Abstract
P73, ett medlem av tumor suppressor p53 familie, aksjer svært strukturelle og funksjonell likhet med p53. Som p53 kan transkripsjonelt aktive TAp73 megle cellulær respons på cytostatika i humane kreftceller med opp-regulerer uttrykk for sine pro-apoptotiske målgener som PUMA, Bax, NOXA. Her viste vi en roman molekylære mekanismen for TAp73-mediert apoptose i respons til cisplatin i eggstokkreft celler, og det var uavhengig av p53 status. Vi fant at TAp73 fungerte som en aktivator av c-Jun N-terminal kinase (JNK) signalveien ved opp-regulerer ekspresjon av dens target vekststans og DNA-skade-induserbart protein GADD45 alfa (GADD45α) og etterfølgende aktivering av mitogen- aktivert protein kinase kinase-4 (MKK4). Inhibering av JNK-aktivitet ved en spesifikk inhibitor eller liten interfererende RNA (siRNA) i betydelig grad opphevet TAp73-mediert apoptose indusert ved cisplatin. Videre hemming av GADD45α av siRNA inaktivert MKK4 /JNK aktiviteter og også blokkert TAp73-mediert apoptose induksjon av cisplatin. Vår studie har vist at TAp73 aktivert JNK apoptotiske signalveien i respons til cisplatin i eggstokkreft celler
Citation. Zhang P, Liu SS, Ngan HYS (2012) TAp73-mediert aktivering av C-Jun N terminale Kinase Forbedrer Cellular kjemosensitivitet å Cisplatin i eggstokkreft celler. PLoS ONE 7 (8): e42985. doi: 10,1371 /journal.pone.0042985
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 24 februar 2012; Godkjent: 16 juli 2012; Publisert: 10 august 2012
Copyright: © Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Wong Sjekk Hun Charitable Foundation og forskningsfond fra Institutt for obstetrikk og gynekologi, University of Hong Kong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
P73, et nytt medlem av tumor suppressor p53-familien, er lik p53 både strukturelt og funksjonelt [1], [2]. Det p73-genet koder for mer enn 20 proteiner isoformer på grunn av bruk av forskjellige promotorer og alternativt post-transkripsjonell spleising. De transcriptionally aktive TAp73 isoformer, som inneholder hele N-terminal trans domene, kan binde spesifikt til p53 responsive elementer og transaktiverer noen av p53 målgener, og deretter induserer cellesyklus og apoptose, mens DNp73 isoformene, med avkortet N-terminal trans domene, virker som en dominant-negativ inhibitor av både TAp73 og p53 [1], [3], [4]. Interessant nok er TAp73 også en mediator av cellulær følsomhet overfor kjemoterapeutiske midler i humane kreftceller [1], [4] – [7]. Mange pro-apoptotiske gener, slik som Puma, Bax og NOXA, virker som aktivatorer av den mitokondrielle apoptotiske reaksjonsvei, og har p73 responsive elementer i deres promoter og kan være oppregulert ved p73 for å indusere apoptose i respons til kjemoterapeutiske medikamenter. I tillegg, p73-mediert oppregulering av død-reseptoren CD95, er en mediator av den ytre apoptotiske reaksjonsvei, også bidrar til p73-mediert apoptose i kreftceller i henhold til spennings stimuli [8]. Likevel, i motsetning til p53, de molekylære mekanismene implicating i p73-mediert cellulær apoptose er fremdeles ikke klart forstått. Forstå presise underliggende molekylære mekanismene vil være nyttig i målretting p73 som en god kandidat genet for kreftbehandling.
JNK tilhører en superfamily av mitogen-aktivert protein (MAP) kinaser. De JNK proteinkinaser inneholde Jnk1, JNK2 og JNK3. Jnk1 og JNK2 er overalt påvises. Den JNK3 er i hovedsak begrenset til hjernen, hjertet og testis [9]. Den JNK signalveien responser til ulike stress stimuli, gjennom transduksjon av oppstrøms MAPKKK inkludert MEKKs, og senere aktivering av JNK av fosforylert ved Thr og Tyr områder av JNK direkte oppstrøms kinaser MKK4 /MKK7. Aktivering av JNK fosforylerer og aktiverer den nedstrøms transkripsjonsfaktoren c-Jun og andre transkripsjonsfaktorer [9], [10]. JNK-signalveien fungerer som en nøkkel positiv modulator av celle apoptotisk respons på stress stimuli [9] – [11]. I tillegg JNK-signalreaksjonsveien bidrar kritisk for cisplatin-avhengig apoptose i kreftceller [12] – [15]
I denne studien ønsket vi å studere effekten av TAp73 (TAp73α) på cellulær respons overfor. cisplatin i eggstokkreft celler og de underliggende molekylære mekanismene. Vi var interessert i om TAp73 ville ha noen regulerende rolle i andre apoptotiske baner, slik som JNK signalveien, ved cisplatin behandling.
Resultater
TAp73α forbedrer cellular følsomhet for cisplatin i eggstokkreft celler
for å undersøke hvilken rolle TAp73 i eggstokkreft celler i respons til cisplatin, menneske cisplatin-resistent eggstokkreft cellelinjer SKOV3 (null-p53) og OVCA433 (villtype p53) ble stabilt transfektert med plasmid pEGFP -TAp73α (figur 1A). Effekten av TAp73α på cellulær respons overfor cisplatin ble vurdert ved både XTT celleviabilitet analysen og klonogene assay. Som vist i figur 1B og 1C, TAp73α betydelig økt cellulær følsomhet overfor cisplatin i både null-p53 SKOV3 og villtype p53 OVCA433-celler, sammenlignet med vektor-kontrollene. Slike effekter er observert i både kortsiktig (ved XTT analyse) og lang sikt (etter klonogene assay) kultur analyser. Videre celle apoptose indusert ved cisplatin ble også økt med over-ekspresjon av TAp73α, som dokumentert ved TUNEL-analysen og spaltet PARP uttrykk analyse (figur 2A og 2B). Disse resultatene indikerte at TAp73 fremmet cellulær følsomhet overfor cisplatin via induksjon av celle apoptose, og slik TAp73 funksjon var p53-uavhengig, ettersom effekten var like i begge villtype p53 og p53 null-celler.
( A) GFP-TAp73α overekspresjon stabile kloner i SKOV3 (C8, C24 og C28) og OVCA433 (C1, C7 og C12) celler ble verifisert av western blot analyse. (B og C) både XTT-assay levedyktighet og klonogene assay viste signifikant redusert celleproliferasjon i TAp73α-overuttrykt celler av SKOV3 og OVCA433 sammenlignet med tom vektorkontroll (V) i respons til cisplatin behandling. Prosentandelen av celler /kolonier overlevende i cisplatin i forhold til celler /kolonier i rusfritt medium kontroll ble målt. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk (*: p 0,05; **: p 0,01)
(A) TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og. OVCA433 C1, C7 og C12) og de tomme vektor kontrollene (V) av SKOV3 og OVCA433 ble behandlet med 4 ug /ml cisplatin i 48 timer. Apoptotiske celler ble vurdert ved TUNEL assay. Mer enn 500 celler ble telt for hver gruppe, og resultatene presentert var den relative av apoptotiske celler i totalceller og minst tre uavhengige eksperimenter ble utført (**: p 0,01). (B) TAp73α-overuttrykt celler og tom vektorkontroll ble behandlet med forskjellige doser (markerte) av cisplatin i 24 timer, og spaltingen av PARP ble påvist ved western blot-analyse.
TAp73α medierer aktivering av JNK-signalreaksjonsveien
Tidligere rapporter har vist at aktivering av JNK bidrar kritisk for cisplatin-indusert celle apoptose [12] – [15]. Vi antok derfor at TAp73α-mediert celle apoptose i respons til cisplatin kan opptre gjennom aktivering av JNK-signalreaksjonsveien. Effekten av TAp73α på aktivering av JNK-signaler ble først analysert ved å måle graden av fosforylering JNK (p-JNK) og dets substrat c-Jun (p-c-Jun) i TAp73α-overuttrykt celler. Som vist i figur 3A, ble både p-JNK og p-c-Jun tydeligvis forhøyet i TAp73α-overuttrykt-celler, sammenlignet med kontrollcellene. Økningen av p-JNK og p-c-Jun ble ytterligere forsterket i disse cellene i respons til cisplatin, bare en svak økning av p-JNK og p-c-Jun ble observert i kontrollcellene. Tids og doseavhengige forsøk viste at cisplatin-indusert JNK-aktivering forekom på et så tidlig som 6 timer, og opp til 48 timer etter at cellene ble behandlet med 4 ug /ml cisplatin, og den effektive cisplatin dose for JNK-aktivering var på så lavt som 2 ug /ml i 12 timer behandling i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8; OVCA433 C1; figur 3B). I tillegg til aktivering av JNK var avhengig av transactivational aktivitet av TAp73α som p-JNK nivå ikke ble endret i cellene stabilt over-uttrykker DNp73α (figur 3C og 3D), et avkortet isoform av p73 transaktivering uten aktivitet. For å verifisere om effekten av TAp73α overekspresjon fremme celle sensitiviteten var spesifikke for cisplatin, vi også utført tilsvarende forsøk med behandling av Taxol, som også er en første-linje kreft legemiddel som brukes for eggstokkreft behandling. Vi fant ut at Taxol var ikke i stand til å aktivere JNK veien i TAp73 overexpressed eggstokkreft celler, selv om TAp73α kunne forbedret celle følsomhet som svar på Taxol (figur S1).
(A) Økning av p-JNK og pc -Jun ble påvist i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og OVCA433 C1, C7 og C12) og ytterligere forbedret ved cisplatinbehandling (4 ug /ml i 24 timer), sammenlignet med kontrollene (P: foreldrecellene ; V: tom vektor kontroll). (B) TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) ble utsatt for 4 ug /ml cisplatin for forskjellige tidsperioder, eller til forskjellige doser av cisplatin i 12 timer. P-JNK-nivået ble målt ved hjelp av western blot-analyse. (C) DNp73α (GFP-DNp73α) var over-uttrykt i SKOV3 (D2) og OVCA433 (d18) celler. (D) Ingen JNK-aktivering ble observert i DNp73α-overuttrykt celler (SKOV3 D2 og OVCA433 d18).
Hemming av JNK aktivitet demper TAp73α-mediert apoptose i respons til cisplatin
Å ytterligere å utforske hvorvidt TAp73α-mediert aktivering av JNK bidratt til apoptose-induksjon i respons til cisplatin, en spesifikk inhibitor av JNK-aktivitet, SP600125, ble anvendt. Etter behandling med 20 uM SP600125 i 8 timer, ble p-JNK nivå reduseres opptil 60% i de TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1, figur 4A). I tillegg inhibering av JNK-aktivering ved SP600125 signifikant redusert celle apoptose indusert ved cisplatin i TAp73α-overuttrykt celler, som vist ved TUNEL-analysen og spaltet PARP uttrykk analyse (figur 4B og 4C).
(A) TAp73α- overuttrykte celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) ble behandlet med 20 mikrometer SP600125 for ulike tidsperioder (indikert). Fosforyleringen nivåer av JNK og c-Jun ble målt. (B og C) TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) og de tomme vektorstyreenheten (V) ble behandlet med 20 uM SP600125 eller DMSO og deretter med cisplatin. Den celle apoptose ble bestemt ved TUNEL assay (feilfelt angitt gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, *: p 0,05) og spalting av PARP-analyse. Inhibering av JNK attenuert TAp73α-mediert apoptose i respons til cisplatin. (D) TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) ble behandlet med JNK sirnas (Si-JNK) eller egge kontroll siRNA (Control). De aktiveringer av JNK og c-Jun var fraværende ved cisplatin behandling, og forbundet med betydelig redusert celle apoptose (E og F).
Aktivering av JNK veien ved TAp73α innblandet i cisplatin-indusert apoptose var også demonstrert av den observasjon at stillheten JNK1 og -2 i TAp73α-overuttrykt celler betydelig blokkert cisplatin-indusert celledød. Som vist i figur 4D, behandling av sirnas mot JNK1 og -2 i kreftceller (SKOV3 C8; OVCA433 C1) åpenbart nedregulert JNK1 /2-ekspresjon sammenlignet med de kodede siRNA kontrollene, og den etterfølgende behandling undertrykte fosforyleringen nivåer av JNK og underlaget c-juni Som dokumentert av TUNEL analysen og spaltet PARP uttrykk analysen, cisplatin-indusert apoptose i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8, OVCA433 C1) ble betydelig svekket av JNK stanse behandling (Figur 4E og 4F). Disse resultatene bekreftet videre at aktivering av JNK-reaksjonsveien ved TAp73α bidratt til TAp73α-mediert apoptose i eggstokkreft celler i respons til cisplatin.
TAp73α-mediert oppregulering av GADD45α er ansvarlig for aktivering av JNK-signalreaksjonsveien
GADD45α er blitt identifisert som en bindingspartner og aktivator av JNK oppstrøms kinase MEKK4 /MTK1, og dens binding til MEKK4 /MTK1 kan aktivere den nedstrøms genet MKK4 og JNK [17], [18]. På den annen side, er GADD45α en veldefinert target-genet av p73 [19], [20]. Således hypotese vi at GADD45α kan spille en rolle i aktivering av JNK-signalveien mediert av TAp73. Effekten av TAp73 på GADD45α ekspresjon ble først vurdert. Som vist i figur 5A og 5B, ekspresjon av GADD45α var oppregulert i både mRNA og proteinnivåene i TAp73α-overuttrykt celler. Som svar på cisplatin, TAp73α-mediert oppregulering av GADD45α protein ble ytterligere øket (figur 5B). Som GADD45α kommuniserer direkte med MEKK4 /MTK1 å aktivere underlaget MKK4 kinase [17], [18], da målte vi fosforylering nivået MKK4 i TAp73α-overuttrykt celler. Som vist i figur 5B, ble det observert økning av fosforylert MKK4 i TAp73α-overuttrykt celler og ytterligere forsterket som følge av cisplatin behandling. Disse resultatene antydet at TAp73α mediert aktivering av JNK-signalreaksjonsveien eventuelt gjennom opp-regulering av dens målgen GADD45α og påfølgende aktivering av MKK4, en oppstrøms komponent av JNK-signalreaksjonsveien.
(A) Økning av GADD45α mRNA-ekspresjon i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og OVCA433 C1, C7 og C12). (B) Økning av GADD45α protein uttrykk og MKK4 fosforylering nivå i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8, C24 og C28 og OVCA433 C1, C7 og C12). (C) GADD45α ble slått ned i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) ved sirnas (Si1-GADD45α og Si2-GADD45α) behandling. Aktivering av MKK4, JNK og c-Jun ble redusert, selv under cisplatin behandling.
For ytterligere å bekrefte disse funnene, et par siRNAs mot GADD45α (Si1-GADD45α og Si2-GADD45α) var brukes til forbigående knockdown den GADD45α uttrykk. Fosforyleringen nivåer av MKK4, JNK og c-Jun ble følgelig redusert på nedregulering av GADD45α, selv i respons til cisplatin behandling (figur 5C). Derfor fikk vi bekreftet at TAp73α-mediert oppregulering av GADD45α ble ansvarlig for aktivering av JNK signalveien i eggstokkreft celler.
GADD45α er ansvarlig for TAp73α-mediert apoptose
For å finne ut enten stillhet GADD45α har en effekt på cisplatin-indusert apoptose i TAp73α-overuttrykt-celler, ble cellene behandlet med GADD45α sirnas og celle apoptose ble målt. Som vist i figur 6, ble cisplatin-indusert apoptose dramatisk redusert i GADD45α-dempede TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8; OVCA433 C1). Disse funnene antydet at TAp73α-mediert oppregulering av GADD45α var ansvarlig for aktivering av JNK signalveien og celle apoptose i eggstokkreft celler.
Cell apoptose ble redusert i TAp73α-overuttrykt celler (SKOV3 C8 og OVCA433 C1) som svar på cisplatin etter GADD45α sirnas behandling. Den celle apoptose ble målt ved (A) TUNEL assay (feilstolper indikerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, *: p 0,05, **: p 0,01) og (b) spaltning av PARP assay
Diskusjoner
i denne studien, viste vi at for første gang, så vidt vi vet, TAp73 delvis mediert cellulær apoptose i respons til cisplatin gjennom aktivering av JNK signalveien i eggstokkreft celler. Vi har funnet at, i respons til cisplatin, TAp73α aktivert JNK-signalreaksjonsveien til ved oppregulering av sin nedstrøms genet GADD45α, og responsen var TAp73 avhengig og p53-uavhengig.
Etablert bevis har vist at den transkripsjonelt aktive TAp73 forbedret cellulær sensitivitet overfor kjemoterapeutiske legemiddel cisplatin i humane kreftceller [5] – [7], [21]. I tillegg har en fersk rapport viste at TAp73 uttrykk i eggstokkreft var mye høyere i responsive kreft sammenlignet med ikke svarer kreft [22]. Vår studie bekrefter at TAp73 gjorde forbedre cellular følsomhet for cisplatin i eggstokkreft celler. Selv om TAp73 er funksjonelt lik p53, har funksjonell p53-ekspresjon er vist å være nødvendig for TAp73-mediert celle apoptose i henhold til DNA-skade stimulering [23]. På den annen side er det enkelte studier antydet at p73-mediert kjemosensitivitet er uavhengig av p53-ekspresjon i enkelte kreftceller [5], [24]. I foreliggende undersøkelse, ble TAp73α-mediert apoptose er observert i p53-null SKOV3-celler, noe som indikerer at TAp73-mediert apoptose var p53-uavhengig, i det minste i vår cellemodell, noe som ytterligere understreker det uavhengige rolle p73 blant sine familiemedlemmer i DNA-skade respons.
JNK celledød sti fungerer som en viktig regulator av celle apoptose i respons til ulike stress stimuli og faktisk spiller en sentral rolle i apoptotiske baner, inkludert extrinsic (død reseptorer) [11] og egenverdi (mitokondrie ) trasé [11], [25]. Tidligere studier har vist at cisplatin-mediert aktivering av JNK-signalreaksjonsveien i kreftceller har bidratt kritisk for cisplatin-avhengig apoptose [12] – [15]. Oppregulering av Fas L uttrykk skyldes aktivering av JNK og underlaget c-Jun spilte en nøkkelrolle i cisplatin-indusert apoptose i eggstokkreft celler [15]. Våre resultater viste at JNK og dets substrat c-Jun ble aktivert i TAp73α over-uttrykte celler, og ytterligere utvidet i respons til cisplatin behandling. Undertrykkelse av JNK-aktivering av JNK-inhibitor eller JNK sirnas i disse cellene opphevet TAp73α-mediert apoptose. Disse resultatene antydet at oppregulering av JNK-aktivitet bidrar til TAp73-mediert apoptose-induksjon i eggstokkreft celler i respons til cisplatin. Dette var første gang for å vise at TAp73 fungerte som en oppstrøms aktivator av JNK-reaksjonsveien for å aktivere JNK signaler å indusere celle apoptose.
For ytterligere å utforske de underliggende mekanismene som TAp73 oppregulert JNK fosforylering nivå, en p73 target gen GADD45α var klar. GADD45α er et veldefinert nedstrøms genet av TAp73 og p53 [19], [20] og det kan induseres ved DNA-skadestoffer, og spiller en viktig rolle i induksjon av apoptose [26]. Interessant nok har tidligere undersøkelser vist at aktivering av JNK-apoptotisk reaksjonsvei ved GADD45α ble nøye implisert i GADD45α-mediert apoptose-induksjon [27], [28]. GADD45α direkte interaksjon med MEKK4 /MTK1 å aktivere substratet MKK4 kinase, og følgelig opp-regulerer JNK-aktivering, en hendelse som er involvert i apoptose-induksjon [17], [18]. Vår studie har vist at de uttrykk for både GADD45α og aktiv MKK4 ble oppregulert i TAp73α-overuttrykt celler, og denne effekten ble ytterligere forsterket etter cisplatin eksponering. På den annen side, når GADD45α ble stille, de aktiveringer av MKK4, JNK og c-Jun ble opphevet, selv under behandling av cisplatin, og den TAp73α-mediert cisplatin-indusert apoptose var også signifikant blokkert. Resultatene indikerte at TAp73 var i stand til å aktivere JNK apoptotiske sti med opp regulerende GADD45α uttrykk i eggstokkreft celler i respons til cisplatin.
Interessant forrige rapport har foreslått et krysstale mellom JNK sti og p73, og foreslo at JNK var en viktig regulator i p73-mediert apoptose som reaksjon på cisplatin [13]. De viste at p73 var et substrat av JNK kinase. JNK fosforylerte p73 på visse steder for å øke transkripsjon p73 aktivitet og p73-mediert apoptose i kreftceller i nærvær av cisplatin. I foreliggende studie viste vi at over-ekspresjon av TAp73 aktivert JNK-aktivitet i eggstokkreft celler, i respons til cisplatin. TAp73 fungerte som et oppstrøms aktivator av JNK-apoptotiske vei via oppregulering av GADD45α, og den etterfølgende aktivering av MKK4 (figur 7). Således våre resultater tilveiebragt en ny vinkel i forhold til krysstale mellom p73 og JNK-reaksjonsveien i celle apoptose reaksjon.
DNA skade middel, induserer cisplatin TAp73 opphopning og den påfølgende oppregulering av sine pro-apoptotiske målgener å indusere celle apoptose. Samtidig oppregulering av TAp73 målet genet, aktiverer GADD45α JNK apoptotiske vei via sin interaksjon med MEKK4 /MTK1 å indusere apoptose.
Samlet våre resultater tydelig støtte en ny vei av TAp73-mediert cellulær følsomhet for cisplatin i eggstokkreft celler. Vi demonstrerte at TAp73α indusert apoptotisk respons gjennom aktivering av GADD45α-MKK4-JNK celledød kaskade og gitt en ny scenario for krysstale mellom p73 og JNK-apoptotiske reaksjonsveien i henhold påkjenninger. Dette TAp73-avhengig og p53-uavhengig cellulær reaksjon ville spille en viktig rolle i DNA-skade respons i eggstokkreft celler, som p53-funksjon var defekt i de fleste kreftceller. En bedre forståelse av de underliggende mekanismene i TAp73-mediert apoptotisk respons er verdifull i målretting p73 som en terapeutisk kandidat genet.
Materialer og Metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
menneske~~POS=TRUNC eggstokkreft cellelinjer SKOV3 (null p53) og OVCA433 (villtype p53) var gaven fra Prof. Tsao, Anatomisk institutt, Universitetet i Hong Kong, hvor SKOV3 ble innhentet fra ATCC, Manassas, VA [29], og OVCA433 ble etablert og beskrevet tidligere [30]. De ble holdt i Minimal Essential Medium (MEM) (Invitrogen Corporation, Grand Island, YN), med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og inkubert i et 37 ° C fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2.
Cis-Diamineplatinum (II) diklorid (Cisplatin, CDDP) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), og JNK-spesifikk hemmer SP600215 (Calbiochem, San Diego, CA) ble oppløst i milli Q vann og dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma), henholdsvis, og deretter lagret ved -20 ° C. Disse oppløsninger ble ytterligere fortynnet i kulturmedium før cellen behandling. DMSO ble fortynnet i medium alene som kontroll.
Plasmider, siRNA og transfeksjon
pEGFP-TAp73α og pEGFP-DNp73α plasmider ble konstruert ved PCR-amplifisering av full lengde kodende region av TAp73α og DNp73α på cDNA av eggstokkreft celler. Og PCR produktene ble fordøyd og deretter klonet i ramme inn i pEGFP ekspresjonsvektor (Clontech laboratorier, Mountain View, CA). For stabile kloner ble pEGFP-TAp73α og pEGFP-DNp73α transfektanter valgt av G418 (Invitrogen) i 14 dager, og deretter enkelt kolonier ble plukket opp og verifisert av western blot analyse. De sirnas mot JNK og GADD45α og egge siRNA (negativ kontroll) (Applied Biosystems av Life Technologies, Foster City, CA) ble transfektert til celler ved 20 nM endelig konsentrasjon. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble benyttet for celle transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
RT-PCR
Total RNA fra celler som ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen), og cDNA ble syntetisert med høy kapasitet RNA-til-cDNA Master Mix kit (Applied Biosystems). De spesifikke primere (GGAGGAAGTGCTCAGCAAAG og TCCCGGCAAAAACA AATAAG) ble brukt til å forsterke menneskelig GADD45α cDNA.
Western blot analyse
Celler ble høstet med 0,05% trypsin /EDTA (Invitrogen) og proteiner ble hentet ved hjelp av konvensjonelle RIPA lysebuffer [16]. Antistoffene mot GFP, JNK og GADD45α ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). Antistoffene mot MKK4, PARP og c-Jun og de aktive formene av JNK, c-Jun (ser63) og MKK4 ble oppnådd fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA).
Celleviabilitet analyse
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved XTT (2,3-bis [2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl] -2H- tetrazolium-5-carboxanilide indre salt) kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene sådd ut i triplikat i 96-brønners plate og behandlet med cisplatin (4 ug /ml) på den følgende dagen. Cellelevedyktigheten ble målt etter en dags behandling i fire påfølgende dager.
klonogene assay
kolonidannende evne av celler ble målt ved hjelp av klonogene assay. Celler ble sådd ut i triplikat i medium inneholdende cisplatin (0,15 ug /ml) eller medikamentfritt medium i en konsentrasjon på 500 celler per brønn i 6-brønns plate. Etter 48 timers inkubering ble alle disse cellene tillatt å vokse i medikamentfritt medium i 10-12 dager. Overlevende kolonier ble fiksert i 75% etanol og deretter beiset i en% Giemsa (Merck, Damstadt, Tyskland). Kolonier bestående av mer enn 50 celler ble talt opp.
apoptose analysen
apoptotiske celler ble undersøkt ved TUNEL analysen (In Situ celledød Detection Kit, Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut på dekk en dag før 4 ug /ml cisplatin behandling i 48 timer. Etter fiksering og permeabilisation, ble cellene farget med TUNEL reaksjonsblandingen, og motfarget med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol) (Sigma).
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. SPSS 16,0 programvare (SPSS) ble anvendt for dataanalyser. T-test ble anvendt for å vurdere forskjellen mellom gruppene. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
TAp73α forbedret cellulær følsomhet for Taxol, men ikke via JNK-reaksjonsveien. (A) XTT levedyktighet analyse viste TAp73α-overuttrykt celler av SKOV3 og OVCA433 var mer følsomme for Taxol behandling, sammenlignet med tom vektorkontroll (V). (B) Når cisplatin eller Taxol behandling i 24 timer ble fosforylering nivået av JNK ikke økt i SKOV3 og OVCA433 celler behandlet med Taxol, selv med TAp73α over-ekspresjon celler (C: kontroll; D: cisplatin: T50 og T500: 50 ng /ml og 500 ng /ml Taxol)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0042985.s001 plakater (TIF)
takk
Vi takker professor SW Tsao , Institutt for anatomi, Universitetet i Hong Kong for å gi eggstokkreft cellelinjer OVCA433 og SKOV3.
