Abstract
Bakgrunn
Aktuelle markører for prostatakreft, som Petroleumstilsynet mangler spesifisitet. Derfor er nye biomarkører nødvendig. Dessverre, kompleksiteten av kroppsvæsker hemmer ofte biomarkører. Et attraktivt alternativ tilnærming er isolering av små blemmer, dvs. exosomes, ~ 100 nm, som inneholder proteiner som er spesifikke for vev som de er utledet og kan derfor betraktes som skattekister for sykdomsspesifikke biomarkører.
Materialer og metoder
Exosomes ble isolert fra 2 udødelig primære prostata epitelceller (PNT2C2 og RWPE-1) og 2 PCA cellelinjer (PC346C og Vcap) av ultrasentrifugering. Etter tryptisk fordøyelse, analyser proteomikk benyttet en nanoLC kombinert med en LTQ-Orbitrap drevet i modus tandem MS (MS /MS). Nøyaktig Mass og Tid (AMT) tag tilnærmingen ble ansatt for peptid identifikasjon og kvantifisering. Kandidat biomarkører ble validert ved Western blotting og Immunohistochemistry.
Resultater
proteomikk karakterisering resulterte i identifisering av 248, 233, 169 og 216 proteiner ved minst 2 peptider i exosomes fra PNT2C2, RWPE -1, PC346C, og VCap, respektivt. Statistiske analyser avslørte 52 proteiner annerledes rikelig mellom PCA og kontrollceller, hvorav 9 var mer rikelig ved PCA. Validering av Western blotting bekreftet en høyere overflod av FASN, XPO1 og PDCD6IP (ALIX) i PCA exosomes.
Konklusjoner
Identifikasjon av exosomal proteiner med høy ytelse LC-FTMS resulterte i funn av PDCD6IP , FASN, XPO1 og ENO1 som ny kandidat biomarkører for prostatakreft
Citation. Duijvesz D, Burnum-Johnson KE, Gritsenko MA, Hoogland AM, Vredenbregt-van den Berg MS, Willemsen R, et al. (2013) proteomikk Profilering av Exosomes fører til identifisering av nye biomarkører for prostatakreft. PLoS ONE 8 (12): e82589. doi: 10,1371 /journal.pone.0082589
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 16 juli 2013; Godkjent: 25 oktober 2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Duijvesz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostata spesifikt antigen (PSA) er et klinisk nyttig. protein biomarkør for diagnostikk og oppfølging etter behandling for prostatakreft (PCA). Likevel ble PSA-basert screening vist seg å ha en høy risiko for diagnostikk og over fordi den mangler spesifisitet [1], [2]. For å skille mer presist mellom godartede prostatasykdommer og (ulike former) av PCA hindre unødvendige prostatabiopsier, og støtte urologen å anbefale optimal behandling, er nye molekylære biomarkører sterkt behov.
I de siste tiårene , en enorm mengde forskning har blitt utført for å finne nye og bedre biomarkører for PCA ofte ved hjelp av state-of-the-art massespektrometri teknologier, men oppdagelsen av romanen lav overflod protein er generelt hemmet av kompleksiteten i serum eller urin [3]. Isolering av exosomes fra kroppsvæsker representerer en attraktiv måte å omgå disse begrensningene og muliggjøre påvisning av kandidat (lav rikelig) biomarkører.
Nyere funn i letingen etter nye biomarkører har avdekket at små exosomes (50-150 nm) er til stede i serum og urin [4]. Ved å isolere exosomes fra kroppsvæsker bør det være mulig å overvinne den dynamiske området utfordring og lette karakterisering av vev /cancer-avledede proteiner som kanskje mer nøyaktig representerer cellulære betingelser. Derfor exosomes kan være nyttig for å bestemme enkelte kreft egenskaper [5], [6].
I denne studien var målet vårt å fastslå tilstedeværelse og betydningen av exosomal proteiner som nye kandidat biomarkører for PCa ved å sammenligne exosomes fra ikke-kreft prostata cellelinjer til exosomes fra PCA cellelinjer.
Materialer og metoder
Cell kultur og isolasjon
To menneskeudødelig prostata epitel cellelinjer (PNT2C2 [7] og RWPE-1) og to PCA cellelinjer (PC346C [8] og Vcap [9]) ble dyrket i 10 T175 (175 cm
2) kulturflasker (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) opp til 80- 100% konfluens. Den PNT2C2 og VCap-cellelinjen ble dyrket i RPMI 1640 (Lonza, Verviers, Belgia) og supplert med 5% og 10% FCS, 500 U penicillin og 500 U streptomycin (Lonza, Verviers, Belgia). Den RWPE-1-cellelinje (ATCC-LGR, Wesel, Tyskland) ble dyrket i keratinocytt Serum Free Medium (Invitrogen, CA, USA) og tilsatt 5 ml Pen-Strep og et kommersielt kit inneholdende bovint hypofyseekstrakt (BPE, 0,05 mg /ml) og epidermal vekstfaktor (EGF, 5 ng /ml). Den PC346C-cellelinjen ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium-Hams F-12 medium (Lonza), supplert med flere additiver som beskrevet av Marques [10].
Etter å ha nådd 80-100% konfluens, ble cellene inkubert med 25 ml serumfritt medium. Etter 48 timer ble supernatanten samlet og utsatt for sentrifugeringstrinn på 400 ×
g product: (10 min), 3000 ×
g product: (20 min), og 10 000 ×
g
(30 min) for å fjerne cellulært avfall. Exosomes ble deretter pelletert ved 64000
g plakater (110 min), og på 100 000
g plakater (Sukrose gradient) for 1 time [11]. I det minste to separate exosomes isoleringer fra hver av de fire cellelinjer ble slått sammen. Total mengde og konsentrasjon av exosomal proteiner av samleprøver ble målt med en BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL, USA).
elektronmikroskopi (EM)
5 mL av exosomes var prikket inn Formvar-belagt nett (200 mesh) og fikseres i 2% paraformaldehyde. Etter fiksering de exosomes ble negativt farget ved hjelp av 4% uranylacetate. Rister ble undersøkt av en Philips CM100 elektronmikroskop ved 80 kV.
Prøvepreparering for massespektrometri
TFE (2,2,2-Trifluoroethanol) (Sigma-Aldrich) ble tilsatt til prøvene til en endelig konsentrasjon på 50%. Prøvene ble lydbehandlet i et is-vann-bad (Branson 1510, Danbury, CT) i 2 minutter og deretter inkubert ved 60 ° C i 2 timer med konstant risting (300 rpm). For protein disulfid bro (S-S) reduksjon, DTT (ditiotreitol) (Sigma-Aldrich) ble tilsatt til sluttkonsentrasjon på 2 mM, etterfulgt av ultralydbehandling i 2 minutter. Prøvene ble spunnet ned og inkubert ved 37 ° C i 1 time med risting (300 rpm). Prøvene ble fortynnet 5 ganger med 50 mM ammoniumbikarbonat (pH 7,8) før tilsetning av sekvense grad modifisert trypsin (Promega, Madison, WI) for protein fordøyelse (1:50 w /w trypsin-til-protein). Prøvene ble ristet (300 rpm) over natten (16 timer). Hurtig frysing av prøvene i flytende nitrogen slukket fordøyelsen. Alle prøver ble konsentrert ned i Speed-Vac SC 250 Express (Thermo Savant, Holbrook, New York).
Massespektrometri
proteomikk målinger ble utført ved hjelp av en nanoLC-MS på Miljø Molecular Science Laboratory (EMSL), Richland, WA, USA. Den analytiske plattformen besto av en on-line konstant trykk (5000 psi) reversert-fase (C
18) væskekromatografi (RPLC) system [150 um id x 360 um od x 65 cm kapillær (Polymicro Technologies Inc., Phoenix , Arizona)] koblet til en LTQ-Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) via en electrospray ionisering (ESI) kilde produsert in-house [12]. Kort fortalt var fulle MS ervervet over
m Twitter /
z
spekter av 400-2000 ved oppløsning på 100 000, etterfulgt av data-avhengige LTQ MS /MS for de seks mest tallrike ioner i hver MS fullstendig skanne, ved hjelp av en kollisjonsenergi innstilling på 35% og dynamisk utelukkelse tid på 60 s. En eksponentiell HPLC gradient av ~ 100 min (fra 0-70% B) ble anvendt for hver analyse, med mobile faser bestående av 0,1% maursyre i vann (A) og 0,1% maursyre i ACN (B). Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer, med ca 5 ug samlet peptid forbrukt (dvs. applisert på kolonnen) i hver analyse.
massespektrometri Data Analysis
Den resulterende MS-data ble analysert ved anvendelse av PNNL utviklet Nøyaktig Mass and Time (AMT) Tag rørledning [13]. SEQUEST programvare [14] ble brukt til å søke tandem massespektra mot Uniprot menneskelig database (last ned den 5. april 2011). Trygt identifisert peptider (Tabell S1 i filen S1) ble montert i en exosome spesifikke AMT tag database. For komparative analyser, ble LC-MS funksjoner matchet mot AMT koder for identifikasjon og relative MS-peak intensiteter ble brukt til å utlede endring i overflod. AMT tag tilnærming tilrettelagt kvantifisering av mange flere peptider enn spektral telling alene. Så lenge et peptid ble identifisert i det minste en prøve /analyse (ved tandem MS), kan det bli kvantifisert i alle datasett hvor det ble detektert, selv om LC-MS funksjon var ikke rikelig nok til å være fragmenterte i det aktuelle analyse . VIPER programvare [15] ble brukt til å korrelere AMT tag oppføringer (identifisert peptider) med LC-MS funksjoner avhengig av høy masse målenøyaktighet (MMA 2 ppm) og normalisert eluering tid nøyaktighet (NET~2.5%). Følgelig hvert LC-MS funksjon tilpasset tilbake til et enkelt peptid (AMT-tag) og dermed gi en toppintensitet verdi (eller relativ rikelighet) for dette peptid. For redundante peptid identifikasjoner i tilfelle av en enkelt peptid søker flere proteiner (typisk protein isoformene) en representant protein ble valgt; Derfor, hver rapportert peptid varer tilbake til et enkelt protein. Ingen peptid identifikasjoner ble gjort på masse alene.
For de 263 identifiserte proteiner, ble det humane proteinet Referanse Database (HPRD) og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) som brukes til å bestemme subcellulære sted og biologisk funksjon [16].
Valg av potensielle protein biomarkører for prostatakreft ble utført ved hjelp av to uavhengige tilnærminger. Først proteiner ble valgt som var til stede i begge PCA cellelinje avledet exosomes og fraværende i både ikke-PCA exosomes. Med den andre metode, dante programvare [17] ble benyttet for å omdanne peptidet toppintensitetsverdier til en log2 målestokk og vurdere dem ved en proteinnivå ved hjelp Rrollup (referanse peptid basert scaling) parametre hvor peptidene ble ekskludert fra skalering hvis de ikke ble sett hos minst tre datasett og ingen minimums peptid nærvær var nødvendig. Proteiner som er presentert i dette manuskriptet ble identifisert ved hjelp av minst to peptider. ANOVA parvise sammenligninger mellom hver PCa og kontroll cellelinje ble også utført i Dante hvor minimum antall datapunkter per faktor nivået ble satt til tre, slik at for et protein for å vise statistisk signifikante endringer det ville ha å bli identifisert i alt tre gjentak. Signifikant forskjell ble bestemt som en p-verdi og q-verdi lavere enn 0,05. Dante genererer p-verdier og anslår sine q-verdier. Q-verdien av en test måler andelen av falske positiver påløpt (kalt falsk funnraten) når den aktuelle testen kalles signifikant. Bare de vesentlig forskjellige proteiner ble valgt for uovervåket hierarkisk clustering. Cluster og Utforsker programmet ble brukt til å logge forvandle, mener senter relative uttrykk verdier, og deretter hierarkiske klase alle proteiner basert på deres uttrykk [18]. For å velge den mest lovende proteinene ytterligere, ble a≥1.5 log2 ganger endring cutoff påføres sammen med et krav om at hvert protein viste signifikant endring i det minste to av de fire sammenligninger som er oppført i tabell 1. Tabell 1 lister opp de dannede 52-proteiner, 9 som viste økt (og 43 redusert) overflod i exosomes avledet fra PCA cellene.
For å velge de mest lovende proteiner fra de to tilnærmingene ytterligere, proteiner skalert basert på prostata preferentiality. Fem forskjellige menneskelige genuttrykk atlas [19] – [23] basert på microarray expression data ble samlet i SRS [24], for å bestemme proteintilsvarende genuttrykk. Til slutt ble prostata preferentiality bestemt som 1,5 ganger høyere uttrykk i prostatavevet i forhold til nyre og blære vev ved hjelp av genuttrykk microarray data [25].
Western blotting
Fra hver exosome prøve 5 mikrogram protein ble blandet med Laemmli-prøvebuffer (01:01), oppvarmet ved 95 ° C i to minutter og fylt på 10% en-dimensjonal SDS-PAGE-geler. Deretter ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner Protran (Whatman «s Hertogenbosch, Nederland) og blokkert (1 time) ved værelsestemperatur med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltløsning med 0,1% Tween-20. Deretter ble gelene inkubert over natten ved 4 ° C med antistoffer mot: PDCD6IP (1:500 fortynning, Sigma-Aldrich), FASN (1:500 fortynning, Sigma-Aldrich), XPO1 (1:200 fortynning, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), ENO1 (Clone H300, 1:1000 fortynning, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (Clone 7B, 1:500 fortynning, Santa Cruz Biotechnology), CD9 (Clone 209306, 1:500 fortynning, R 0,05).
Valg av potensielle biomarkører
For å velge proteiner som viser betydelig endring i overflod mellom PCA exosomes og ikke -PCa exosomes vi brukte ANOVA parvise sammenligninger (dvs. p-verdi og q-verdi 0,05, tilstedeværelse i alle analysene, ≥2 peptider) [17]. Tabell S4-8 i filen S1 inneholde resultater oppnådd for PC346C (PCA) vs. PNT2C2 (kontroll), PC346C (PCA) vs. RWPE-1 (kontroll), Vcap (PCA) vs. PNT2C2 (kontroll), og Vcap ( PCA) vs. RWPE-1 (kontroll). For ytterligere å forbedre tillit, kreves vi at hvert protein ble bestemt til å være signifikant endring i overflod i minst 2 sammenligninger; dette ytterligere redusert vår liste til 52 proteiner (Tabell 1 og Tabell S9 i filen S1).
Vår proteomikk analyse indikerte PDCD6IP, FASN, CD9, og ENO1 å ha vesentlig endring i overflod mellom to forhold, mens XPO1 gjorde ikke passerer våre strenge kriterier filtrering og ble derfor ansett uendret i overflod i Vcap vs. RWPE-en sammenligning (tabell S8 i filen S1). Likevel valgte vi å validere XPO1 på grunn av sin høyere overflod i Vcap exosomes forhold til RWPE-en kontroll og tilgjengeligheten av en høy kvalitet antistoff egnet for Western blotting og immunhistokjemi.
Utforskning av nye kandidat biomarkører
for FASN og XPO1, sterke signaler ble observert i helcellelysater i forhold til den exosomes og det synes å være forholdsvis høyere mengde i VCap exosome prøven (figur 4). Proteinet PDCD6IP er anriket på exosomes og viser høyere overflod i begge PCa-avledet exosome prøver som vist i figur 4 og tabell 1. Ut fra MS-analyser, er FASN betydelig høyere i de PC346C exosomes i forhold til både kontroller og i VCap exosomes sammenlignet til RWPE-en kontroll. Denne høyere overflod av FASN i PC346C bekreftes av Western blot. CD9 er høyanriket i exosomes og viser relativt høy overflod i PC346C exosomes. XPO1 viste høyere overflod i VCap exosomes sammenlignet med kontroller. MS data preget ENO1 å bli betydelig redusert i overflod i PC346C forhold til begge kontrollene og i Vcap forhold til PNT2C2 kontroll. Western blotting av ENO1 avslørte et ekstra band (ca. 30 kDa) i løpet av de to PCA- avledet exosome prøver. Som forventet basert på forskjellen i PSA-sekresjon og exosome formasjon, er PSA hovedsakelig til stede i de to kreftcelleprøver og fraværende i exosomes. Supernatanter som ble samlet inn etter exosomes ble pelletert under ultrasentrifugering, ikke inneholde noen av de exosomal proteiner, bortsett ENO1 og GAPDH unikt i Vcap medium.
Alle fire exosome prøver og tilhørende cellelinjer ble brukt til validering. Videre supernatant fra de pelleterte exosomes ble anvendt som en kontroll. De valgte proteiner FASN, XPO1, CD9 og PDCD6IP, ble testet med ENO1 og GAPDH som kontroller. Petroleumstilsynet ble testet for å bekrefte det skilles ut gjennom alternative sekresjon sti og derfor ikke til stede i exosomes. Den nærmeste protein markør (KDA) er angitt for hver blot.
Verifisering av uttrykk i kliniske prøver
PDCD6IP viste sterk luminal og basal epitel cytoplasmisk farging i normal tilstøtende prostata (NAP) , med ingen endring i protein uttrykk ved PCA vev med ulike Gleason score (figur 5). I NAP, er FASN moderat til svært tallrike i epitelceller. Likevel, når Gleason score øker, blir flekker sterkere. Når det gjelder XPO1, er det en sterk kjerne overflod i NAP og en svak cytoplasmisk farging. Innenfor PCA celler, øker cytoplasma overflod med Gleason score. Nuclear farging forblir lik blant alle PCA vev.
Representative bilder av flekker fra 2 uavhengige prøver per gruppe.
Diskusjoner
Sammenligning av exosomes avledet fra kreftcelle linjer og udødelig prostata epitelceller, gir et kraftig verktøy for å overvinne den dynamiske området utfordring og identifisere nye lave rikelig kreft avledet biomarkører. Denne unike tilnærming innen exosomal protein forskning, kombinert med state-of-the-art LC-MS analyser lettere identifisering av nye kandidat biomarkører for PCa. Denne studien beskriver exosomal protein uttrykk fra flere PCA cellelinjer, men undersøker også exosome innhold fra flere udødelig normal prostata epitelceller. I forhold til tidligere studier, gjør dette oss til en mer pålitelig måte å identifisere PCA- bestemt kandidat biomarkører og felles exosomal proteiner. Ved hjelp av Western blotting og IHC, vi bekrefte differensial uttrykk og viser at søker markører uttrykkes ved prostatakreftceller i pasientprøver.
Det totale antallet unike proteiner vi identifisert i denne studien (496 av ≥1 peptid, 263 av ≥2 peptider), er sammenlignbare med tidligere publiserte exosome proteomikk rapporter. [26] – [30]. Tildeling av en subcellulære lokalisering avdekket at en stor andel av exosomal proteiner som normalt finner i cytoplasma eller cellekjernen. Etter sammen dette til en database som inneholder et stort flertall av alle proteiner (~20,000), la vi merke til at exosomes har en relativt sammenlign overflod av nukleære proteiner, høyere overflod av cytoplasmatiske proteiner og et vesentlig lavere overflod av ekstracellulære proteiner. Dette passer den nåværende teorien om exosome formasjon [4]. Exosomes viser en overrepresentasjon av transmembran og cytoplasmiske proteiner, så som CD9 og PDCD6IP, som vist ved Western blot. Dette funnet er enig med teorien om at biogenesis og utvalg av exosomal innhold er ikke en tilfeldig prosedyre, men i det minste delvis et resultat av en selektiv sorteringsprosess [4].
To nyere proteomikk studier avdekket exosomal proteiner knyttet til prostata kreft [30], [31]; Sandvig
mfl.
Utført LC-MS analyse på en enkelt prostata (kreft) cellelinje, var Hosseini-Beheshti
et al.
Undersøkt fem PCA cellelinjer og en ikke-ondartet prostata epitelial cellelinje. Begge rapportert 266 og 220 proteiner, som er lik antall vi avslørt. Interessant, Sandvig
et al.
Rapporterte et annet protein subcellulære fordeling og korrelasjon med biologiske prosesser i forhold til våre data. Sandvig
et al.
Slått CDCP1 og CD151 som kandidat markører, var Hosseini-Beheshti foreslo ANXA2, CLSTN1, FLNC, FOLH1 og GDF15. Hosseini-Beheshti
et al.
Også viste FASN å være en exosomes-avledet kandidat biomarkør (i samråd med våre resultater). Når vi sammenligner deres identifiserte proteiner (ved 2 peptider) la vi merke til en overlapping av bare ni proteiner, henholdsvis CD9, ANXA1. ACTB, PGK1, RAN, EpCAM, HSPB1, PDCD6IP og PRDX1 (figur 6). Disse proteiner har blitt publisert tidligere i flere artikler, og er ansett for å være til stede i nesten alle exosomes. PDCD6IP har også blitt identifisert av både forskere, men har ikke vist seg å være mer rikelig ved PCA-avledet exosomes. Totalt 199 proteiner har entydig blitt funnet i vår studie, inkludert kandidaten biomarkør XPO1. Overlappingen mellom studiene er ganske begrenset. Spesielt er en overlapping av bare 42 proteiner mellom vår studie og Hosseini-Beheshti
et al.
Ikke forventet siden partiet de samme cellelinjer ble benyttet (Vcap og RWPE-1). Denne smale overlappingen kan være et resultat av forskjellige rense, MS-MS-teknologier og databehandlings rørledninger benyttet. I tillegg, hvis exosomes inneholde en stor samling av forskjellige proteiner, overlapping mellom databaser kan begrenses hvis bare en brøkdel av alle proteiner som er identifisert i hver studie. En fersk rapport fra Principe
et al.
Viste den første identifiseringen av mer enn 900 proteiner i exosomes som stammer fra menneskelige prostata væske fra pasienter med lavgradig PCa og friske menn [32]. Når vi sammenlignet deres unike protein uttrykk (tilstedeværelse av 2 peptider), bare 31 proteiner lapper, inkludert flere annexins (ANXA1-7), peroxiredoxins (PRDX1-6), PDCD6IP og generell transmembrane proteiner (CD9 /CD242 /CD44). Alle disse proteinene antas å være til stede i nesten alle exosomes. I hvilken grad begrenset overlapping skyldes faktiske forskjeller mellom cellelinje-avledet exosomes og vesikler fra kliniske prøver, må likevel bli etablert.
Antall proteiner identifisert i hver studie er en samling av kreft avledet exosomal proteiner identifisert av MS-MS.
Vi identifiserte PDCD6IP som blir beriket i exosomes, spesielt i PCA exosomes. PDCD6IP, også kjent som ALIX, er et cytoplasmisk protein som er kjent for sin rolle i apoptose og er vist å være involvert i reaksjonsveien av utvalgte sorterings ved ESCRT-komplekser [33]. PDCD6IP har vært brukt som en generell markør for å påvise tilstedeværelsen av exosomes [34]. Men ingen sammenheng ble gjort med en høyere overflod i kreft-avledet exosomes. En mulig forklaring på høy PDCD6IP overflod ved PCA-avledet exosomes kan være at PCA celler har en endret produksjon av exosomes, hvor de er i stand til å regulere sortering av exosomal innhold ordentlig lenger. Det er også mulig at kreftceller forsøke å fjerne den PDCD6IP proteinet ved exosome sekresjon til (delvis) undertrykke apoptose. For å komplettere denne teorien, har andre ikke-PCA relaterte studier vist at overekspresjon av PDCD6IP korrelerer med celledød [35]. Ved hjelp av IHC, fant vi ikke noen forskjell i PDCD6IP overflod mellom normal prostata epitel og PCa vev.
Både FASN og XPO1 har en høyere overflod i PCA exosomes avledet fra Vcap celler. FASN katalyserer dannelsen av langkjedede syrer fra acetyl-CoA, malonyl-CoA og NADPH, og har allerede blitt foreslått som en markør for PCa [36], [37]. Nyere studier har vist at FASN er først og fremst uttrykt i hormon-følsomme celler, fremmer celle-proliferasjon, og at inhiberingen av FASN dreper effektivt og selektivt kreftceller [36]. Men disse studiene ble alle utført
in vitro
. Den Vcap cellelinje brukt her er hormonfølsom, noe som kan forklare høyere overflod av FASN i Vcap-avledet exosomes. Kreftceller produserer mer FASN, sannsynligvis fordi den fremmer cellevekst, noe som kan føre til høyere inkorporering i exosomes. Etter avtale med tidligere resultater [38], vi også observert en økt overflod ved PCA i forhold til NAP.
XPO1 har blitt foreslått som en prognostisk markør for andre typer kreft [39]. XPO1 er en kjernefysisk protein kjent for å være involvert i atom cytoplasma eksport av signalbærende (NES) proteiner, som spiller en rolle i relevante kreftsignalveier, for eksempel P53, akt1, HDAC5, androgen reseptor (AR) og EGFR [40] – [42]. Våre funn tyder på at XPO1 kan være en potensiell biomarkør for PCa. Når dette proteinet er godkjent for hele avsnittet PCA prøver med IHC, ser vi en sterk kjernefysisk uttrykk og en veldig svak cytoplasma uttrykk. Interessant, innen kreftceller, synes dette proteinet for å translocate inn i cytoplasma. Med økende Gleason score, blir cytoplasma XPO1 uttrykk mer intense. Hvorfor denne prosessen skjer fortsatt uklart. I en normal celle, har XPO1 å bli transportert fra cytoplasma tilbake i kjernen for å fungere som en anstand protein. Hvis denne flytteprosessen blir hemmet i kreft, vil cytoplasmisk XPO1 akkumulere og mer XPO1 kan bli innlemmet i exosomes.
Som publisert tidligere, et ytterligere proteinbånd (ca. 30 kDa) vises med Western blotting ved bruk av et antistoff rettet mot ENO1 i PC346C cellelinje [43]. Her viser vi at dette bandet er også til stede i Vcap exosomes og fraværende i exosomes fra to ikke-PCA cellelinjer. Opprinnelsen av den ytterligere båndet kan være et ikke-spesifikt antistoff kryssreaksjon til et annet protein, et alternativt spleiset ENO1, en settes fragment eller et nedbrytningsprodukt fra det opprinnelige protein. En kjent protein, isoform kalt MBP-1 (c-myc promoter-bindende protein-1) fremstilles danne ENO1-genet [44]. MBP-1 er identisk i sekvens til ENO1 men mangler de første 93 eller 96 aminosyrer. Med en beregnet molekylvekt på 36 kDa, MBP-en er usannsynlig den estimerte 30 kDa ekstra band. Observasjonen at denne ekstra bandet bare oppstår i begge kreftprøver kan tyde på at det kan ha en relasjon til PCa.
De nye markørene vi identifisert kom fra cellelinje-avledet exosomes. Selv exosomal tilstedeværelse og uttrykk kreft vev av et valgt sett av kandidat biomarkører ble bekreftet ved hjelp av Western blotting og IHC, er uavhengig validering av kandidat markører fortsatt behov på en stor samling av prøver som pasienturin exosomes eller vevsprøver. Dette vil klargjøre sin rolle som en biomarkør for PCa.
For å teste tilstedeværelsen av exosomal proteiner i store årskull av pasientprøver, kan man ty til standard IHC av kandidat markører på microarray og prostatabiopsier. Alternativt kan intakte exosomes bli isolert fra urin eller plasma ved hjelp av utfelling, filtrering eller immunocapture protokoller, hvoretter innholdet av exosomes kan måles ved ELISA spesifikk for proteinene av interesse. ELISA er under utvikling for påvisning av intakte prostata-avledet exosomes hjelp fangst eller deteksjon antistoffer rettet mot kjente prostata-spesifikt trans proteiner. En slik analyse gjør det mulig å identifisere ekspresjon av transmembranproteiner, men også anslå antall exosomes.
Konklusjon
Prostata (kreft) celler utskiller exosomes som kan brukes til å identifisere nye kandidat biomarkører for PCa . Identifisering av exosomal proteiner ved høy ytelse LC-FTMS resulterte i funn av PDCD6IP, FASN, XPO1 og ENO1 som ny kandidat biomarkører for PCa. I neste fase vil alle foreslåtte kandidat biomarkører vurderes på pasientprøver (vev, serum eller urin) for å fullt ut klargjøre sitt potensial klinisk verdi.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Støtte informasjon som inneholder 9 støtter informasjonsfiler. Tabell S1 i filen S1: Trygt identifisert peptider (n = 1494) ble montert i en exosome spesifikke AMT tag database. Tabell S2 i fil S1: 1494 ikke-redundante peptider som tilsvarer 496-proteiner ved hjelp av minst ett peptid.
