Abstract
Endringer i Ef reseptortyrosinkinaser er hyppige arrangementer i kreft hos mennesker. Genetiske varianter av EPHB6 har blitt beskrevet, men den funksjonelle utfallet av disse endringene er ukjent. Den aktuelle studien ble gjennomført for å screene for forekomst og å identifisere funksjonelle konsekvenser av EPHB6 mutasjoner i ikke-småcellet lungekreft. Her, sekvensert vi hele den kodende regionen til EPHB6 i 80 ikke-småcellet lungecancerpasienter og 3 tumorcellelinjer. Tre potensielt relevante mutasjoner ble identifisert i primærpasientprøver av NSCLC pasienter (3,8%). To punktmutasjoner ført til ustabil proteiner. En i ramme mutasjon (del915-917) viste økt migrasjon og akselerert sårtilheling
in vitro
. Videre del915-917 mutasjon økt metastatisk evnen NSCLC celler i en
in vivo
musemodell. Våre resultater tyder på at EPHB6 mutasjoner fremme metastaser i en undergruppe av pasienter med ikke-småcellet lungekreft
Citation. Bulk E, Yu J, Hascher A, Koschmieder S, Wiewrodt R, Krug U, et al. (2012) Mutasjoner av EPHB6 reseptortyrosinkinasehemming indusere en Pro-metastatisk Phenotype i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (12): e44591. doi: 10,1371 /journal.pone.0044591
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 8. mai 2012; Godkjent: 03.08.2012; Publisert: 04.12.2012
Copyright: © 2012 Bulk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NSCLC forskning i vårt laboratorium er finansiert av Deutsche Krebshilfe og Wilhelm-Sander Stiftung. SOM. ble finansiert av DFG Schw 407 /9-3. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er en ledende årsak til kreft dødsfall med de aller fleste tilfeller tilhører gruppen av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [1], [2]. Utvikling av fjernmetastaser er den viktigste årsaken til NSCLC relaterte dødsfall. Reseptor-tyrosinkinaser (RTK) spiller viktige roller i den metastatiske prosess [3], [4]. En av de mest kjente RTK forbundet med en metastase fenotype, er den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) med sin familiemedlemmer ErbB2 /Her2, ErbB3 og ErbB4. RTK’er, for eksempel EGFR-familien er derfor attraktive mål for forbedrede molekyl terapi tilnærminger i-kreft [3], [5]. Til dags dato er det Efrin (EPH) reseptorunderfamilien den største familien av RTK som består av 16 medlemmer i virveldyr, nemlig EPHA reseptorer 1-10 (EPHA1-A10) og EPHB reseptorer 1-6 (EPHB1-B6) [6], [ ,,,0],7]. EPHB reseptorer samhandle med Efrin familien av ligander. Ved interaksjon med sine Efrin ligander, EPH-reseptorer modulerer en rekke biologiske aktiviteter, inkludert celle-celle-interaksjon og cellevandring [8], [9]. Tap av den kinase-død EPHB6 er forbundet med avanserte stadier tumor og progresjon av kreft [10] – [16]. Flere publikasjoner rapportere om høy EPHB6 ekspresjon være en gunstig prognostisk markør i neuroblastom [10] – [12]. I tillegg ble mRNA ekspresjon av EPHB6 redusert i metastatisk melanom og i invasiv brystkreft-cellelinjer med metastatisk potensiale [14] – [16]. Funksjonelt, undertrykker EPHB6 invasivitet, vekst og kolonidannende effektivitet av dyrkede brystkreftceller [17] -. [18], regulerer celle adhesjon og påvirker migrasjon [19]
Tidligere identifiserte vi flere menneskelige RTK som uttrykk nivå korrelert med utviklingen av metastaser i tidlig stadium NSCLC [20]. Mens høy mRNA uttrykk av flere RTK var forbundet med en økt frekvens av metastaseutvikling, høy mRNA uttrykk nivåer av de to RTK EPHB6 og DKFZ1 indikerte en redusert risiko for metastasering [20]. Nylig identifiserte vi EPHB6 som epigenetiske forstummet metastase suppressor i NSCLC, og uttrykk for EPHB6 forhindret metastasedannelse i en xenograft metastase modell [21].
Her har vi gransket EPHB6 variasjon ved DNA-sekvensering, og karakteriserte funksjonelle konsekvenser av mutasjonene EPHB6
in vivo
og
in vitro
med hensyn til deres potensielle rolle i NSCLC metastasering.
A) funksjonelle domener av EPHB6-genet er vist i relasjon til sine eksoner og til identifiserte mutasjoner for EPHB6. Beskrivelsen av mutasjonene svarer til deres lokalisering i proteinsekvensen. Den mutasjoner R52C, Q498H, og DPG915-917del ble identifisert hos NSCLC pasientprøver i studien. B) elektroferogrammet av EPHB6-villtype-sekvensen og det delesjonsmutant for EPHB6. C) Expression nivåer av EPHB6-mutanter i transfekterte celler. Bulk transfekterte celler GFP sortert og utvidet i utvalg medier. Expression nivåer er vist for bulk kulturer med 90% GFP uttrykk. Forskjeller uttrykks analyse mellom protein nivåer og mRNA nivåer vises. For kvantitativ real-time PCR er vist gjennomsnittet og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. Den vestlige blot viser et representativt eksempel.
Materialer og metoder
Cell kultur
NSCLC cellelinjer som er involvert i studien har blitt beskrevet tidligere [21]. Kort sagt ble A549 lunge adenokarsinom-celler dyrket ved 37 ° C, høy fuktighet og 5% CO
2 i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, Invitrogen, Carlsbad, CA). Mediet ble supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% streptomycin og penicillin. HTB56 og HTB58 lunge adenokarcinomceller ble dyrket ved 37 ° C, høy luftfuktighet, og 5% CO
2 i MEM (Modified Eagle medium, Invitrogen, Carlsbad. CA). Mediet ble supplert med 10% FCS, 1% streptomycin og penicillin, 1% glutamin, 1% natriumpyruvat, og 1% ikke-essensiell aminosyre acid.Cell linje identitet ble bekreftet ved STR-genotyping.
pasientprøver
Primær vevsprøver og kreftfrie lunge vev ble oppnådd på tidspunktet for første operasjonen fra 80 pasienter med histologi utprøvd NSCLC ved et universitetssykehus i Tyskland. Prøvene ble umiddelbart sjokk frosset og lagret i flytende nitrogen. De tumorprøver ble sjekket for prosentandelen av tumorceller ved histologi, og bare tumorbiopsi med minst 70% kreftceller ble anvendt for etterfølgende analyser. Tilsvarende kreftfrie kontrollprøver ble også bekreftet av histologisk undersøkelse. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke, og studien ble godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Münster.
A) Protein uttrykk for stabilt transfekterte A549 cellelinjer som uttrykker villtype EPHB6 eller mutant EPHB6 sletting. Celler ble ko-transfektert ved hjelp av en EGFP -pcDNA3.1
+ vektor for identifisering av utvalgte kloner. Flere kloner ble slått sammen og ytterligere valgt som bulk kulturer. B) Transwell migrasjon ble utført med tom vektor kontrollceller, EPHB6 mutant og EPHB6 villtype celler. Fem forskjellige eksperimenter i triplicates ble analysert. *: Signifikant (p 0,05) forskjeller ved (ENTEN ANOVA eller t-test) Den oppgitte p-verdi mellom de tre ulike cellelinjer ble statistisk analysert fra alle migrerte celler ved hjelp av OneWay ANOVA-test. Analysen av de parvise t-testresultater i en signifikant p-verdi for kontrollcellene sammenlignet med EPHB6-wt-celler (p 0,015) og mellom de EPHB6-wt-celler og EPHB6-mut-celler (p 0,005) . C)
In vitro
sårtilheling scratch analysen. Cellene ble skrapet av en 10 mL pipette tips. De skrape områdene ble registrert over en periode på 17 timer. Vist er gjennomsnitt av tre forskjellige forsøk, beregnet som prosentandel fra en startpunktet for alle tre cellelinjer. Den ANOVA-test (p 0,002) viste statistisk signifikante forskjeller mellom de tre cellelinjer. D) Representative bilder av skrape analyser ved begynnelsen og slutten av forsøkene.
A) Antall av lungemetastaser i evaluerbare NOD /SCID mus fire uker etter transplantasjonen, hver med 3 × 10
5 stabilt transfekterte A549-celler som uttrykker EPHB6-vekt (n = 9), EPHB6-del915-917 (n = 9) eller tom vektor kontrollceller (n = 2). Dots representerer individuelle mus og horisontale linjer median verdien av metastaser. B) Bilder fra representative hele lungene av NOD /SCID mus, transplantert med A549 celler som uttrykker EPHB6-wt, EPHB6-del915-917, eller tom vektor kontroll. Lungemetastaser er markert med svarte piler. C) Bilder fra lunge deler av NOD /SCID mus, farget med hematoksylin. Metastaser er markert med svarte piler. Tre representative eksempler er vist hver for mus transplantert med A549 celler uttrykker EPHB6-wt eller EPHB6-del915-917.
A) proliferativ aktivitet av tom vektor kontroll, EPHB6 villtype og mutante celler ble analysert ved hjelp av en kolo MTT analyse etter 72 timer. Data er vist som middel +/- standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. Forskjellene var statistisk ikke signifikant (ANOVA). B) Cell størrelse på enkeltceller (n = 20) som vokser på plast retter ble analysert ved live video mikroskopi og registrert. EPHB6 mutante celler viste en betydelig redusert celle størrelse i forhold til EPHB6 villtype og kontrollere celler (p 0,05, t-test).
EPHB6 Sekvense
Genomisk DNA ble ekstrahert bruker DNAzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Primere ble utformet med Primer3 programvare (fordeler) for å forsterke polymerase-kjede-reaksjon (PCR) fragmenter størrelse mellom 400 og 800 bps og dekker den fullstendige kodende region av genet EPHB6 (detaljer av PCR er gitt i supplerende materiale). Alle Alle fragmenter ble amplifisert ved PCR med Taq DNA-polymerase (totalt reaksjonsvolum 20 ul) supplert med et hjemmelaget PCR enhancer som beskrevet [22]. Begge trådene ble sekvensert benytte PCR primere. Ytterligere interne primere ble anvendt for PCR-produkter lenger enn 600 bp for å sikre dobbeltkjedet sekvensinformasjon for hele PCR-fragmentet. Sekvensering ble utført på ABI3730xl automatiserte DNA sequencere med BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Den sekvensert kodende område av
EPHB6
ble sammenlignet med referansesekvensen (GenBank tilgangsnummer NM_004445).
seterettet mutagenese
kodende region av den menneskelige EPHB6 cDNA (base 833-3853 NCBI aksesjonsnr NM_004445) ble klonet inn i pcDNA4 til /myc /HISA uttrykk vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Mutasjoner i den kodende sekvensen til EPHB6 ble innført med Quickchange XL seterettet mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ved bruk av primere med sekvensene: forover (5′-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG), omvendt (5′- CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT) og bruker pcDNA4-EPHB6 vektor som mal. Etterpå ble riktig rekkefølge verifisert ved sekvensering. Primere for ytterligere mutasjoner vil bli gitt på forespørsel.
Expression konstruerer og Transfeksjon
Menneskelige A549 celler ble ko-transfektert med transfeksjon reagens Nanofectin (PAA, Østerrike) i henhold til produsentens protokoll. Co-transfeksjon ble utført med enten pcDNA4 (tom vektor kontroll), villtype EPHB6 ekspresjonskonstruksjon (pcDNA4-EPHB6-wt) eller EPHB6 mutant ekspresjonskonstruksjoner, hver med en EGFP uttrykker vektorkonstruksjon (pcDNA3.1-GFP, som uttrykker økede grønn fluorescent protein EGFP) for seleksjon og identifisering av transfekterte celler. Transfekterte celler ble selektert med 700 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO, USA) og 400 ug /ml Zeocin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Bulk kulturer var FACS sortert for GFP-uttrykk og utvidet. I tillegg til bulk kulturer, vi også samlet flere høy GFP uttrykke kloner å skaffe tilstrekkelig uttrykk nivåer. Expression ble bekreftet ved Western blotting og real-time RT-PCR.
RNA Isolation og revers transkripsjon
Total RNA ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). En total mengde på 1 mikrogram av RNA fra hver prøve ble revers-transkribert ved hjelp av tilfeldige primere og MMLV revers transkriptase henhold til produsentens protokoll (Promega, Madison, Wisconsin, USA).
genuttrykk Analyser av kvantitative Real- time RT-PCR
For kvantitativ real-time RT-PCR, cDNA ble forsterket i en ABI Prism 7700 sekvens detektor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). EPHB6 ble påvist med følgende primere og probe: forover (5′-TGGACTATCAGCTCCGCTACTATG), reverse (5’GTGGCAGTGTTGGTCTCGC) og probe (5′-fami- CCAGGCAGAAGACGAATCCCACTCCTT-TAMRA). De relative mengder av gen-ekspresjon ble beregnet ved hjelp av ekspresjon av GAPDH som en intern standard
Western Blot analyse
Proteiner ble påvist ved anvendelse av følgende antistoffer:. Anti-humant EPHB6 (1 ug /ml, Abnova Corporation, Neihu, Taipei, Taiwan, eller ABGENT, San Diego, CA, USA) og β-aktin (40 ng /ml, Sigma, USA) som primære antistoffer, geit anti-mus og Geit anti-kanin (begge fra Dianova, Hamburg, Tyskland) som sekundære antistoffer. Western blot-analyse ble utført som beskrevet [23].
Se Blå plus2
protein markør (Invitrogen) ble brukt som en størrelse indikator.
Boyden Chamber analysen
Det er totalt 5 × 10
5 A549 celler ( i 100 ul DMEM med 5% FCS) ble podet inn i den øvre del av en Transwell® kammer (Transwell filterinnsatser med diameter 6,5 mm med en porestørrelse på 5 um, Corning Inc., Corning, NY), som var 30 min forbelagt med 50 mikrogram fibronektin. I den nedre del av kammeret 600 ul DMEM medium med 20% FCS (en serum gradient ble anvendt som kjemotiltrekkende) ble tilsatt og analysen ble utført i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO
2 før migrerte cellene analysert ved hjelp av strømningscytometri. Alle analyser ble gjentatt fire ganger, og uavhengig er utført i tre paralleller
In vitro Wound Healing -. Ripe Assay
A549-celler ble sådd i en 25-ml vevskultur kolbe med en tetthet på 350.000 celler per kolbe og ble dyrket over en periode på tre dager. Konfluente cellemonolagene ble deretter skrapet med en 10 mL-pipette. Mediet ble utvekslet og sårheling ble registrert av live video mikroskopi. Bilder ble tatt til fange i 10 × min intervaller i 17 timer med en ZEISS (lys) mikroskop Axiovert 40C, knyttet til en CCD videokamera (Hamamatsu). Bilde Oppkjøpet ble kontrollert av Hipic 32 (High Performance Bilde Control System) eller WASABI (Hamamatsu Imaging Software). Analysen av sårheling ble utført ved anvendelse av Java-baserte bildebehandlingsprogram ImageJ. Analysene ble utført uavhengig for tre ganger.
Analyse av Cell Size
A549 celler som uttrykker EPHB6-villtype, den EPHB6-mutant eller lav EPHB6 (kontroll /tom vektor omformet) ble sådd på cellekulturflasker som ble forhåndsbelagt med en kollagen matrise. Cellene ble tillatt å holde seg i fem timer og deretter overvåket ved hjelp av et ZEISS (lys) mikroskop Axiovert 40C, som er knyttet til et CCD-videokamera (Hamamatsu). Bilde Oppkjøpet ble kontrollert av Hipic 32 (High Performance Bilde Control System) eller WASABI (Hamamatsu Imaging Software). ble utført analyse av cellestørrelsen av enkeltceller som beskrevet tidligere [24], ved hjelp av visualisering programvare Amira og den Java-baserte bildebehandlingsprogram ImageJ. Programvaren analysere parametere av cellulære funksjoner fra enkle celler, herunder bestemmelse av celleområdet (i um
2).
metastase Experiments in vivo
For alle museforsøk, har vi brukt 8 til 10 uker gammel NOD.CB17-Prkdc SCID /J (NOD /SCID) mus hentet fra Charles River. For å analysere metastaseutvikling ved intravenøs tumorcelle-injeksjon, ble 22 NOD /SCID-mus bestrålt med en enkelt dose på 3,5 Gy fra en kobolt-60 enhet 1 dag før transplantasjonen. Totalt 3 x 10
5 stabilt transfekterte celler (oppløst i 200 ul PBS) ble injisert intravenøst i halevenen. Fire uker etter transplantasjonen, ble musene avlivet, og utvikling av lungemetastaser ble analysert. I to tilfeller, mus døde innen en uke etter transplantasjon: en mus transplantert med EPHB6-wt uttrykker A549 celler og en mus transplantert med EPHB6-mutant uttrykker A549 celler. Metastaseutvikling ble evaluert ved å telle enkeltmetastatiske knuter. For histologiske analyser, ble lungene fiksert i 4% paraformaldehyd. I alle forsøkene ble behandlingsgruppene randomisert å hindre bur effekter.
Statistical Analysis
Alle eksperimentelle data er vist som gjennomsnitt pluss standardavvik hvis ikke annet er angitt. De midlere verdier av tre grupper ble sammenlignet ved OneWay ANOVA fra rådata eller i tilfelle av to grupper av studenter t-test. En tosidig p. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
EPHB6 Varianter i NSCLC
Alle eksoner av hele den kodende regionen EPHB6 ble sekvensert av Sanger basert sekvensering i en kohort av NSCLC pasienter. Blant 80 pasienter med NSCLC, ble tre (3,8%) tilfeller funnet å ha ikke-synonyme mutasjoner av EPHB6 (R52C, n = 1; Q498H, n = 1, og DPG915-917del, n = 1). Ingen EPHB6 mutasjoner ble identifisert i cellelinjer A549, HTB56 eller HTB58. En bioinformatikk analyse av SIFT og Polyphen indikerte punktmutasjoner R52C og Q498H som sannsynligvis skade (tabell 1). En database søk av nyere storskala-sekvenserings forsøk avslørte flere mutasjoner som hittil ikke er blitt ytterligere undersøkt (Fig. 1A).
EPHB6 mutasjoner ble identifisert i forskjellige eksoner og funksjonelle domener av genet. Forbløffende nok sletting del915-917 (Fig. 1B) ble plassert ved siden av to mutasjoner (D915G og G914V) nylig identifisert hos pasienter med tykktarmskreft [25], [26]. Klyngen av mutasjoner i dette området mellom tyrosin-kinase katalytisk (Tyrkc) domene og sterile alfa motiv (SAM) antyder funksjonell relevans ytterligere. Denne mutasjon ble identifisert i en pasient med lunge adenokarsinom. Mutasjonen var heterozygote og ble også påvist i tilsvarende normalt lungevev som indikerer en germline mutasjon. De andre mutasjoner ble utelukkende oppdaget i svulsten, og ikke i matchet friskt vev inficating en somatisk mutasjon.
For funksjonelle analyser, EPHB6-hvete og flere mutanter (R52C, Q498H, del915-917 og P728S mutasjon tidligere beskrevet i eggstokkreft [LIT]) ble stabilt co-transfektert med et EGFP-uttrykkende plasmider inn i NSCLC-cellelinjen A549 som uttrykker meget lave nivåer av EPHB6. EGFP positive kloner ble plukket og ekspresjon analyse ble utført ved western blotting ved anvendelse EPHB6 antistoff på enkle kloner og på bulk kulturer (fig. 2A). Til tross for vellykket transfeksjon med øket mRNA-nivåer, protein ekspresjon av de fleste av de EPHB6 mutanter økte ikke utover nivåene observert i tom vektor transfekterte celler (fig. 1C). Bare for del915-917 mutasjonen, ble protein uttrykk på nivåer tilsvarende EPHB6 hvete oppnådd (Fig. 2A). På grunn av den insuffisiens av tilstrekkelig protein uttrykk for R52C og G498H mutanter og tidligere beskrevet P728S mutant, vi funksjonelt fokusert på del915-917 mutasjon i NSCLC i senere eksperimenter.
Effekter av EPHB6 Mutasjoner om migrasjon og metastase av NSCLC-celler
Som rapportert, EPHB6 villtype hemmes migrering av stabilt transfekterte A549-celler i en transwell kammer (Boyden kammer) assay. I kontrast, celler transfektert med den mutante del915-917 EPHB6 migrerte betydelig raskere i dette assay (fig. 2B). I tillegg utførte vi skrape analyser med gjentatte video mikroskopi for å følge scratch nedleggelsen over tid. Hvete EPHB6 hemmet
in vitro
sårheling forhold til tom vektor, mens EPHB6 mutante celler lukket gapet mye raskere enn villtype (tre uavhengige eksperimenter, p 0,002, ANOVA; p 0,0004, t-test ) (fig. 2C, D). Det viste seg at EPHB6 mutant ikke bare hemme EPHB6 villtype aktivitet, men akselererte lukking av såret i forhold til tom vektor og hvete. Etter åtte timer med etterlevelse, det åpne området av EPHB6 muterte cellene begynner å redusere to ganger (3%) raskere som det kunne bli anerkjent for EPHB6 villtype celler (1,6%). Selv kontrollcellene viste mindre akselerasjon for sårheling (2%) på dette tidspunktet.
For å analysere
in vivo
effekter av EPHB6 mutasjoner på metastatisk kapasitet på NSCLC celler, vi utførte
in vivo
metastase analyser. NOD /SCID-mus ble injisert intravenøst med EPHB6-wt-celler (n = 10), EPHB6-del915-917-celler (n = 10) og tom vektorkontrollceller (n = 2). Fire uker etter transplantasjon ble musene avlivet og analysert. En mus i hver gruppe mus transplantert med EPHB6-wt og EPHB6-mut uttrykke celler døde innen en uke etter transplantasjon. Mus injisert med EPHB6 villtype overekspresjon celler viste lavere antall lungemetastaser sammenlignet med mus injisert med enten tom vektor kontroll celler eller EPHB6-mutant celler (Fig. 3): en mus ble funnet uten metastaser, 2 mus med hver 1 eller 3 metastaser og en mus med hver 4, 5 eller 8 metastase. En mus transplantert med EPHB6 villtypeceller ble funnet med et høyt antall lungemetastaser. Interessant, i alle mus injisert med EPHB6 mutante celler lungemetastaser var påvisbar (figur 3;. P = 0,011, t-test av data fra mus transplantert med EPHB6-vekt sammenlignet med EPHB6-mut-celler). En
in vitro
spredning analyse etter 72 timer (fig. 4A) viste at EPHB6 mutante celler ikke avvike fra EPHB6 hvete uttrykke celler i form av proliferativ aktivitet. Lignende resultater ble oppnådd i proliferasjonsanalyser analysert etter 48 timer (data ikke vist). Forsøkene heller foreslått at den økte metastatisk aktivitet
in vivo
var assosiert med endring av iboende trekkende egenskaper. EPHB6 villtype-reseptor-ekspresjon ikke signifikant å endre formen på cellene (selv om variasjonen i formen størrelse økes), mens størrelsen på EPHB6 mutante celler som vokste på vanlige plastskåler ble signifikant redusert (figur 4B;. P 0,05, t-test data fra 20 celler av EPHB6-wt og EPHB6-mut uttrykkende celler). I samsvar med disse funn kjemotaksen av EPHB6 celler på plastskåler som syntes å bli redusert, mest sannsynlig på grunn av redusert adhesjonsegenskaper. Men forskjellene var statistisk ikke signifikant (data ikke vist)
Diskusjoner
Efrin -. Ef reseptor interaksjoner blir ofte deregulert i kreft (Reference). I denne studien har vi identifisert mutasjoner av EPHB6 som en pro-metastatisk funksjon i ikke-småcellet lungekreft. En mutasjon, del915-917, var også til stede i matchet normalt vev, sterkt tyder på en germline endring. Kimcellelinje endringer har tidligere blitt beskrevet for EPHB6 i familiær kolorektalkreft Hittil de funksjonelle konsekvensene av disse genetiske forandringer på cellenivå er ukjent [25].
Endringer i Ef reseptorer ofte forekommer i lungekreft. En stor skala sekvense studie fant mutasjoner i 10 av 13 Ef reseptorgenene i lunge adenokarsinom [27]. På grunn av mangfoldet av Ef reseptor assosiert signal hendelser og komplekse nettverk av reseptorer, den funksjonelle utfallet av Ef reseptor avvik fortsatt uklare [28]. For de fleste av Ef receptor endringer identifisert hittil har funksjonelle konsekvenser ikke undersøkt.
Flere somatiske mutasjoner av EPHB6 genet har tidligere blitt identifisert i lungekreft [27], tykktarmskreft [25], [26 ], eggstokk-kreft [29] og gliom [26].
i denne studien, screening av 80 NSCLC pasientprøver og 3 NSCLC-cellelinjer identifisert tidligere ukjente 3-mutasjoner for EPHB6 genet. En av denne mutasjoner, del915-917, bosatt i domenet mellom tyrosin kinase og sterile alfa motiv (SAM) domene, hvor 2 somatiske mutasjoner ble nylig identifisert i tykk- og endetarmskreft [25], [26]. Funksjonen til dette domenet er foreslått å være relatert til kreft, og våre funn i dette arbeidet gjør støtter dette forslaget.
in vivo
eksperimenter viser klart at uttrykket av det muterte EPHB6 forbedret metastasering. I tillegg EPHB6-mutant uttrykke celler viste en tredelt forbedret transwell migrasjon mot et serum gradient (chemotaxis). Disse resultatene er i samsvar med våre
in vivo
resultater. Mus transplantert med EPHB6-mut celler utviklet signifikant (p = 0,011) flere lungemetastaser som mus transplantert med EPHB6-wt celler. I tillegg til de endrede funksjoner av EPHB6 del (915-917) mutant, noen aspekter kan også foreslå en forsterkning av funksjon. For eksempel, mønstre av sårtilheling skilte mellom EPHB6 wildytpe og mutant. Det er mulig at signalerings forskjeller mellom villtype og mutant-reseptoren. På den annen side kan det også være interessant å spekulere i at det muterte reseptoren kan opptre dominant negative til andre hemmende Ef reseptorer. Dette dominant negativ aktivitet kan føre til observasjon av potensielle vinning av funksjon potens. Åpenbart kan fremtidige studier avslører de underliggende forskjeller i signalering og påvirkning av andre medlemmer av EPH og EPH-reseptor-nettverk. Fremtidige studier kan også avsløre de funksjonelle effekter av de ikke-del915-917 mutasjoner. Det er sannsynlig at disse også inaktivere EPHB6 men dette må bekreftes i fremtiden.
Nylig kunne vi vise at EPHB6 ofte brakt til taushet av epigenetiske mekanismer i lungekreft [21], og andre kunne vise den samme inaktivering mekanisme i brystkreft [14]. Våre undersøkelser viste også at tap av EPHB6 induserer en svært metastatisk fenotype. I linje, er EPHB6 den reseptor-tyrosinkinase hvor lav ekspresjon er nærmest beslektet med dårlig prognose i tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft [20]. EPHB6 kan spille en viktig rolle i lungekreft metastase, gitt at det er ofte epigenetiske dempet og /eller mutert i en betydelig andel av pasienter. Dette gjør det mulig at EPHB6 er en relevant modifier av metastatisk kapasitet i lungekreft.
Til sammen mutasjoner i EPHB6 forekommer i ikke-småcellet lungekreft kan føre til en pro-metastatisk fenotype. Tap av EPHB6 funksjon av redusert uttrykk eller mutasjonsinaktivering kan derfor bidra til lungekreft metastaser.
Takk
Vi er takknemlige til Dr. Jianping Wu (University of Montreal, Quebec, Canada) for å gi EPHB6 cDNA.
