPN, SST, TR53I3, TNFRSF25, ANXA1, CBX4, CASP4, INHBA, MYC, PLAGL2, PMAIP1, POLB, PROK2, SOCS3, TNFRSF10B og ZAK) med 39 sonder
(
4B
)
viste signifikant endring mellom barn og kreft grupper, i henhold til p-verdi .
på kartet varmen, er økt genekspresjon representert med røde linjer, mens redusert uttrykk med grønt. De mørke blå prøvene er fra friske barn colonic slimhinnen (Ch) og den lyseblå er fra kolorektal kreft prøver (CRC).
Validering av genuttrykk ved bruk av TaqMan RT-PCR
mRNA uttrykk av 10 gener inkludert CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1, CCNE1, ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 og SERPINB9 ble validert med TaqMan RT-PCR
(
Tabell 3
)
.
Ifølge resultatene av microarray analyse av spredningsregulerende gener (CDKN2B, MKI67, CDC2 /Cdk1 og CCNE1), betydelige mRNA uttrykk endringer ble oppdaget av verdien av Brett endringer (FC≤0.5 eller FC≥2) og ANOVA-test (p 0,05) hos barn vs. Normal og Normal vs. CRC sammenligninger; og disse resultatene ble også bekreftet med Tukey-test i tilfelle CDC2 /CDK1 og CCNE1. PCR validering bekreftet tendensen av genuttrykk endringer i alle tilfeller med hensyn til regulering spredning. CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 og CCNE1 viste border betydelige mRNA uttrykk endringer i tidligere nevnte sammenligninger, ifølge Fold endring. Tukey post-test rekruttert genuttrykk endringer i løpet av aldring og kolorektal kreftutvikling i tilfelle CDC2 /CDK1 (p 0,05).
Tall av apoptose regulerende gener (ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 og SERPINB9) Det ble også analysert ved RT-PCR. Genekspresjon av ACVR1B, TNFSF10 og DYRK2 var signifikant lavere hos barn og CRC prøvene i forhold til normal voksen colonic slimhinne (FC≤0.5 eller FC≥2; p 0,05); og disse resultater ble bekreftet ved RT-PCR i tillegg. I henhold til resultatene av Affymetrix studie, mRNA ekspresjon av anti-apoptotiske gener, slik som SOCS3, IFI6 og SERPINB9, viste signifikant høyere ekspresjon hos barn og CRC prøvene i forhold til det histologisk intakt voksen colonic prøver. PCR validering bekreftet tendensen av genuttrykk endringer mellom barn vs voksen Normal og Adult Normal vs. CRC. ANOVA og Tukey-test analyse av RT-PCR resultatene har bekreftet disse endringene i tilfelle SOCS3 og IFI6 (p 0,05). Expression endringer av utvalgte gener er oppsummert i
Tabell 4
.
Diskusjoner
Aldring er assosiert med økt forekomst av sporadisk kolorektal kreftformer, som er en av de viktigste årsakene til dødelighet i vestlige land [33]. Kolorektal kreft er knyttet til ukontrollert celleformering og feilregulert apoptose. Juvenile vekst, på den annen side, er karakterisert ved en kontrollert vekst, cellulær proliferasjon og apoptose [34].
I denne studien ble den proliferative og apoptotiske aktivitet i intakte human kolorektal epitel fra barn og voksne i forhold til det i adenom og tykktarmskreft ble undersøkt. Uttrykk for de relaterte gener ble også testet i mRNA mikromatriser. Vi fant en økt proliferative og en redusert apoptose aktivitet hos barn og kreftprøver i forhold til normal voksen epitel.
Disse resultatene tyder på en motstander molekylær regulering av spredning og apoptose under normal aldring og kolorektal kreftutvikling. Forbedret mobilnettet spredning av kreftceller uten «aldrende» kan bidra til deres overlevelse fordel over tilstøtende senescent celler.
En økt celleproliferasjon påvises hos barn tykktarmsslimhinnen kan være relatert til den fysiologiske veksten av tykktarmen imidlertid cellefornyelse bremser ned under normal aldring i histologisk intakt voksen colonic krypten. Celleproliferasjon og apoptose regulering mellom kontrollert vekst i barndommen og ukontrollert vekst i CRC har ikke blitt korrelert før i colonic slimhinnene. Her fant vi flere spredning fremme gener inkludert cyclin B1 /CCNB1 /, cyclin E1 /CCNE1 /og cyclin-avhengig kinase (CDK1) som skal oppreguleres både hos unge og kreftprøver i forhold til normal voksen slimhinne (
Figur 3
). Disse resultatene korrelerer godt med vår å finne betydelig høyere prolifererende cellefraksjoner hos barn og seksjoner kreft vev sammenlignet med normale voksne prøver. CDK, faktisk har avgjørende rolle i reguleringen av cellesyklusen og vekst i eukaryote celler. CDK-komplekser er et høyt konservert familie av Ser /Thr proteinkinaser, som består av en katalytisk CDK subenhet og en aktiverende cyclin subenhet. Forskjellige CDK kan styre forskjellige deler av cellesyklus; Disse kompleksene kan bli aktivert ved fosforylering, bindingsaktive cykliner eller inhiberer subenheter [35] – [36]. CCNB1, CCNE1 og Cdk1 uttrykk, som kan relatere til økt proliferativ aktivitet, var høyere hos barn og neoplastisk colonic slimhinnene i forhold til normal voksen slimhinne. Videre cyclin D1 (CCND1), Cdk1 og CDK6 mRNA nivåene var signifikant høyere hos CRC sammenlignet med normale barn prøver, noe som kan være relatert til den ukontrollerte celleformering i kreft (
Figur 4
). Cyclin D1 har flere regulerende effekter i normal cellulær differensiering, vekst og metabolisme; imidlertid, overekspresjon av CCND1 er en av de hyppigst observerte forandring i humane kreftformer, da det har cellesyklusregulerende effekter i G1 fase [37]. I henhold til
Zhang et al.
Resultater, kan den unormale oppregulering av cyclin D1 være en tidlig begivenhet i tarm karsinogenese [38].
Sahl et al.
Har undersøkt uttrykk for ulike cyclin-avhengige kinaser i menneskets tykktarm kreft. De observerte at aktiveringen av CDK1, CDK2 og CDK6, som kan fosforylere retinoblastom-protein, noe som resulterer i frigjøring fra inhiberingen av fremover progresjon av G1 fase, er i forbindelse med human kolorektal kreft [39].
det er flere regulatoriske molekyler som kan modulere og blokkere funksjonen av CKDs, kalt cyklin-avhengige kinase-inhibitorer. I vår nåværende studie undersøkte vi de mRNA uttrykk endringer av CDKN2B i prosesser av aldring og kolorektal kreftutvikling. CDKN2B er også kjent for eksempel flere tumor suppressor 2 (MTS2), cyklin-avhengige kinaser 4 og 6 bindende protein eller p15-INK4b (p15). CDKN2B ligger ved siden av tumor suppressor CDKN2A i kromosomet 9, som ofte mutert og slettet i en rekke forskjellige neoplasmer. Dette genet koder for et cyklin-avhengig kinase inhibitor som kan fremstille komplekser med CDK4 og CDK6, inhibering av cellevekst eller cellesyklus. I microarray analyse moderat mRNA uttrykk for CDKN2B ble funnet i godt kontrollerte, hyper-proliferative colonic biopsiprøver fra barn i forhold til histologisk intakt voksen colonic slimhinner, og en bemerkelsesverdig genekspresjon reduksjon ble observert i CRC prøver (
Figur 3
). I henhold til tidligere studier, kan CDKN2B virke som et tumorsuppressorgen og en potensiell effektor av TGFp-indusert cellesyklus-stans [40].
Herman et al.
Sertifisert som genet Slå av p15 ved CpG island hypermethylation kan forårsake neoplastiske lidelser [41]. Betydelig tap av disse gener «funksjoner kan bidra til ukontrollert celleformering i CRC.
I immunhistokjemisk analyse, en moderat nedsatt apoptotisk aktivitet ble funnet hos friske barn kolorektal biopsiprøver sammenlignet med friske voksne, og det ble dramatisk redusert i i løpet av adenom-karsinom-sekvensen. mRNA uttrykk endringer av apoptose-induserende eller hemmende gener analysert i vår studie (f.eks ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 og SERPINB9) kan forklare dette fenomenet.
