Abstract
Bakgrunn
Et grunnleggende problem i kreftforskning er å identifisere celletype som er i stand til å opprettholde neoplastisk vekst og dens opprinnelse fra normale vev celler. Nyere undersøkelser av en rekke krefttyper har vist at fenotypisk identifiserbare og isolable subfractions av celler besitter svulsten dannende evne. I det foreliggende papir, ved hjelp av to avstamning-relaterte humane melanomcellelinjer, primært melanom linje IGR39 og dens metastatisk derivat linje IGR37, er to hovedobservasjoner rapportert. Den første er den første fenotypiske bevis for å støtte opprinnelsen melanom kreft stamceller (cscs) fra muterte vevsspesifikke stamceller; og den andre er identifiseringen av en mer aggressiv undergruppe cscs i melanoma som er CXCR6 +.
Metoder /Funn
Vi definerte CXCR6 som en ny biomarkør for vev-spesifikk stamcelle asymmetrisk selv -fornyelse. Dermed ble forholdet mellom melanom dannelse og ABCG2 og CXCR6 uttrykk undersøkt. I samsvar med deres ikke-metastaserende karakter, usorterte IGR39 celler dannet betydelig mindre svulster enn usorterte IGR37 celler. I tillegg ABCG2 + celler produserte svulster som hadde en to-ganger større masse enn tumorer produsert av usorterte celler eller ABCG2- celler. CXCR6 + celler produsert mer aggressive svulster. CXCR6 identifiserer en mer diskret undergruppe av dyrkede humane melanomceller med en mer aggressiv MCSC fenotype enn celler valgt på grunnlag av ABCG2 + fenotype alene.
Konklusjon /Betydning
Foreningen for en mer aggressiv svulst fenotype med asymmetrisk selvfornyelse fenotype avslører en tidligere ikke aspekt av tumorcellefysiologi. Nemlig, oppbevaring av noen vevsspesifikke stamcelleegenskaper, som muligheten til å asymmetrisk selv fornye, påvirker den naturlige historien om menneskelig svulst utvikling. Kunnskap om dette nye aspektet av svulst utvikling og progresjon kan gi nye mål for kreft forebygging og behandling
Citation. Taghizadeh R, Noh M, Huh YH, Ciusani E, Sigalotti L, Maio M, et al. (2010) CXCR6, en nylig definerte Biomarker av Tissue-Specific Stem Cell Asymmetrisk selvfornyelse, Identifiserer mer aggressiv Menneskelig melanoma kreftstamceller. PLoS ONE 5 (12): e15183. doi: 10,1371 /journal.pone.0015183
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 05.08.2010; Godkjent: 28 oktober 2010; Publisert: 22.12.2010
Copyright: © 2010 Taghizadeh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institues av helsedirektør er Pioneer Award # 5DP1OD000805 og av National italiensk tilskuddet COFIN 2008. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft kjemoterapi effekt er ofte svekket av enten indre eller ervervet svulst motstand, et fenomen kalt multiresistens (MDR) [1]. MDR kan skyldes flere forskjellige mekanismer, inkludert å redusere medikament akkumulering i tumorceller [1]. Den mekanisme som er mest vanlig forekommende i laboratoriet, er den økede effluks av en bred klasse av hydrofobe cytotoksiske medikamenter som medieres av én av en familie av energiavhengige transportører (ABC-familien) [2]. Selv om flere medlemmer av super har viet spesielle funksjoner som involverer transport av spesifikke substrater, blir det stadig tydeligere at den komplekse fysiologiske nettverk av ABC transportører har en sentral rolle i verts avgiftning og beskyttelse av kroppen mot xenobiotics. Blant de humane ABC superfamilie, bare ABCB1, ABCC1 (MDR1) og ABCG2 har til dags dato blitt vist å mediere MDR, hver med forskjellige overlappende utstrømning substratspesifisitet og vev fordelingsmønstre [3]. Å oppfylle sin rolle i avgiftning, har flere ABC-transportører blitt funnet å være over-uttrykt i cancercellelinjer dyrket under selektivt trykk. Spesielt er ABCB5 overuttrykt i melanoma, og ABCG2 uttrykkes ved en subcellulære CD133-positive melanomceller [4], [5].
i denne rapporten, undersøkte vi en ny kandidat for et melanom kreft stamcelle (MCSC) markør, cytokin co-reseptor CXCR6, med hensyn til egenskapene til ABCG2-uttrykke MCSCs. Et viktig spørsmål uløst innen kreft stamcelle (CSC) forskning er hvorvidt det er en direkte sammenheng mellom avstamning cscs og vevs-spesifikke stamceller (TSSCs) er funnet i normale vev fra kreftformer som oppstår. Det er verdt å identifisere markører som skiller mellom tumorigent fra ikke tumorigene celler [6]. CD133 uttrykkes ved de fleste av melanom cellelinjer [4], og det ser ikke ut i stand til å skille tumorigent fra ikke -tumorigenic celler [6]. Videre nylig, Weissman gruppe bekreftet tilstedeværelsen av en mer aggressiv subpopulasjon CD217 + i human melanoma [8]. Vi dro ut for å kaste eksperimentell lys over dette problemet ved å undersøke tidligere beskrevet melanom cscs forbundet med etablerte melanom cellelinjer [4], [6] for bevis for asymmetrisk selvfornyelse, en bestemt egenskap TSSCs [7], [9]. For denne evalueringen, ansatt vi en ny biomarkør som vi viser her for å bli assosiert med asymmetrisk selvfornyelse, kjemokinreseptoren CXCR6. I tidligere studier, ble CXCR6 identifisert som et co-reseptor for humant immunsviktvirus-infeksjon i lymfocytter [10]. Lave nivåer av CXCR6 ekspresjon er også blitt påvist spesifikt på hukommelse /effektorceller Th1-celler i perifert blod [11]. Mer nylig, ekspresjon av CXCR6 var assosiert med humane tumorer, inkludert melanom [12] – [14]. Heri, vi viser, basert på studier med mus cellelinjer genmodifisert til å gjennomgå asymmetrisk selvfornyelse som TSSCs, at både mønster og nivå av CXCR6 uttrykk er spesielt forbundet med asymmetrisk selvfornyelse divisjon.
Vi så for co-sammenslutning av CXCR6 uttrykk og ABCG2 uttrykk med MCSC aktivitet og bevis for nedstigningen av melanom cscs fra TSSCs. Faktisk, finner vi at en stor andel av ABCG2-positive melanomceller med kjente CSC egenskaper, også uttrykke CXCR6. Dessuten, som ABCG2-uttrykkende melanomaceller, CXCR6-uttrykkende celler er en liten brøkdel av celler i kulturer av primær, metastatiske melanomcellelinjer og humane melanom biopsiprøver.
In vivo
CXCR6 + melanomceller produsert en svulst på kortere tid enn ABCG2 + celler og, mer interessant, den negative undergruppe ikke gi en svulst. Dette fenotypisk co-sammenslutning av CXCR6, en biomarkør for asymmetrisk selvfornyelse i ikke-kreftceller, med CSC-aktivitet i tumor-avledede celler som er bevis for en direkte avstamning forhold mellom TSSCs og cscs i tilfelle av melanocyttiske celler og melanom, respektivt .
til slutt har vi preget undergruppe ABCG2 + /ABCG2- og CXCR6 + /CXCR6- av melanom for uttrykket av melanom forbundet antigener (MAA) med henblikk på en mulig immunterapeutisk tilnærming mot mer aggressive subpopulasjoner uttrykke ABCG2 og /eller CXCR6.
Resultater
Identifikasjon av CXCR6 som en biomarkør for asymmetrisk selvfornyelse divisjon
Tidligere har vi rapportert studier med en genmodifisert dyrket celle modell som gir eksperimentelt styrte asymmetriske selvfornyelse divisjoner tilsvarende de i TSSCs [15], [16], [17]. Cellene inneholder en Zn-regulert villtype p53-cDNA-genet. I Zn-fritt medium, er disse cellene dele med symmetriske cellekinetikk, som produserer to sykkel celler fra hver avdeling. Disse skillene modell symmetrisk TSSC divisjoner der to stamceller blir produsert. I ZnCl
2-supplert kulturmedium, påfølgende normale nivåer av p53 uttrykk indusere asymmetriske selvfornyelse divisjoner som er preget av divisjoner som produserer en sykling søster og en søster som arrestasjoner på G1 /S. . Disse divisjonene modell asymmetriske TSSC divisjoner som produserer en stamcelle og en celle som enten skille ut eller fungerer som stamfar for en differensiering celle avstamning
I genet microarray-analyser (NCBI-GEO data base, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dlmlzmuowumsqxy acc=GSE25334),
Cxcr6
ble identifisert som et gen hvis uttrykk var umulig å oppdage i symmetrisk selvfornyende congenic p53-null kontroll-celler dyrket i ZnCl
2-supplert medium. Imidlertid ble det indusert i p53-induserbare celler som gjennomgår asymmetrisk selvfornyelse under de samme dyrkningsbetingelser. Kvantitativ RT-PCR-analyser viste at symmetrisk selv fornye celler gjorde uttrykkelig
Cxcr6
mRNA på en påviselig nivå; men dens uttrykk økte 8,6 ± 4,4 ganger (n = 6 analyser; p = 0,002). i celler indusert å skifte til asymmetrisk selvfornyelse
Den første microarray analyser viste også at asymmetrisk selvfornyelse var obligatorisk for økningen i
Cxcr6
uttrykk; og derved indikerte at den økte ekspresjon var ikke på grunn av p53-ekspresjon alene.
Cxcr6
uttrykk var også umulig å oppdage i congenic p53-induserbar celler genmanipulerte med tvungen uttrykk for den type II inosinmonofosfatdehydrogenase genet (IMPDH II), selv når p53 uttrykk ble indusert. Ekspresjon av IMPDH II, det hastighetsbegrensende enzym for cellulær guanin ribonukleotid-biosyntese, forhindrer p53-indusert asymmetrisk selvfornyelse, og samtidig la p53-avhengig genregule intakt [16], [18], [19]. Ved dette kriteriet,
Cxcr6
ble definert som en bestemt «asymmetrisk selvfornyelse forbundet (Asra)» genet.
For å undersøke Asra biomarkør egenskaper CXCR6 protein, vi undersøkte sitt mønster av uttrykk bestemmes ved indirekte
in situ
immunfluorescens (ISIF) deteksjon i to beslektede encellede selvfornyelse mønster analyser. I den første, søster paret analysen (SP, [19]), Cellene blir sådd ut ved en tilstrekkelig lav tetthet til å tillate avgrensning av beslektede celler ved deres relativt større nærhet etter delingen. I den andre, blir cellene analysert etter divisjon i nærvær av cytokalasin D (CD, [20]). CD hindrer cytokinese, men hindrer ikke kjernefysisk divisjon. De binucleated Cellene derved produserte tilveiebringe en mer sikker sammenligning av beslektede kjerner
I tidligere anvendelser av SP (tidligere kalt. «Datter par;» [19] og CD-assays, bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering ble anvendt som en markør for sykkel S-faseceller. for de foreliggende studier, brukte cellesyklusen fase-spesifikt protein cyklin A som en indikator på sykkel celler. syklin A er et vel beskrevne markør for sykkel celler som øker progressivt i nivå fra slutten av G1 fase til G2 fasen av cellesyklus [21]. de epifluorescence mikroskopi i fig. 1 viser hvordan indirekte ISIF kan være ansatt i SP og CD-analyser for å skille asymmetrisk selv fornye celler (asym) fra symmetrisk fornye seg (SYM). Under forhold som fremmer symmetrisk selvfornyelse, søster celle parene og CD-arrestert binucleated cellene vise en høy frekvens av symmetrisk cyclin A gjenkjenning. i kontrast, under forhold som fremmer asymmetrisk selvfornyelse, et asymmetrisk mønster av cyclin A uttrykk er vesentlig hyppigere.
Synlig er eksempler på epifluorescens og fasekontrastmikrografer fra parallell SP og CD-analyse, som beskrevet i teksten. SYM, symmetrisk selvfornyelse (Congenic p53-null utviklet cellelinjer dyrket i ZnCl
2-supplert medium). Asym, asymmetrisk selvfornyelse (Zn-avhengige, p53-induserbare konstruert celler dyrket i ZnCl
2-supplert medium). DNA, DAPI nukleært DNA fluorescens. CyA, indirekte ISIF med spesifikke antistoffer for cyclin A. CXCR6, indirekte ISIF med spesifikke antistoffer for CXCR6. Merk at i asym staten, er CXCR6 oppregulert i sykkel celle, hvilke modeller asymmetrisk selv fornye TSSCs. Fase, fasekontrast-mikros. Scale bar = 50 mikrometer.
Som vist i fig. 1 er CXCR6 protein påvises både i cytoplasma og cellekjernen av de genetisk modifiserte celler som anvendes for å identifisere CXCR6 som en biomarkør Asra. Nivået av kjerne uttrykk er høyere i celler under betingelser for asymmetrisk selvfornyelse, i samsvar med den mRNA-ekspresjon dataene, som ble beskrevet tidligere. I både SP og CD-analyse, under forhold med symmetrisk selvfornyelse er CXCR6 protein påvist i begge kjerner av beslektede celler. I motsetning til dette, under betingelser som fremmer asymmetrisk selvfornyelse,-celler viser en høyere frekvens av det asymmetriske uttrykksmønster som også er direkte korrelert med den asymmetriske mønster av cyclin A. I kvantitative CD analyser, under betingelser for symmetrisk selvfornyelse, bare seks % av binucleated celler viste koordinere asymmetrisk uttrykk for cyclin A og CXCR6; mens 27% viste dette bestemt mønster under betingelser for asymmetrisk selvfornyelse (p = 0,001). Disse funnene identifisere CXCR6 som et første-beskrevet oppregulert biomarkør av celler som gjennomgår asymmetrisk selvfornyelse som TSSCs.
ABCG2 og føflekkreft formasjon
I en nyere artikkel, publisert vår gruppe som ABCG2 er uttrykt ved en subpopulasjon av humane melanomceller (cellelinje WM115) som uttrykker høyt nivå av CD133 [4]. Vi utvidet denne analyse av ABCG2 til to ytterligere melanomcellelinjer avledet fra den samme pasient melanom.: Primære melanomcellelinje IGR39 og det tilhørende metastatiske linje IGR37
Først, som vist i tabell 1, analyserte vi tre polymorfismer C /A (421 C A), C /T (S248T) og C /T (F208S) i usorterte populasjoner og i ABCG2 + og ABCG2- sortert subpopulasjoner avsløre en heterozygot statusen ABCG2 for alle de tre polymorfismer. Disse resultatene er i samsvar med opprinnelsen av cellelinjer fra samme pasient. Vi har fokusert på disse polymorfismene siden SNP 421C A er mest vanlig mellom forskjellige grupper [22] og har blitt assosiert med redusert ekspresjon av proteinet ABCG2 [23]. Videre ble F208S og S248P polymorfismer forbundet med defekt aktiv transport av metotreksat og haematoporphyrin [24]; og særlig F208S variant proteiner (både-glykosylert og umodne former) er anerkjent som misfoldede proteiner ved antatte «Check Point» systemer og lett gjennomgå ubiquination og protein nedbrytning i proteasomer [25].
henholdsvis ~11% og ~40% av celler i aktivt voksende kulturer av IGR37 og IGR39 hadde påviselig ekspresjon for ABCG2 (fig. 2). IGR37 og IGR39 celler ble sortert i ABCG2 + og ABCG2- subpopulasjoner og transplantert inn NOD-SCID mus (n = 3 for hver undergruppe evaluert). Usorterte celler ble også injisert i NOD-SCID-mus (n = 3) for sammenligning. Etter to måneder ble mus fra alle kullene ofret. Tumormasser ble skåret ut, avbildes, veid, og spaltet for å isolere en enkelt cellesuspensjon for videre analyse. Som vist i tabell 2 og fig. 3, transplantasjon av ABCG2 + IGR37 celler resulterte i tumorer med to ganger større masse i gjennomsnitt sammenlignet med svulster som oppsto fra ABCG2- celler (p 0,01). Interessant, injeksjon av usorterte IGR37 celler også resultere i mindre svulster enn ABCG2 + celler som var statistisk lik i størrelse til svulster fra ABCG2–celler (figur 3;. Tabell 2). Usorterte IGR39 celler resulterte i mindre tumormasser, sammenlignet med usorterte IGR37 celler (0,13 g vs. 1,4 gram, respektivt; p 0,01) 2 måneder etter injeksjon av cellene (tabell 1). ABCG2- sortert IGR39 celler viste ikke noen makroskopiske massene på dette endepunktet (tabell 2), mens ABCG2 + IGR39 celler produsert svulster med en 3,6 ganger økt masse i forhold til usorterte IGR39 celler (tabell 2; p 0,01).
Primær melanom IGR39 celler og metastatiske melanomer IGR37 celler ble inkubert med de angitte fluorescerende FITC-konjugerte antistoffer og analysert av flowcytometri som beskrevet i
Materialer og metoder
. Y-akser, side scatter; x-aksen, relativ fluorescens intensitet. Venstre paneler, analyser med isotype (IgG) kontroll antistoffer; midterste panelene, analyser med anti-ABCG2 FITC-konjugerte antistoffer. Etter FACS isolasjon basert på den angitte porten (blå omriss), ble ABCG2 + sorterte cellene analyseres på nytt for å bekrefte berikelse (høyre panel). Tall, prosent av totale evaluert celler.
5 × 10
5 usortert, ABCG2 + eller ABCG2- sorterte cellene ble injisert subkutant i fem uker gamle NOD-SCID mus (3 mus for hver eksperimentell tilstand). Etter 60 dager, ble tumormassen skåret ut og veiet fotografert.
Enkeltcellesuspensjoner ble oppnådd fra alle tumorxenografter og analysert Etter en til to passasje ved hjelp av strømningscytometri for å detektere ABCG2- uttrykke celler. I samsvar med tidligere observasjoner med WM115 menneskemelanomceller og melanom biopsier [4], ABCG2 uttrykk var umulig å oppdage i alle tumor xenograft cellepreparater (data ikke vist).
CXCR6 og føflekkreft formasjon
IGR37 og IGR39 cellepopulasjoner oppviste 10,6% og 9,6% frekvenser av uttrykk for CXCR6, henholdsvis (fig. 4). CXCR6 + og CXCR6- subpopulasjoner av IGR37 og IGR39 celler ble sortert og injisert i NOD-SCID-mus (n = 3 mus pr gruppe), slik det ble gjort for celler sortert på grunnlag av ABCG2 uttrykk. Overraskende, som vist i fig. 5 og Tabell 2, etter bare 21 dager fra injeksjon av CXCR6 + IGR37 celler, betydelige svulster viste seg at var i gjennomsnitt 1,8 ganger større masse enn svulster som oppsto fra usorterte IGR37 celler (p 0,01). Videre ble ingen svulster oppdages fra CXCR6- injiserte celler (tabell 2 og figur 6) etter selv 2 måneder. Videre gjorde CXCR6- cellene ikke viste noen masse selv etter 4 måneder. Lignende resultater ble oppnådd for IGR39 celler. CXCR6 + celler produsert svulster med 2,5 ganger større masse enn usorterte celler; og ingen masse ble påvist for de CXCR6- celler (tabell 2). Som for ABCG2, CXCR6 + celler var også umulig å oppdage i tumorxenotransplantater ved flowcytometri (data ikke vist).
Enkelt markør CXCR6 analyser. Primær melanom IGR39 celler og metastatisk melanom IGR37 celler ble inkubert med de angitte fluorescerende APC-konjugerte antistoffer og analysert av flowcytometri som beskrevet i
Materialer og metoder
. Y-akser, side scatter; x-aksen, relativ fluorescens intensitet. Venstre paneler, analyser med isotype (IgG) kontroll antistoffer; middel paneler, analyser med anti-CXCR6 APC-konjugerte antistoffer. Etter FACS isolasjon basert på den angitte porten (blå omriss), CXCR6 + sortert celler ble reanalysert for å bekrefte berikelse (høyre panel).
5 × 10
5 CXCR6 + sorterte cellene ble injisert subkutant i fem -week gamle NOD-SCID-mus (3 mus for hver eksperimentell tilstand). Etter 21 dager ble tumormassen skåret veid og fotografert.
5 × 10
5 CXCR6- sorterte cellene ble injisert subkutant i fem uker gamle NOD-SCID mus (3 mus for hver eksperimentell tilstand). CXCR6- celler ga ikke svulster.
Til slutt, vi analysert andelen CXCR6 + /ABCG2 + dobbel-positive celler for begge cellelinjer. Som vist på fig. 7, 6,7% og 3,1% av IGR37 og IGR39 celler henholdsvis var dobbelt-positive for ABCG2 og CXCR6. Når vi injisert ABCG2 + /+ CXCR6 doble positive IGR39 celler i NOD-SCID-mus, tumorer oppsto som hadde i gjennomsnitt fire ganger større masse sammenlignet med tumorer utviklet fra usorterte celler (p 0,01; tabell 2). Som IGR39 celler sortert basert på CXCR6 uttrykk alene, svulster fra IGR39 ABCG2 + /CXCR6 + celler kreves bare 21 dager for svulst deteksjon (tabell 2).
Dual markør analyser for CXCR6 og ABCG2. Primær melanom IGR39 celler og metastatisk melanom IGR37 celler ble inkubert med de angitte fluorescerende APC-konjugerte antistoffer og analysert av flowcytometri som beskrevet i
Materialer og metoder
. Venstre paneler, analyser bivariate fluorescens intensitet med respektive APC- og FITC-konjugert isotype (IgG) kontroll antistoffer; middel paneler, analyser bivariate fluorescens intensitet med respektive APC- og FITC-konjugert CXCR6 spesifikke og ABCG2-spesifikke antistoffer. Tall, prosent av det totale evaluert celler.
melanom fenotype av tumorxenotransplantater
multiparametric immunhistokjemisk analyse av ABCG2 + IGR37 celler xenografter (Tabell 3 og Figur 8) viste at svulsten stammer fra disse cellene får en homogen uttrykk for differensiering antigener HBM45, HMW-MAA, og av endotelin B-reseptoren, og en heterogen uttrykk for Melan-A antigen. Ingen spesifikk farging for ET-1 peptid kan dokumenteres. Alle celle forbundet progresjon antigener evaluert ble homogent uttrykk. Den ekstracellulære matrise makromolekyl tenascin ble oppdaget i svulsten pode som en omfattende interstitiell nettverk innfanging celle reder av variabel størrelse. Blant de føtale antigener analysert, ble ingen påvisbare nivåer av NY-ESO funnet mens en svak uttrykk for MAGE antigener ble observert. Lignende resultater er oppnådd for ABCG2 + IGR39 celler (data ikke vist).
Svulsten cellepopulasjon homogent uttrykk Melan-A (A) og HMW-MAA (B) differensiering antigener. Samme fordeling karakteriserer tumorprogresjon antigener HER-3 (C) og det ekstracellulære makromolekylet tenascin (D). Sistnevnte karakteristisk avgrenser tumor områder av variabel størrelse. (160 × forstørrelse).
Den CXCR6 + /ABCG2 + fenotype i humane melanoma biopsier
Selv om de evaluerte melanomcellelinjer ble avledet fra humane tumorvevet, den nylig beskrevet CXCR6 + /ABCG2 + celle-fenotype kan ha vært begrenset til dyrkede tumorceller. Derfor undersøkte vi 4 ukultur menneskelige melanom positiv lymfeknute biopsiprøver for tilstedeværelse av celler med CXCR6 + /ABCG2 + fenotype. Alle de fire biopsi speciments inneholdt en liten undergruppe av celler ABCG2 + (12,2%, 8,4%, 2,65%, 0,1%). En av disse tre inneholdt også en liten befolkning CXCR6 + (0,25%) og en liten befolkning dobbel positiv ABCG2 + /CXCR6 + (0,3%). Fig. 9 viser resultatene av flowcytometri analyse av CXCR6 + /ABCG2 + positive prøver.
Strømningscytometri-analyse av et humant melanom biopsiprøve for et CXCR6 + /ABCG2 + underfraksjon. En metastatisk melanom biopsiprøve ble behandlet som beskrevet i
Materiale og metode
og umiddelbart analysert ved flowcytometri. Venstre panel, analyser bivariate fluorescens intensitet med respektive APC- og FITC-konjugert isotype (IgG) kontroll antistoffer. Høyre panel, analyser bivariate fluorescens intensitet med respektive APC- og FITC-konjugert CXCR6 spesifikke og ABCG2-spesifikke antistoffer. Tall, prosent av total evaluert celler.
CXCR6 funksjon og CXCL16 nivåer i melanomcellelinjer
I en nyere artikkel, binding av CXCR6 av kløyvde oppløselig fragment av sin membran-bundet ligand CXCL16 ( «sCXCL16″), ble vist å forbedre spredning av carcinoma-cellelinjer [11]. Vi undersøkte effekten av den frie sCXCL16 ligand på vekst av IGR37 og IGR39 celler.
Nivåene av CXCL16 i mediet ved usorterte celler fra begge cellelinjer og i tilsvarende CXCR6 + celler ble analysert ved hjelp av ELISA (Fig. 10 ). Nivået av CXCL16 detektert var ekstremt lav (0,06 OD-enheter ± 0,03, n = 8). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom usortert cellen og CXCR6 + sortert celler etter 3 dager med kultur (Fig. 8).
50000 celle /brønn ble belagt i 24 multi-brønners plater. Når cellene nådde ~90% konfluens (~3-4 dager), ble mediet samlet og kort sentrifugert. En 50 ul aliquot av medium ble brukt for CXCL16 deteksjon ved hjelp av Menneskelig Quantikine Immunoassay CXCL16 (R 0,01). Som i gjennomsnitt 1,4 ganger i celle nummer som svar på sCXCL16 tillegg
tjue tusen celler ble sådd over natten i individuelle brønner av 12 fler -vel platene i komplett medium vekst tilstand. Rekombinant sCXCL16 (100 ng /ml) ble tilsatt den neste dag og erstattet hver 48 timer. På den fjerde og syvende dag av kultur, ble cellene trypsinert og levedyktige celler bestemt. Den søylediagram som representerer middelverdien ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter hver utført i tre eksemplarer. *, P 0,01
vs
. ubehandlede celler (svarte striper); **, P 0,001
vs
. ubehandlede celler (svarte striper).
Føflekkreft assosiert antigen (MAA) uttrykk og ABCG2 versus CXCR6 uttrykk
Uttrykket profil MAA tilhørighet til kreft testis antigener (CTA) Familie ( MAGE-A1, A2, -A3, -A6, GAGE 1-2, GAGE 1-6, SSX-2, SSX 1-5, og NY-ESO-1) og HMV-MAA ble utført ved RT-PCR . Som vist i tabell 4, ble tilsvarende registreringsmønster for ABCG2 + og ABCG2- subpopulasjoner observert for begge cellelinjer. I tillegg er behandling med DNA hypomethylating midlet 5-aza-2′-deoksycytidin var i stand til å indusere en
de novo
ekspresjon av MAGE-A3, MAGE A4-, GAGE 1-2, 1-6 GAGE og SSX 1-5 i begge ABCG2
+ og ABCG2
-. IGR37 melanomceller (tabell 5)
Med hensyn til CXCR6 + og CXCR6- celle subpopulasjoner i IGR37 og IGR39 cellepopulasjoner, samt dobbel-positive ABCG2 + /+ CXCR6 IGR37 celler, var det en overlapping av de CTA familien og av HMW-MAA (tabell 6). Videre i CXCR6 + IGR37 svulst xenograft, alle MAA familie proteiner overlappet med unntak av CXCR6 + IGR37 celler for tyrosinase, Mart-en, og GP100 (tabell 6).
Diskusjoner
Et grunnleggende problem i kreftforskning er å identifisere den celletype som er i stand til å opprettholde neoplastisk vekst. Det er vist at de fleste kreftceller er kloner, og at cancerceller representerer avkommet av en enkelt celle (omtalt i [6]). Imidlertid er det uklart hvilke celler besitter tumor initiere cellefunksjon, under opprettholdelse av tumorvekst. Ideen om kreft stamcelle teori er at spesifikke celler (
dvs.,
Kreft stamceller, cscs) besitter de nødvendige regenerative egenskaper som fører til tumordannelse [6]. Et annet viktig poeng, opp til nå uklare, er opphavet til de antatte cscs [6]. En viktig måte å vise at en spesifikk subpopulasjon kan opprettholde tumorvekst er å bruke xenograft-modeller for humane celler eller syngenisk modeller for murine celler. Men en viktig kritikk om, i særdeleshet, er det xenograft modell som det er en kunstig modell, som for eksempel ved at det heterologe miljøfaktorer ikke anses [6]. På den annen side, er et annet viktig punkt for å identifisere markører som er i stand til å definere et kreft /initiere stamcellepopulasjon.
I den foreliggende papir, har vi identifisert en ny biomarkør som er forbundet med asymmetrisk selv- fornyelse, chemokine co-reseptor CXCR6. I tillegg til rollen CXCR6 i immunresponsen [10], [12], mer nylig, CXCR6 ekspresjon har blitt rapportert i noen humane tumorer, inkludert melanom [12]. Sammenligning av to foreldre humane melanomcellelinjer, IGR39 (primær) og IGR37 (metastatisk), sistnevnte var mer aggressive for svulst xenograft dannelse i forhold til primære melanom IGR39 celler. Denne forskjellen i tumorigent potensiale ble reflektert i CXCR6 sortert delpopulasjoner. Egentlig CXCR6 + -celler resultert i større tumormasse i en signficantly kortere tidsperiode, sammenlignet med usorterte celler. Videre gjorde CXCR6- celler ikke medføre noen betydelig, observertumormasse. Siden CXCR6 ekspresjon ble funnet å være knyttet til asymmetrisk selvfornyelse som er typisk for TSSCs, MCSCs synes å være avledet av vevs-spesifikke melanocyttstimulerende stamceller. Selv om det er postulert at asymmetrisk selvfornyelse ved TSSCs skal ablateres for dem å bli tumor forløpere [9], [15], slike muterte celler kan fremdeles beholde markører assosiert med tidligere benyttet kapasitet for asymmetrisk selvfornyelse, selv etter denne TSSCs funksjon endres ved mutasjoner.
Flere ABC-transportører er blitt funnet å være over-uttrykt i cancercellelinjer dyrket under seleksjonstrykk [6]. Spesielt i forhold til melanom, er ABCB5 overuttrykt i melanoma og ABCG2 er uttrykt ved et sub-fraksjon av CD133-positive melanomcellepopulasjon [4], [5]. Heri, viser vi for første gang, et forhold mellom ABCG2 og asymmetrisk selvfornyelse. Faktisk, ABCG2 + celler ga en større tumormasse enn ABCG2- celler i immundefekte mus. Imidlertid CXCR6-uttrykkende celler var mer aggressiv for tumordannelse enn ABCG2-uttrykkende celler, noe som tyder på at en undergruppe CXCR6 + /ABCG2 + celler kan være de mest potente MCSCs.
På den annen side, det er derfor heller ikke en interessant spørsmål ABCG2 + heller CXCR6 + celler ble påvist i tumorxenotransplantater. De kan være for sjelden, eller de kan ikke få den nødvendige miljø innspill til uttrykk i immunsvikt mus. Faktisk, hvis vi dyrket tumorer avledet fra ABCG2 + eller CXCR6 + -celler deres ekspresjon returneres i kulturen etter en til to passasjer [4] (data ikke vist). I denne forbindelse er det viktig å understreke at vår analyse av humane melanom biopsier bekreftet tilstedeværelsen av en ABCG2 + /+ CXCR6 underfraksjon i humant vev. Dette funnet er viktig for å utelukke muligheten for at det ABCG2 + /CXCR6 + cellefenotyp eksisterer bare i cellekultur. Dermed synes det mer sannsynlig at ekspresjon av proteinene er forhindret ved en eller annen ukjent mekanisme i immunodefekte mus, eller andre arter generelt.
Målretting av MCSCs kan presentere en ny og mer effektiv klinisk metode for human melanoma behandling. Imidlertid kan deres spesifikke antigen profil hemme den kliniske resultatet av immunterapeutiske strategier for disse pasientene. I denne sammenheng har vi undersøkt hvorvidt MCSCs profilen for spesifikke tumor-assosierte antigener (TAA) som for øyeblikket anvendes som terapeutiske mål i klinisk sammenheng. Egentlig kan mangelen på egnede terapeutiske mål på MCSCs faktisk resultere i at langvarig motstand mot behandling, opprettholdes av utvekst av TAA-negative melanomcellekloner. I denne sammenheng har fremveksten av TAA-negative celler i stand til å unngå immun kontroll er rapportert i melanompasienter som gjennomgår behandling immunologisk [26]. Kreft testis antigener (oppfordringer) som omfatter store familier av metylering-regulert og strengt relaterte TAA, først identifisert i menneske melanomer [27], representerer de mest lovende terapeutiske mål for tiden benyttes i melanom pasienter. [15].
