Abstract
Bakgrunn
tumornekrosefaktor alfa (TNF) er i stand til å drepe kreftceller via reseptor-mediert celledød krever adenosin trifosfat (ATP). Klinisk bruk av TNF så langt er i stor grad begrenset av sin dype levertoksisitet. Nylig ble det funnet i murine system som spesifikk beskyttelse av hepatocytter mot TNF er skadelige virkninger kan oppnås ved fruktose-mediert ATP uttømming deri. Før ansette denne ganske attraktivt utvalg prinsipp i en første klinisk utprøving, vi her grundig undersøkt den gjensidige avhengigheten mellom ATP uttømming og TNF levertoksisitet i både
in vitro Hotell og
ex vivo
eksperimenter basert på bruk av primær pasientvev materialer.
Metoder
primære humane hepatocytter, og både ikke-tumor og tumorous pasient avledet vevssnitt primær lever ble brukt til å belyse fruktose-indusert ATP uttømming og TNF-indusert cytotoksisitet.
Resultater
PHH samt vevssnitt fremstilt av ikke-maligne humane leverprøve som gjennomgår en fruktose-mediert ATP uttømming ble begge vist å være beskyttet mot TNF-indusert celledød. I kontrast, på grunn av tumorspesifikt overekspresjon av heksokinaseløsning II, som pålegger en dyp bypass på hepatocytic spesifikke fruktose katabolisme, dette var ikke tilfelle for mennesketumor leveren vev.
Konklusjon
Normal humane levervevet kan beskyttes forbigående mot TNF-indusert celledød av systemisk behandling med fruktose brukt i ikke-toksiske /fysiologiske konsentrasjoner. Selektiv TNF-målretting av primære og sekundære svulster i leveren ved forbigående og spesifikk uttømming av hepatocytic ATP åpner opp en ny klinisk avenue for TNF-basert behandling av leverkreft
Citation. Weiland T, Klein K, Zimmermann M, Speicher T, Venturelli S, Berger A, et al. (2012) Selektiv Protection of Human levervev i TNF-Targeting for kreft i leveren ved Transient Nedbryting av adenosin trifosfat. PLoS ONE 7 (12): e52496. doi: 10,1371 /journal.pone.0052496
Redaktør: Johannes Haybaeck, Medical University Graz, Østerrike
mottatt: 09.08.2012; Godkjent: 19 november 2012; Publisert: 18.12.2012
Copyright: © 2012 Weiland et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av ICEPHA bevilgning 2009-09, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB /TRR77), den føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF, # 0315755) og Robert Bosch Foundation, Stuttgart, Tyskland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
systemisk bruk av svært potent antineoplastisk cytokin tumor nekrose faktor (TNF) er sterkt begrenset
på grunn av funn at TNF er pleiotrope funksjoner indusere alvorlige systemiske bivirkninger
, særlig høy klasse levertoksisitet [ ,,,0],1], [2]. Derfor ble systemisk administrering av TNF erstattet i selekterte tumor enheter med hell ved regimer som bare anvender lokale perfusjoner av ekstremitetene med TNF [3], [4]. Men slike strategier vært unnvikende for isolerte lever perfusjon (IHP) anvendes for behandling av ondartede sykdommer i leveren [5] -. [8]
Nylig har TNF-indusert apoptose hepatocytic ble anerkjent som en meget ATP- avhengig prosess i en murin modell [9]. Videre er det bevis på at fruktose fører til ATP uttømming utelukkende i hepatocytter. Som en funksjonell følge av hepatocytter (i motsetning til sine motstykker sverte) oppviser beskyttelse mot TNF-indusert apoptose [9], [10]. Dette biologisk forskjell mellom hepatocytter og ondartede celler ble tilskrevet en transformasjon relatert overekspresjon av heksokinase II (HKII) som fører til en bypass av den hepatocytic spesifikke fruktose katabolisme [10]. I nærvær av fruktose, de kritiske lever-spesifikke enzymer ketohexokinase (KHK) og aldolase B (AldoB) etablere en reversibel, hepatocytic-spesifikk ATP felle [11]. Overekspresjon av HKII omgår denne synke
slik at
fruktose omdannes fortrinnsvis til fruktose-6-fosfat og metabolisert via «muskel-type» glykolyse uten å påvirke cellulære ATP-nivåer (vist i detalj i figur 1).
Økt ekspresjon av heksokinase II (HKII) i tumorceller resulterer i en muskel-type metabolisme av fruktose (nedre del av bildet) som ikke omfatter noen uttømming eller fangst av ATP. I motsetning til dette, hepatocytter (øvre del av bildet) benytter enzymene ketohexokinase (KHK) og aldolase B (aldoB) og derved en lever-type metabolisme av fruktose. Som et resultat, er det en meget hurtig ATP-avhengige omdannelse av fruktose via KHK til fruktose-1-fosfat som virker som en fosfat synke drastisk å få ned cellulære nivåer av ATP.
På molekylært nivå,
denne fruktose-mediert hepatocytter spesifikke beskyttende effekt mot TNF
er mest sannsynlig oppnås ved ADP nedbrytningsproduktene, som akkumuleres i form av adenosin. Nylig,
ble det vist at adenosin fremkaller en autokrin adenosin 3 «, 5»-cyklisk monofosfat respons
, negativt påvirker TNF-indusert aktivitet av c-Jun-N-terminal kinase (JNK) i en proteinkinase A -avhengig måte [12].
i vår studie undersøkte vi muligheten til å overføre denne tilnærmingen fra murine data for det menneskelige system med hensyn til fruktose-mediert forbigående ATP uttømming og dermed iverk selektiv avvæpning av TNF sin destruktive hepatocytic egenskaper. For dette formål, vi utnyttet (i) dyrkede primære humane hepatocytter (PHH) og (ii) presisjon-cut skiver av friske mennesker levervev
versus
ondartede humane lever vev avledet fra pasientenes lever resectates i en translasjonell e
x vivo
tilnærming. I tillegg til tidligere gjennomført murine eksperimentering, w
e nå var i stand til å oversette fått kunnskap om fruktose-mediert lever beskyttelse i den menneskelige fysiologisk sammenheng som gir grunnlag for fremtidig fase I /II kliniske studier
.
Materialer og metoder
Etisk uttalelse
kultivert, primære humane hepatocytter (PHH) blir behandlet fra fersk tatt leverprøve oppnås under leverkirurgi. Følgelig trenger PHH ikke utgjør en cellelinje; PHH er primære celler. PHH fra ulike donor pasienter ble gitt av T.S. Weiss med informert pasienten samtykke med hensyn til å ta prøvene i henhold til retningslinjene for og godkjent av den veldedige statskontrollerte menneskelig vev Cell Research Foundation, HTCR (for direkte informasjon vennligst gå til: https://www.htcr.de/english/supply.html)., Og av A. Königsrainer og M. Schenk (DPT general, Visceral Transplant Surgery Universitetssykehuset, Tübingen, Tyskland) med informert pasienten samtykke med hensyn til å ta de prøvene som er godkjent av den lokale etiske komité (Ethik-Kommision an der medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Ethic provisjon av det medisinske fakultet Eberhard-Karls-University og University Clinic Hospital Tübingen). Deltakerne fikk gi sine skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien. Den Tübingen etisk komité godkjente dette samtykket prosedyren og Tübingen etikkutvalg ikke har noen innvendinger mot denne studien. Humane lever og leverkreft resectates ble oppnådd med informert pasienten samtykke fra DPT. general, Visceral Transplant Surgery, universitetssykehus, Tübingen, Tyskland, i henhold til retningslinjene i den lokale etikkutvalg. Deltakerne fikk gi sine skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien (dvs. donasjon av kirurgiske prøven til Tübingen tumor og normal bank vev). Denne prosessen ble dokumentert ved å signere den respektive pasientinformasjon. Den Tübingen etisk komité godkjente dette samtykket prosedyren og Tübingen etikkutvalg ikke har noen innvendinger mot denne studien (Ethik-Kommision an der medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Ethic provisjon av det medisinske fakultetet ved Eberhard- Karls-universitetet og Universitetssykehuset Tuebingen). Ingen Forskningen ble gjennomført utenfor vårt hjemland.
Cell kultur
Primære humane hepatocytter ble dyrket i DMEM supplert med 100 U /ml penicillin /streptomycin (Serva, Heidelberg, Tyskland), 18,8 ug /ml hydrokortison (Merck, Darmstadt, Tyskland) og 1,68 mU /ml insulin (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Danmark). Tumorcellelinjer ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum. Alle celler ble dyrket i en fuktet inkubator med 37 ° C og 5% CO
2. HepG2 ble oppnådd fra ATCC, Hep3B og PLC /PRF /5 ble erholdt fra ECACC og HuH7 ble oppnådd fra Riken Gene Bank. Celle identiteter ble testet ved DNA-typing (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle celler ble testet for å være negativ for mycoplasma forurensning.
Precision-kutt vev slicing
Kutting av vevsprøver startet innen en time etter reseksjon på en vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Tyskland) i iskald oksygenmettet Krebs-Henseleit buffer (KHB) inneholdende 25 mmol /l glukose (Merck, Darmstadt, Tyskland), 25 mmol /l NaHCO
3 og 10 mmol /l HEPES (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) etter lagring i Custodiol (Franz Köhler Chemie, Alsbach, Tyskland) [21]. Skivene ble inkubert i oksygenert Williams E medium inneholdende 25 mmol /l glukose og 50 ug /ml gentamycin (Lonza Bioscience, Verviers, Belgia) i en oksygenert atmosfære (80% oksygen, 5% CO
2).
Stoffer
Rekombinant human TNF alfa ble kjøpt fra Innogenetics (Ghent, Belgia). Fruktose og ActinomycinD (ActD) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Tyskland).
Behandling av celler og skiver menneskelig vev
Celler og skiver ble forbehandlet med 50 mM fruktose i 30 min og med 1 ug /ml ActD 15 minutter før administrering av 100 ng /ml TNF. Caspase ble utført etter 8 timer, LDH utslipp og cytokeratin 18-cleavage ble utført 24 timer etter TNF behandling.
cytotoksisitetsassayer
Prosentandelen av laktat dehydrogenase (LDH) meldingen ble bestemt ved bruk LDH Mono-P assay (Analyticon, Lichtenfels, Tyskland) beregnet som forholdet supernatanten /(supernantant + lysat). I vevssnitt, mengden av LDH som blir frigjort i supernatanten ble bestemt og normalisert til proteininnholdet i de enkelte skiver. Kaspase-aktivitet ble bestemt ved inkubering med 50 uM substrat
N
-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aminomethylcoumarin (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburg, Tyskland) i analysebuffer (50 mM HEPES , pH 7,4, 1% sukrose, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT). Underlaget cleavage ble målt kinetisk ved spektrofluorimetri. Kaspase-aktivitet ble bestemt som hellingen av den resulterende lineære regresjoner og uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter pr minutt. Cytokeratin 18-spalting ble bestemt i supernatanten av vevssnitt ved hjelp av M30 CytoDEATH ELISA kit (Peviva, Bromma, Sverige) i henhold til produsentens instruksjoner.
ATP besluttsomhet
ATP-innholdet ble målt ved hjelp av den CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega, Mannheim, Tyskland).
kvantitativ real-time PCR
Høykvalitets total RNA (0,5 mikrogram) var omvendt transkribert ved hjelp Reverse Transcription Kit og tilfeldig heksamer (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. mRNA uttrykk ble målt ved bruk av TaqMan 7500 eller 7900HT fra Applied Biosystems med bestemte ferdig utviklet analyser for aldolase B (Hs01554887_m1), heksokinase II (Hs00606086_m1) og ketohexokinase (Hs00240827_m1) versus standardkurver av pCMV6-XL vektorer som inneholder cDNA av de tilsvarende gener (kjøpt fra Origene, Rockville, USA). 18S RNA (4308329, Applied Biosystems) ble brukt for normalisering.
statistikker
Forsøk ble gjort i henhold til tilgjengeligheten av prøver og gjengitt minst 5 ganger. Alle data er avbildet som fold endring i kontroll, som er satt til 1. Feilfelt indikerer gjennomsnitt ± SEM. Statistiske forskjeller ble bestemt ved en uparet t-test. All statistikk ble beregnet ved hjelp av programmet GraphPad Prism 4.01 (GraphPad Software Inc.) og ap verdi. 0,05 ble ansett som viktig
Diskusjon
Transient uttømming av mobilnettet ATP oppnådd i
Resultater og primære humane hepatocytter ved hjelp av fysiologiske konsentrasjoner av fruktose
Når sammenlignet med ubehandlede kontroller, ATP-konsentrasjonen av PHH
ble funnet å være redusert i en konsentrasjonsavhengig måte
etter 30 min inkubering med fruktose , som oppviser en gjennomsnittlig reduksjon på 30% av kontroll ved en konsentrasjon på 50 mM (figur 2A, lengst til høyre datapunkt, sammenstilling av seks humane donorer). Kinetisk, ATP ble funnet å være oppbrukt i løpet av 5 min (figur 2B) til et midlere minimum ~40% sammenlignet med ubehandlede kontroller. Dette ATP uttømming var spontant reversible som sett av fremveksten av ATP innhold på 120 minutter og deretter (figur 2B, samling av åtte menneskelig givere). Dermed cellulære energi butikker av hepatocytter gikk en konstant bedring i løpet av de neste par timer å forlate en forbigående utarming vindu. Viktigere, i løpet av fruktose-mediert forbigående utarming av cellulær ATP, vi fant ikke noen innflytelse på hepatocytic levedyktighet som indikert av fravær av noen betydelig økning i LDH utgivelse før og etter oppstart av fruktose behandling (figur 2C, sammenstilling av data fra fire menneskelige givere ). Av notatet, har noen dyrkning av PHHs utenfor vår observasjonsperiode på 1440 minutter (dvs. 24 timer) vist seg å føre til en betydelig økning av LDH utslipp til cellekultursupernatanter (våre upubliserte resultater) som indikerer en betydelig andel av desintegrerte PHHs utover 24-timers terskel. Derfor «langsiktige» resultater vedrørende PHH levedyktighet utover 24 timer er ikke gjennomførbart i denne sammenheng. Samtidig vår videre grunnleggende karakterisering av PHH kulturer også har vist at ATP innholdet i disse primære celler reduseres sakte allerede i løpet av de første 24 timer med testing. Derfor er det ikke mulig å beholde samme ATP-nivåer (100%, målt på start /initiering av disse forsøk) i løpet av 24 timer PHH dyrkning. Imidlertid er dokumentert utvinning av opptil 60% av den opprinnelige ATP-nivå uten noen vesentlig frigjøring av LDH indikerer at virkningen av fruktose på ATP-nivåer er meget reversibel og at hepatocytter er i stand til å takle dette forbigående reduksjon i cellulære ATP innenfor et begrenset spekter av dyrknings tid (dvs. i løpet av den 24-timers tidsrom).
(A-C) PHH av humane donorer ble behandlet med økende konsentrasjoner av fruktose (A) eller behandlet med en fast konsentrasjon på 50 mM fruktose (B); ATP-innhold ble bestemt etter 30 min (A) eller ved forskjellige tidspunkter som vist (B); LDH-frigivelse av PHH etter inkubering med 50 mM fruktose ble bestemt etter angitte tidspunkter (C). Data er gitt som gjennomsnitt ± SEM.
Derfor innføre nedsatt beskyttelse mot TNF i isolerte lever perfusjon (IHP) ser ut til å være mulig fra et klinisk synspunkt. I en studie av Cortez-Pinto
et
al
., Friske frivillige samt pasienter med ikke-alkoholholdige steatohepatitis (NASH) var bolus-injisert med fruktose. Deretter ATP-nedbryting ble kontinuerlig overvåket ved NMR-spektroskopi i opp til 60 min. Både friske frivillige samt NASH pasienter ble funnet å vise en rask (12 min etter fruktose injeksjon) og forbigående reduksjon av cellulær ATP (restaurering av lever ATP butikker å bli oppdaget ved 60 min post fruktose injeksjon) [13]. Derfor dette arbeidet ved Cortez-Pinto
et
al
. vil være medvirkende til å overvåke både tidsforløpet og omfanget av ATP uttømming i fremtiden fase I /II kliniske studier som skal utføres på pasienter som viser primære og sekundære kreft i leveren.
Også andre grupper observert en slik hurtig reduserende virkning på ATP i løpet av 30 min ved en dose på opptil 250 mg fruktose /kg kroppsvekt ble anvendt i friske frivillige. I samsvar med våre eksperimentelle resultater, ble ingen skadelige effekter på leveren (f.eks, med hensyn til forhøyede transaminaser) beskrev for slike fruktose-lasteprosedyrer [13] – [17]
oppregulering av heksokinaseløsning II og oppheving av. lever- fruktose-type metabolisme i leveren tumorvev
det ble nylig vist i levertumorcellelinjer som under prosessen med malign transformasjon en dyp oppregulering av heksokinase II (HKII) inntreffer noe som kan forklare
at den fysiologiske fenomenet lever ATP fangst er forbigått i tumorceller product: [10]. For ytterligere å undersøke denne mekanismen vi brukte fersk resected eksemplarer av humane lever vev, dvs. celler som ikke er underlagt eventuelle gjenstander knyttet til prosessen med immortalization. Sammenligning av transkripsjonsnivåer HKII, AldoB, og KHK, ble det midlere nivå av HKII transkripsjon funnet økt 7,6 ganger i humane leversvulster i forhold til ikke-tumor primære humane levervev blir normalisert til faktor 1 (tabell 1). I motsetning til dette, ble AldoB og KHK funnet å være redusert i de fleste undersøkte tumor vev og tumorcellelinjer (bety fold endringer en i forhold til ikke-tumor primære humane levervev blir normalisert til faktor 1) (tabell 1). I henhold til Warburg hypotesen om ervervet endringer i metabolisme under progresjon av ondartede sykdommer, også kreft i human lever kan romme et miljø kjennetegnes ved mangel på næringsstoffer og oksygen via et endret metabolsk utstyr, særlig i deres ikke-oksyderende, det vil si glykolytisk energi metabolismen [18]. Derfor kan overekspresjon av HKII og dermed endret fruktose metabolisme ved primær eller sekundær kreft i leveren fungere som et verktøy for å etablere selektiv lever beskyttelse i TNF-baserte tumor terapi ved hjelp av en tilleggs fruktose administrasjon.
TNF-cytotoksisitet er deaktivert av fruktose-mediert ATP uttømming i PHH
Deretter konsekvensene av lever ATP uttømming ble vurdert på nivået av cytotoksisitet og caspaseaktivering i humane primære hepatocytter. Som surrogatmarkør av membranintegritet, mengdene av LDH-frigivelse ved eksponering til 100 ng /ml TNF alene (100 ng /ml; fremstilt som -fruc i figur 2A), eller til en kombinert fruktose forbehandling (15 min; + fruc i figur 2A ) /TNF-behandling (50 mM fruktose; 100 ng /ml TNF) ble bestemt i humane donor-avledede PhH prøver. Gjennom disse forsøk, ble sensibilisering til TNF-indusert celledød forbedret ved tilsetning av RNA-syntese inhibitor actinomycin D (ActD, 1 pg /ml), som blokkerer oppregulering av eventuelle beskyttende overlevelses gener [19]. Ved undersøkelse av PHH avledet fra resekterte humane leverprøver (figur 3A), nivåer av midlere TNF-indusert LDH-frigivelse ble alle funnet å bli dempet betydelig i løpet av fruktose-lasting. I overensstemmelse med dette funn funksjonell, morfologiske endringer å være typisk for de TNF-induserte apoptotiske modus for celledød (f.eks archetypical atom kondensasjon og membran blebbing) ble også funnet å være i det vesentlige opphevet ved forbehandling fruktose (figur 3B). Som eksemplifisert på PhH flere apoptotiske fenomener som (i) kondensasjon av nuclei (figur 3B, øvre venstre panel; Hoechst farging), samt (ii) blebbing av tumorcellemembraner (figur 3B, nedre venstre panel; fasekontrastmikroskopi) var tydelig detektert som respons på TNF behandling alene; imidlertid forbehandling med fruktose enstemmig førte til en nesten fullstendig oppheving av disse TNF-induserte fenomener (figur 3B, øvre og nedre høyre paneler). I tidligere arbeid, det allerede har vist at i hepatocytter TNF-mediert aktivering av NF-kappa B oppheves i løpet av vår regime av samtidig ansettelse av ActD eller CPT, pålegge en generell hemming på lever transkripsjon [20]. Derved trenger hepatocytter som gjennomgår et kombinatorisk behandling med enten ActD /TNF eller CPT /TNF ikke ha noen mulighet til å uttrykke tilstrekkelige mengder av anti-apoptotiske proteiner som cFLIP eller XIAP hvis ekspresjon kan ha blitt utløst av TNF-indusert NF-kappa B- mediert signalering. Følgelig hepatocytter som gjennomgår fruktose-mediert nedbrytning av ATP i nærvær av enten ActD /TNF eller CPT /TNF er ikke i stand til å motvirke inhibering av TNF-medierte hepatocytic død via aktivering av pro-overlevelse effektor reaksjonsveier, slik som aktivering av NF-kappa B signalering [20].
Cultured PHH av seks forskjellige donorer ble behandlet med 400 ng /ml ActD alene eller i kombinasjon med 100 ng /ml TNF og 50 mM fruktose som angitt. Cytotoksisitet ble bestemt etter 24 timer med LDH-frigivelse-analysen som er avbildet som middelverdi gangers endring i ubehandlet kontroll, blir satt til 1 (*: p 0,05, uparet t-test). (B) Bilder av PHH ble tatt 12 timer etter behandling og illustrere TNF-indusert apoptose kondensasjon av kjerner i avhengighet av fruktose-lasting (+/- fruc) (øvre panel: Hoechst flekker) og membran blebbing (nedre panel: fasekontrastmikroskop ). Hvit søyle viser 10 mikrometer.
oppheving av TNF-indusert celledød i henhold til ATP nedbrytende forhold i humane levervevet
For å nærme våre spørsmål i en pasient-individuell innstilling utover isolert , dyrkede celler og cellelinjer,
ex vivo
presisjon-cut vev slice teknologien ble tilpasset for våre eksperimentelle situasjon [21]. Humane levervev skiver med en diameter på 0,8 cm og en tykkelse på 200-300 um bestående av 10-15 cellelag, som rommer -10
6 leverceller i gjennomsnitt, ble fremstilt fra ferske resekterte leversvulster og tilsvarende ikke- ondartet levervev, inkubert i 24-brønners plater (figur 4B). Prøver av ikke-tumorøse humane levervev og humane tumorvev var av forskjellig opprinnelse (se tabellform i figur 4A), inkludert hepatocellulært karsinom (HCC), kolorektal karsinom (CRC), pankreatisk karsinom (PC), og kolangiokarsinom (CC). Som levedyktighet kontroll, presisjon-cut skiver av menneskelig levervev (A, venstre kolonne) og menneskelig svulstvev (A, høyre kolonne) ble infisert som standard med en GFP markør genet som koder adenovirusvektor (adv-GFP, MOI 1) en time etter vevsskjæring for å bestemme vitaliteten av vevssnitt dyrket i 24-brønners plater. Bare levende celler, stiller store områder blir positivt for GFP maker genuttrykk i både tumorous og ikke-tumor primære humane levervevet gi mulighet for infeksjon og påfølgende uttrykk for virus-kodet markørgener (MERK: vevssnitt representerer multi-celle laget brikker av kirurgisk reseksjon vev (ved en utvalgt skivetykkelse på 200-300 um vi regne om 10-15 cellelag), og derfor er det teknisk sett ikke er mulig å bringe alle deler av de respektive skiver i fokus (figur 4B))
Typer av vevsprøver som brukes for generering av data i figur 4: hepatocellulært karsinom (HCC), kolorektal karsinom (CRC), pankreatisk karsinom (PC), og kolangiokarsinom (CC) (a). Som eksempler, presisjon-cut skiver av menneskelig levervev (B, venstre kolonne) og menneskelig svulstvev (B; høyre kolonne) ble infisert med en GFP markør genet som koder adenovirusvektor (adv-GFP, MOI 1) en time etter vevsskjæring for å bestemme den vitaliteten av vevssnitt dyrket i 24-brønners plater. Bilder ble tatt 24 timer etter infeksjon å bestemme viral GFP uttrykk som bare kan oppnås i vitale områder av vevsprøver (2,5 x /488 nm filter, hvite striper like 1000 mm)
Som surrogat. markører for cellulær toksisitet, (i) mengden av vev-frigjort LDH per mg protein, (ii) et ELISA-basert bestemmelse av cytokeratin 18-spalting korrelerende med kaspase-aktivitet og, (iii) den caspase-indusert DEVD spaltning aktivitet pr mg vev protein ble vurdert.
Resultatene er hentet fra vevssnitt demonstrerte den selektive natur av fruktose-mediert beskyttelse mot TNF også for pasient avledet primære lever og lever tumorvev. I primær ikke-maligne menneskelige leveren vev skiver, effekten av TNF-indusert levertoksisitet på (i) LDH frigjøring (figur 5A), (ii) cytokeratin 18-cleavage (figur 5B), og (iii) DEVD cleavage (figur 5C) henholdsvis, ble markert redusert i nærvær av fruktose i nesten alle prøver. I motsetning til dette, i primære, humane levertumor vevssnitt, ved en identisk forbehandling prosedyre med fruktose, i de fleste pasientprøver ingen beskyttelse mot TNFa cytotoksisitet ble observert, om ikke til og med en sensibilisering mot TNF-indusert celledød som vist ved nivået av (I) LDH-frigjøring (figur 5D), (ii) cytokeratin 18-spalting (figur 5E), og (iii) DEVD spalting (figur 5F), respektivt. Resultatene stammer fra menneskelig vev passer godt inn i resultatene som oppnås ved å benytte isolerte primære muse hepatocytter
in vitro Kjøpe og en murine modell av TNF-indusert leverskade
in vivo
av Latta
et
al
. [9]. TNF utøver en dyptgripende hepatisk apoptose og leverskade kvantifisert ved DEVD spaltning samt av LDH og plasma ALT frigivelse, respektivt. Men akutt TNF-indusert levertoksisitet og leverskader i primær isolerte murine hepatocytter og i mus, henholdsvis, ble fullstendig hemmet av ATP uttømming med 50 mM fruktose [9].
Tissue skiver avledet fra humane lever (A- C) eller levertumorvevet (D-F), respektivt, ble behandlet med 1 pg /ml ActD i kombinasjon med 100 ng /ml TNF og 50 mM fructose som angitt. Cytotoksisitet ble bestemt ved LDH-frigivelse analyse (A /C) og cytokeratin 18-spalting (B /D) etter 24 timer og etter DEVD spalting etter åtte timer (C /C). Data er vist som bety fold endringer i ubehandlet kontroll, blir satt til 1 (*: p 0,05, uparet t-test)
Følgelig vi her viser for første gang
ex. vivo
, utviste cellekultur gjenstander og gnager epiphenomena, at samtidig administrasjon av fruktose selektivt beskytter primære humane levervevet
ex vivo
. I kontrast er primære humane tumor vev avledet fra levermetastaser nesten ikke beskyttet
ex vivo
. Men på enkelte nivåer, i noen svulst pasient-avledet vevsprøver, fruktose-lasting mislyktes i å beskytte hepatocytter. Det må være oppmerksom på at endogene patologiske tilstander og sykdommer i leveren kan endre fruktose metabolisme og følsomhet for TNF. Videre er vev givere etter å ha mottatt neo-adjuvant behandling kan føre til endringer i tumor respons før den antatte utbruddet av en TNF-baserte terapeutisk regime
I analogi, i et sett med humane hepatiske tumorceller -. HepG2 ; Hep3B; HuH7 og PCL /PRF /5- verken en ATP reduserende effekt ble indusert ved forbehandling med fruktose (figur 6A) og heller ikke noen fruktose-formidlet beskyttelse mot TNF-indusert apoptose kan oppnås (figur 6B). Selv om sensitiviteten overfor TNF bestemt ved hjelp av LDH-frigivelse analysen var variabel mellom den benyttede tumorcellelinjer HepG2; HepB3; HuH7 og PLS /PRF 5, ingen reduksjon av LDH utgivelse i nærvær av 50 mM fruktose ble gitt.
levertumorcellelinjer HepG2, Hep3B, HuH7 og PLS /PRF /5 ble behandlet med økende konsentrasjoner av fruktose (EN). ATP-innhold ble bestemt etter 30 min (A) eller ved varierende tidspunkter som angitt. Data er gitt som gjennomsnitt ± SEM (n = 15). Den hepatiske tumorcellelinjer ble behandlet med 1 pg /ml ActD i kombinasjon med 100 ng /ml TNF og 50 mM fruktose som angitt. Cytotoksisitet ble bestemt ved LDH-frigivelse-analyse etter 24 timer (n = 15) (B). Data er vist som bety fold endringer i ubehandlet kontroll, blir satt til 1.
Sammenligning av transkripsjonelle nivå av glykolytiske enzymer HKII, AldoB, og KHK, var gjennomsnittlig nivå av HKII transkripsjon ble funnet å være økt i gjennomsnitt 34 ganger i de humane hepatiske tumorcellelinjer HepG2, Hep3B, HuH7 og PLC /PRF /5 i forhold til ikke-tumor primære humane levervev blir normalisert til faktor 1. i motsetning til dette enzymene AldoB og KHK ble funnet å være konstant eller redusert i de undersøkte tumorcellelinjer (bety fold endringer en i forhold til ikke-tumor primære humane levervev blir normalisert til faktor 1) som vist i tabell 1. den enzymatiske utstyret av tumorceller er svært indikativ for HKII bypass omgå ATP synke aktiv i primære hepatocytter. Følgelig er ingen ATP-nedbryting var tydelig i nærvær av opp til 50 mM fruktose. Interessant fra en mekanistisk synspunkt, i tidligere arbeid det allerede er påvist at effekten av fruktose på ATP uttømming og TNF-indusert tumor celledød kan være «kunstig» reversert når primær murine hepatocytter, være «naturlig» mangel for HKII som PHH, ble genet supplert med en vektor som bærer den murine HKII-genet [10]. I studiet av Speicher
et
al
. ble det funnet at den fysiologiske fruktose /ATP-felle ble forbigått (som i levertumorceller); som et resultat, beskyttelse staten «opprinnelig» oppnådd i primære hepatocytter henhold fruktose lasting nå var tapt, implementere et grovt økt følsomhet /toksisitet av primære hepatocytter mot TNF-indusert apoptose [10].
Konklusjoner
TNF utgjør en svært potent antineoplastisk legemiddel, som imidlertid hittil ikke kan brukes på pasienter med primære og sekundære tumorer i leveren på grunn av sin store levertoksisitet. For å overvinne denne hindringen, den kombinatoriske bruken av fruktose
som kan brukes til å utnytte metabolske forskjeller utgjør en selektiv beskyttelse av sunne hepatocytter mot TNF
synes å være en interessant terapeutisk alternativ. Basert på våre resultater som anvender utelukkende humane primære hepatocytter og presisjon snitt skiver av friske humane levervev
versus
ondartede humane levervev, synes det mulig at fruktose-indusert nedbrytning av ATP representerer en generell måte å beskytte human lever fra uønsket energi-avhengig celledød indusert av TNF i IHP-baserte lokale kreftbehandling der følsomheten av leversvulster mot cytotoksiske behandlinger er beholdt.
Takk
forfatterne er takknemlige til Christine Geisler, Igor Liebermann, Andrea Schenk og Irina Smirnow for utmerket teknisk assistanse.
