Abstract
G-proteinkoblet reseptor (GPCR), Cysteine (C) -XC reseptor 4 (CXCR4), spiller en viktig rolle i prostata cancer metastase. CXCR4 er generelt ansett som en plasma membran reseptor hvor det sender signaler som støtter transformasjon, progresjon og eventuelle metastaser. På grunn av den sentrale rollen til CXCR4 i tumorgenese, terapeutiske tilnærminger for eksempel antagonist og monoklonale antistoffer er rettet mot reseptorer som befinner seg på plasmamembranen. En voksende konsept for G-protein koblede reseptorer, er at de kan lokalisere til og forbinder med kjernen hvor de beholder funksjon og megle kjernesignalering. Heri, viser vi at CXCR4 knyttet til kjernen av ondartet prostatakreft vev. Likeledes ekspresjon av CXCR4 ble påvist i atomfraksjoner blant flere prostata cancer-cellelinjer, sammenlignet med normale prostata epitelceller. Våre studier identifisert en kjernefysisk pool av CXCR4 og vi definert et kjernefysisk transportveien for CXCR4. Vi avslører en antatt kjernefysiske lokalisering sekvens (NLS), «RPRK», innen CXCR4 som bidro til kjernefysiske lokalisering. I tillegg atom CXCR4 samhandlet med Transportinβ1 og Transportinβ1-binding til CXCR4 fremmet sitt atomtrans. Viktigere, G
ai immunoutfellingsstudier og kalsium mobiliserings studier indikerte at atom CXCR4 var funksjonelle og deltok i G-protein signalering, avsløre at den kjernefysiske pool av CXCR4 beholdt funksjon. Gitt forslaget om at funksjonelle, kjernekraft CXCR4 kan være en underliggende mekanismen prostatakreft tilbakefall, økt metastatisk evne og dårligere prognose etter svulster har blitt behandlet med terapi som er rettet mot plasmamembran CXCR4, disse studiene omhandler en ny mekanisme av kjernesignalering for CXCR4, en roman mekanisme for klinisk målretting, og demonstrere en aktiv kjernefysisk basseng som gir ny og viktig informasjon for å belyse hva som har vært primært kliniske rapporter om atom CXCR4
Citation. Don-Salu-Hewage AS, Chan SY, McAndrews KM, Chetram MA, Dawson MR, Bethea DA, et al. (2013) Cysteine (C) -X-C Receptor 4 gjennomgår Transporter 1-Dependent Nuclear Lokalisering og Forblir Funksjonell ved Nucleus av metastatisk prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (2): e57194. doi: 10,1371 /journal.pone.0057194
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 20 november 2012; Godkjent: 18 januar 2013; Publisert: 28 februar 2013
Copyright: © 2013 Don-Salu-Hewage et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet, delvis ved National Institutes of Health gir 2R25GM060414, P201MD002285 (CVH), F31CA153908 (MAC), 2G12RR003062-22 (CVH) og AAAS kvinner International Research Collaboration (WIRC) for Minoritets Serving Institutions (MSI), en National Science Foundation grant (CVH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til økt kreftforekomst og kreftrelaterte dødsfall blant menn i USA [1], [2]. Til tross for behandling, er høy dødelighet ved PCA tilskrives metastaser, som er den viktigste hindringen ved PCA behandling [3]. Flere molekyler og mekanismer bidrar til kreftcelle metastasering. For eksempel, kjemotiltrekkende cytokiner (kjemokiner) forbedrer metastatisk potensial av PCa ved å binde og aktivere en familie av G-protein-koblede reseptorer (GPCR) [4], [5], [6], [7] som initiere signaler for å forbedre celle vedheft, invasjon og bevegelse, og senere, svulst overlevelse på det nye nettstedet for metastasering. GPCR utgjør den største familie av transmembrane plasmamembranen (PM) reseptorer [8]. Ved konvensjonell GPCR signalering, blir reseptorer lokalisert til PM og påvirke aktiviteten av PM-lokaliserte enzymer, ionekanaler, og /eller andre budbringere. Deres aktivering ved en passende ligand utløsere for signalisering gjennom G-protein a-(G
α) og /eller beta-gamma (G
βγ) subenheter [9], som fører til kontekstavhengige utfall, noe som kan positivt og /eller negativt regulere aktiviteten av effektor molekyler i signale kaskader av intracellulære [10], [11]. I tillegg aktiverte GPCR også utløse en serie av molekylære interaksjoner som gjør det mulig for tilbakemelding regulering av G-protein kobling og reseptor endocytose for å dempe reseptor-signaler [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], [18]. Müller
et al
. opprinnelig beskrevet involvering av chemokin GPCR reseptorer i kreft metastase [19] og Akashi
mfl.
rapportert at chemokine GPCR, CXCR4, ble sterkt uttrykt i menneskelig ondartet PCa forhold til normal prostata [20]. Tallrike studier har dokumentert involvering av CXCR4 i viktige trinnene PCa metastase: (i) signal; [21], [22]; (Ii) invasjon og migrasjon [23]; og (iii) etablering av et vaskulært nettverk [24]. Derfor har flere terapeutiske midler for cancercellemetastasering er konstruert for å antagonisere CXCR4-mediert signalisering [25], [26]. Ved konvensjonell CXCR4 signalering, stromal celle-avledet faktor 1 alfa (SDF1α) er den eneste ligand for CXCR4 [27], noe som fører til aktivering av trasé gjør denne reseptoren gunstig til tumorgenese: (i) G-proteinkoblet reseptor (GPCR) signale ; (Ii) PI3K /AKT; (Iii) MAPK; (Iv) JAK /STAT; (V) Src kinase og (vi) HER2 [28], [29], [30].
Interessant, GPCRs er påvist i subcellulære organeller forskjellige fra sin klassiske PM stedet [31]. Disse organeller omfatter Golgi-apparatet [32], endoplasmatiske retikulum [33], cytoskjelettet [34] og kjernen /kjernemembranen [35]. Hanyaloglu og von Zastrow postulert at standard resirkulering av GPCR ved endosomes kan bidra til økt omlevering av GPCR til PM, eller til alternative organeller i cellen, uten å ødelegge deres signale kapasitet [36]. Likevel, disse vekselvis-lokaliserte GPCR-reseptorer avdekke et nytt nivå av kompleksitet som kan være viktig ved modulering av deres funksjon. Et økende antall GPCRs har blitt observert i kjernen eller kjernemembranen, slik som lysofosfatidisk-reseptorer, metabotrope glutamatreseptorer, blodplateaktiverende faktor reseptorer, angiotensin 2 type I reseptorer, prostaglandin reseptorer, endotelin reseptorer, gonadotropinfrigjørende hormon type I reseptor [ ,,,0],37] og
β
adrenerge reseptorer [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. Kjernefysiske GPCR er blitt foreslått for å regulere en rekke fysiologiske prosesser, inkludert celleformering, overlevelse, inflammatoriske responser, tumorgenesis, DNA-syntese og transkripsjon [43], [45], [46], [47], [48], [49 ], [50]. Atom GPCRs kan være konstitutivt aktiv, eller aktiveres av interne, nylig syntetiserte ligander som er bundet for sekresjon [51]. Deretter klassiske andre messenger signalveier, for eksempel adenylylcyklase-indusert proteinkinase A (PKA) aktivering [38], fosfolipase-indusert frigjøring av intranuclear kalsium, diacyglycerol-indusert protein kinase C (PKC) [39], [52], ERK1 /2, p38 MAP-kinaser og proteinkinase B (PKB) [49], [50] er blitt vist å bli aktivert av atom GPCR.
Nuclear lokalisering av proteiner er diktert ved kjerne import og eksport gjennom kjerne pore komplekser [53]. Små proteiner ( 30-50 kDa) kan passere gjennom kjernefysiske pore ved fri diffusjon; Men de fleste cargoproteiner krever aktiv transport for å gå inn i kjernen [54]. Større proteiner bruke aktive transportmekanismer, som krever assistanse av transportproteiner [55], [56], [57]. Mange proteiner rettet mot kjernen inneholde en klassisk kjernefysiske lokalisering signal (NLS) som er anerkjent av en heterodimer import reseptor består av importin alfa og importin beta. Mange av disse reseptorene direkte gjenkjenne cargoproteiner og målrette dem direkte til kjernefysiske pore [58]. I tilfelle av denne store familie, målrettingsignaler innenfor cargoproteiner er ofte ikke veldefinert [59]. Hvert protein som lokaliserer til kjernen må ha en funksjonell NLS eller er nødvendig for å binde til cargoproteiner som utviser en NLS (s). Importin alpha gjenkjenner NLS i laste protein mens importin beta er rettet mot import komplekset til kjernefysiske pore [58], [60]. Importin beta er en del av en større familie av transport reseptorer ofte betegnes importins /exportins [59].
Mens en antatt NLS har blitt identifisert i CXCR4 [61], er funksjonen av denne kjernefysiske målretting signal i sammenheng med CXCR4 har ikke blitt undersøkt. En distinkt importin avhengig transportveien har vært implisert i transporten av C-C kjemokin reseptor type 2 (CCR2) [62]. Favre
et al
. funnet at en konstruert, HA-merket CCR2 forbundet med et medlem av familien importin av kjernefysiske transport reseptorer, Transportinβ1 (TRN1), i et CCR2-null-cellelinjen [62]. En interaksjon av CCR2 med TRN1 var nødvendig for å påvise CCR2 i atomfraksjoner, noe som tyder på at CCR2 transportert til kjernen via TRN1 [62]. TRN1 har vært innblandet i GPCR intern og desensitivisering [63]. Videre TRN1 fungerer som en reseptor for NLS-null proteiner i NLS-holdige last substrater [64], noe som gjør det til et viktig protein for import gjennom kjernefysiske pore komplekse [65]. Samlet utgjør disse studiene tyder på at både den klassiske atom import maskiner og TRN1 er kandidater som spiller en rolle i CXCR4 atomtrans [66].
Nuclear CXCR4 protein uttrykk har blitt observert i ondartet lever, tykktarms, nyrecelle og nasofaryngeale karsinomer [67], [68], [69], [70]. Disse studiene ble imidlertid rapportert som kliniske observasjoner, og klarte ikke å undersøke mekanismene for CXCR4 lokalisering eller noen biologisk funksjon knyttet til kjernefysisk reseptor. Disse dataene er konsistent med rapporter som har vist funksjonelle GPCRs knyttet til kjernen, og videre bidra til pågående kreft terapeutiske inngrep mot CXCR4. Viktigere, kan en funksjonell atom CXCR4 bidra til PCa tilbakefall til tross for dagens antagonister og monoklonale antistoffer mot PM-bundet CXCR4 og kan ikke være utformet for å krysse PM, noe som ville være nødvendig for å motvirke aktiv CXCR4 på kjernen. Videre identifikasjon av transportveier som kreves for kjernefysiske lokalisering av CXCR4 kan avsløre flere mål for terapeutisk utvikling for å hindre prostata kreft metastase og forbedre pasientens overlevelse.
Materialer og metoder
Cell Culture, Antistoffer og Reagens Forhold
PC3, DU145, 22RV1 humane prostatacancercellelinjer (PCA), ble RWPE1 human prostata cellelinje og 293T humane embryonale nyrecellelinje oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). PC3, DU145, 22RV1 og 293T-celler ble holdt i komplett RPMI-medium: RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C i 5% CO
2. RWPE1 celler ble opprettholdt i keratinocytt serumfritt medium (KSFM) inneholdende 50 mg /ml gentamycin, 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (BPE), og 5 ng /ml epidermal vekstfaktor (Invitrogen) ved 37 ° C i 5% CO
2. Alle celler ble opprettholdt ved 60% til 80% sammenflytning. PC3-celler ble opprinnelig isolert fra en prostata ryggvirvel metastase, mens DU145-celler ble oppnådd fra prostata hjernemetastaser. 22RV1 celler var fra et humant prostatakarsinom epitelial cellelinje avledet fra en xenograft som ble serie dyrket i mus, og RWPE1 celler ble isolert fra normal human prostata epitel. Cellekultur forsyninger og kanamycin sulfate (61-176-RG) var fra Media; SDF1α (300-28A) var fra Peprotech. De følgende reagenser og humane antistoffer var fra Cell Signaling: 10 x cellelyseringsbuffer (9803), muse-anti-kanin-IgG (5127), anti-CD44 (156-3C11), anti-GFP (2956S) og anti-G
ai (5290). Anti-CXCR4 (MAB172) var fra R TBST) i 30 minutter. CXCR4 ble påvist med et mus anti-humant CXCR4 monoklonalt antistoff (R 1:1000), i blokkeringsløsning i 30 minutter ved RT. Prøvene ble vasket grundig mellom inkuberinger, utviklet i diaminobenzidin (Vector Laboratories) i 3 minutter ved RT, og motfarget med hematoksylin Meyers anvendelse av standardteknikker. En negativ kontroll vevsprøve ble fremstilt ved å inkubere i biotinylert affinitetsrenset geit-anti-mus IgG (H + L) antistoff, bare, slik som beskrevet ovenfor. Prøvene ble analysert og fotografert av Dr. Dezhi Wang [71] ved Senter for metabolske bein sykdom Kjerne Laboratory, UAB School of Medicine, Birmingham, Alabama. Fordelingen av positive celler for CXCR4 ble tatt opp for å skildre diffuse eller fokale natur positive celler som sporadiske (positive celler og mindre enn 5%); fokale positive celler ( 11% men mindre enn 50%); eller diffuse (positive celler 50%). henhold til gjennomsnittlig tetthet av positive celler for CXCR4 (DAB farget), for å se den åpenbare forskjellen i styrke av CXCR4 uttrykk
Histomophometry Måling av fargeintensitet for CXCR4 i prostate Cancer Vev
Den gjennomsnittlige tettheten av positive celler (DAB farget) ble målt ved hjelp Bioquant® bildeanalyse programvare (RtmBometrics) og en Olympus BX51 mikroskop med en Q-Imaging kamera. Programvaren analyserte et gjennomsnitt gruppe av billedpunkter og returneres en dataverdi på grunnlag av fargeverdien av pikslene i fargede prøver. Tre tilfeldige felt av prostata vev ble utvalgt ved en forstørrelse på (400X) for hver seksjon basert på størrelsen av vevet. I hvert tilfeldig område, ble disse celler (en gruppe av piksler) som ble farget positivt (brun) med CXCR4 antistoff valgt av terskel verktøy av programvaren. Prøven lyskilden er kjent for å påvirke tetthetsmålingen; Derfor ble alle seksjonene målt med samme bakgrunn korreksjon levert av Bioquant.
subcellulære fraksjonering
PCa og normal prostata epitelceller (1 × 10
6) ble serum-sultet for tre timer (22RV1 og RWPE1) eller 24 timer (PC3 og DU145), før behandling med SDF1α (100 ng /mL) i 30 min. Subcellulære fraksjoner ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Thermo Scientific). I korthet ble cellene lysert i en serie av buffere og sentrifugeringstrinn for å oppnå en ikke-nukleær fraksjon og en intakt nukleær pellet, etterfulgt av ytterligere lysering for å isolere kjerneproteiner. Førti til ett hundre mikrogram av nukleære og ikke-nukleære fraksjonene ble separert ved SDS-PAGE elektroforese og overført til PVDF-membraner. Uttrykk for CXCR4 eller GFP-CXCR4 fusjonsprotein ble oppdaget med en mus monoklonalt GFP antistoff (Santa Cruz, 1:500) eller anti-human CXCR4 antistoff (R 1:1000) antistoffer ble brukt for å sikre integriteten til fraksjoner og som lasting kontroller. X-ray filmer ble skannet og Antall Ett program ble brukt for densitometry analyse.
Indirekte Immunocytochemistry (ICC) for CXCR4
Cells (3 × 10
5) ble sådd ut på glass Dekk (Fisher), serum-sultet som beskrevet, før behandling med SDF1α (100 ng /mL). Celler ble fiksert med iskald 100% metanol i 5 minutter ved -20 ° C og vasket med 1 x PBS. Ikke-spesifikke proteiner ble blokkert i blokkeringsoppløsning (3% normalt esel serum /1% BSA /0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) i 30 minutter ved romtemperatur, før inkubering med CXCR4 (R pEGFPN1-CXCR4 fungert som mal [72]. Forover- og revers primere for R146A, R148A og slettede NLS var (Integrated DNA Technologies): (i) R146A: FWD5′-CACGCCACCAACAGTCAGGCACCAAGGAAGCTGTTGGCTG-3 «, REV 5′-CAGCCAACAGCTTCCTTGGTGCCTGACTGTTGGTGGCGTG-3′; (Ii) R148A: FWD5`-CCAACAGTCAGAGGCCAGCGAAGCTGTTGGCTGAAA-3`, REV 5`-TTTCAGCCAACAGCTTCGCTGGCCTCTGACTGTTGG-3`; og (iii) NLS delesjon: FWD5»-CGCCACCAACAGTCAGCTGTTGGCTGAAAAGG-3 «og REV5′-CCTTTTCAGCCAACAGCTGACTGTTGGTGGCG-3». De resulterende plasmider var pEGFPN1-CXCR4R146A, pEGFPN1-CXCR4R148A og pEGFPN1-CXCR4ΔNLS. Positive CXCR4 mutante kloner ble utvalgt med kanamycin og ytterligere renset ved maxi-prep (Omega Bio-tek). Nøyaktighet av mutasjonene ble bekreftet ved DNA-sekvensering på en ABI 3130 xl Gene Analyzer Sequencer på Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA.
Transient transfections
Forbigående transfections ble utført med 2 ug konsentrert DNA og jetPRIME® Polypus transfeksjon, per produsentens instruksjoner. Kort sagt ble PC3-celler inkubert med jetPRIME®-DNA komplekser i 15% FBS /RPMI i 4 timer og mediet ble erstattet med 15% FBS i RPMI i ytterligere 18 timer, før serum-sult (24 timer). Cellene ble deretter høstet for respektive eksperimenter.
Expression of Transportinβ1 (TRN1)
Serum-sultet celler (5 × 10
6) ble behandlet med SDF1α i 30 min før slakting 60 ug av helcellelysater av western blot-analyse. Uttrykk for TRN1 ble oppdaget med en mus monoklonalt antistoff (Santa Cruz, 1:1000); α-Tubulin eller β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting
Immunoutfelling
Et milligram av PC3 helcellelysater ble immunoutfelt for CXCR4. (Santa Cruz, 1 ug per 250 ug protein) over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med protein A /G Plus-agarosekuler (Santa Cruz) i 2 timer ved 4 ° C. CXCR4-bundet agarose perler ble skilt fra lysatet ved en serie av 3 vaskinger med PBS og sentrifugering ved maksimal hastighet i 1 min ved 4 ° C. Perler ble behandlet for western blot analyse for TRN1 (Santa Cruz, 1:1000) og senere reprobed for CXCR4 med kanin anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) antistoff etterfulgt av inkubasjon med mus anti-kanin IgG (Cell Signaling) sekundær antistoff. Tretti mikrogram supernatanten oppnådd etter inkubasjon med agarose perler ble også skilt med 10% SDS-PAGE, og behandlet for western blot analyse for CXCR4 som beskrevet i karakterisering av CXCR4 antistoff.
short interfering RNA Transfeksjon
Transient transfeksjon av TRN1 bestemt siRNA (Santa Cruz) ble utført på PC3 celler belagt på dekkglass ved hjelp JetPRIME®. I korthet ble celler (2 x 10
5) ble sådd ut i 35 mm, 6-brønners skåler og transfektert med 50 nM TRN1-siRNA (Santa Cruz) i 15% FBS /RPMI-medium ved 37 ° C i 5% CO
2 i 24 timer. Deretter transfekterte celler ble serum-sultet i 24 timer, før immunocytochemistry analyse.
Immunpresipitasjon av G
ai
Serum-sultet celler (5 × 10
6) var behandlet med SDF1α i 30 minutter før slakting for immunoutfellingsanalyse. I korthet ble cellene vasket i 1 x PBS og forsiktig skrapet i NP-40 lyseringsbuffer (1 x PBS pH 7,4, 0,1% Triton x 100, 0,1% NP40 og 1 x cocktail-inhibitor). Etter 30 min inkubering på is, ble lysatet sentrifugert ved 600 RCF /5 min /4 ° C). Supernatanten ble forsiktig dekantert, og den nukleære pelleten ble resuspendert i lyseringsbuffer, 10 ganger volumet av kjerner pellet, og sonikert på is i 3 sek. Lysatet ble sentrifugert ved 600 RCF /5 min /4 ° C, og 1 mg av supernatant ble immunopresipitert for CXCR4 (mus monoklonalt, Santa Cruz) over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med protein A /G Plus-agarosekuler ( Santa Cruz) i 2 timer ved 4 ° C. CXCR4-bundet agarose perler ble skilt fra lysatet ved en serie av 3 vaskinger med NP40 lyseringsbuffer og sentrifugering (5000 pm /2 min /RT). Den siste vask ble med 1 x PBS. Perler ble behandlet for western blot analyse og membraner ble undersøkt for G
ai (Cell Signaling, 1:1000). Deretter ble blottene reprobed til CXCR4 med kanin-anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) antistoff, etterfulgt av inkubasjon med mus-anti-kanin-IgG (Cell Signaling) sekundært antistoff. Topoisomerase1 (Santa Cruz) og anti-CD44 (Cell Signaling) ble brukt for å vurdere renhet kjerner lysatene.
intranuclear Kalsium (Ca
2 +) Mobilisering
Serum-sultet PC3 celler (2,5 × 10
5) ble høstet for å få intakte kjerner i NP-40 lysebuffer som beskrevet ovenfor, før du utfører analysen per produsentens instruksjoner (Enzo biovitenskap). Kort sagt ble ubehandlede isolerte kjerner resuspendert i 100 ul FluoForte fargestoff-lasting oppløsning (Enzo Life Sciences) i 45 minutter ved 37 ° C og 15 minutter ved romtemperatur, deretter sentrifugert ved 600 RCF /5 min /RT. Oppløsninger av AMD3100 (100 ng /mL) og pertussis toksin (PTX) (200 ng /ml) ble fremstilt i kalsium-fri, fenol fritt RPMI. Kjerner Prøver ble resuspendert i 100 pl AMD3100 og PTX, alikvotert inn i svart vegger, klare bunn 96well plater, og inkubert i 1 time. Deretter ble SDF1α tilsatt til prøvene i form av plater, (sluttfortynning 100 ng /ul) og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Intranuclear kalsium-mobilisering ble bestemt ved intensiteten (økning) av fluorescerende (FluoForte) -bundet Ca
2+ i media. Resultatene ble målt på en mikroplateavleser ved eksitasjon 490 nm og emisjon 525 nm. Hver prøve ble fremstilt i tre eksemplarer per forsøk, og utføres minst tre ganger.
Statistical Analysis
Der det er aktuelt, data ble analysert ved en paret t-test eller ANOVA hjelp GraphPad Prism (GraphPad ) programvare. P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
CXCR4 er uttrykt i Nucleus av prostata vev
Forrige domene analyse av CXCR4 antydet at CXCR4 inneholder en kjernefysisk rettet mot signal mellom aminosyrene 90-170 [73]. En bioinformatikk analyse bruker PSORT II NLS prediksjon programvare (https://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) viste en antatt kjernefysiske lokalisering sekvens «RPRK «[72], [74], [75], [76] mellom aminosyrene 146-149 i CXCR4 (Tabell 1). I tillegg er en HomoloGene /NCBI databasesøk for NLS innenfor CXCR4 avslørte at «RPRK» er blitt konservert blant arter, inkludert kylling, mus, sjimpanser og andre (tabell 2). Videre CXCR4 er blitt påvist i kjernen av mange former for kreft vev [68], [70]. Basert på disse dataene, testet vi om CXCR4 protein kunne påvises i kjernen av prostata vev. Ved hjelp av en prostata vev microarray varierte fra normal til høy grad av metastatiske lesjoner, vi har oppdaget positiv immunoreaktivitets for CXCR4 i prostata prøver. Positive immunoreaktivitet ble detektert som sporadiske (CXCR4-positive celler og mindre enn 5%), fokal (CXCR4-positive celler 11%, men mindre enn 50%), eller diffus (CXCR4-positive celler 50%), sammenlignet med den gjennomsnittlige totale tetthet av positive celler for CXCR4 (DAB farget). Prøver med immunhistokjemiske score til negativ, svak eller moderat farging, med sporadisk til knutepunkter distribusjoner, ble ansett for å ha «lav» uttrykk, mens diffuse distribusjoner av farging ble vurdert å ha «høy» uttrykk for CXCR4. Fargeintensitet ble sporadisk for å fokal i kjernen med lav grad av prostata vev (Fig. 1A), mens høy grad av ondartet vev (Fig. 1A), viste en øket fargeintensitet og diffus ekspresjon av CXCR4 gjennom vev sammenlignet med lav karakter. I både lave og høye klasse tumorer, en fraksjon av CXCR4 tydelig co-lokalisert med kjernen. Fargeintensitet for CXCR4 var svak, eller til og med null, i normalt vev (Fig. 1a).
A
, Et menneske prostata vev utvalg, alt fra normal til høy grad av prostatakreft, ble evaluert ved IHC for CXCR4 ekspresjon ved bruk av standard metoder. Prøvene ble evaluert ved forstørrelse 40X, ved hjelp av en Q-økende kamera fra Olympus BX51 mikroskop med Bioquant® Image Analysis programvare (RtmBometrics). Normale prostata vev viste noe svak eller umulig å oppdage brun farging for CXCR4 (-positive celler mindre enn 5%), og ingen CXCR4 ekspresjon i kjernen. Representant lav karakter prostatavevet (grad 2, fase II, T
2 N
0M
0, adenokarsinom) viste tilfeldig /samlings positiv farging for CXCR4 i kjernen (positive celler 11%, men mindre enn 50%), noe som indikerer lav ekspresjon av CXCR4. Representant høy klasse metastaserende prostatavevet (klasse 4, stadium IV, T
4 N
1 mill
1, adenokarsinom) viste diffus /intens farging (positive celler 50%), noe som indikerer høy uttrykk for CXCR4 i kjerne. Scale bar representerer 50 mikrometer.
B
, CXCR4 IgG2b monoklonalt antistoff ble evaluert for spesifisitet til CXCR4 protein ved western blot analyse i PC3 (CXCR4 positiv) eller 293T (CXCR4 null) cellelinjer.
C
, CXCR4 antistoff ble evaluert for spesifisitet til CXCR4 protein ved immunoprecipitation for CXCR4 og western blot analyse for CXCR4.
D
, CXCR4 IgG2b antistoff ble evaluert for spesifisitet til CXCR4 protein ved immunoprecipitation med Fibronektin IgG2b mus monoklonalt antistoff (irrelevant isotype kontroll) og western blot analyse for CXCR4; ekspresjon av fibronektin-protein ble bekreftet ved western blot-analyse. Beta-aktin ble brukt som en lasting kontroll.
Vi har rapportert at PC3 celler var positive og 293T celler var null, henholdsvis for CXCR4 protein [21]. For å sikre at spesifisiteten til CXCR4 monoklonalt antistoff (MAB172IgG2b) som brukes for å påvise det tilsvarende protein i kjernen av prostatavevet, vi re-analyserte PC3 og 293T til CXCR4 med CXCR4 antistoff (MAB172IgG2b) ved western blot-analyse (Fig. 1B). I likhet med våre tidligere studier, ble CXCR4 påvist i PC3, men ikke i 293T helcellelysater (Fig. 1B). Påfølgende analyse av cellelysatene av immunoprecipitation med MAB172 IgG2b fulgt av western blot analyse med MAB172 IgG2b påvist CXCR4 bare i PC3 lysatene (Fig. 1C). For ytterligere å bekrefte spesifisiteten MAB172IgG2b til CXCR4, ble PC3 cellelysater kastet immunoutfelling med Fibronektin IgG2b, en isotype kontroll, etterfulgt av western blot analyse med MAB172 IgG2b (Fig. 1 D). Fibronektin ble ikke oppdaget av IP med CXCR4, men ble oppdaget av western blot med en fibronektin antistoff (Fig. 1 D).
CXCR4 er til stede i Nuclear Brøkdeler av prostata kreft celler
Vi brukte biokjemiske fraksjonering for å bekrefte den kjernefysiske lokalisering av CXCR4 påvist i vår vev farging. *, P 0,05. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Wang
et al
. Lee
et al
. Vi er også takknemlige for legene.
