Abstract
Prostatakreft er den vanligste visceral malignitet i vestlige menn og en viktig årsak til kreft dødsfall. Økt aktivering av AKT og NFkB veier har blitt identifisert som kritiske trinn i prostata kreft initiering og progresjon. GGAP2 (GTP-bindende og GTPase-aktiverende protein 2) er en multidomain protein som inneholder en N-terminale Ras homologi domene (GTPase), etterfulgt av en PH domene, et C-terminalt domene GAP og en ankyrin gjenta domene. GGAP2 kan direkte aktivere signaliserer via både AKT og NFkB trasé og fungerer som et knutepunkt for crosstalk mellom disse banene. Økt GGAP2 uttrykk er til stede i tre fjerdedeler av prostatakreft. Mutasjoner av GGAP2 har blitt rapportert i cellelinjer fra andre kreftformer. Vi analyserte derfor 84 prostatakreft vev og 43 godartet prostata vev for somatiske mutasjoner i GGAP2 ved direkte sekvensering av enkelte kloner avledet fra GAP og GTPase domener av normal og svulstvev. Totalt sett, halvparten av cancere inneholdt mutant-GAP domene kloner og i 20% av kreft, 30% eller mer av kloner var mutant i GAP-domenet. Overraskende, mutasjonene var heterogene og nonclonal, med flere forskjellige mutasjoner er til stede i mange tumorer. Lignende funn ble observert i analysen av GTPase domene. Mutante proteiner GGAP2 hadde signifikant høyere transkripsjonelle aktivitet ved anvendelse av AP-1 som reagerer reporter-konstruksjoner når sammenlignet med villtype-proteinet. Videre ble tilstedeværelsen av disse mutasjoner assosiert med aggressiv klinisk oppførsel. Tilstedeværelsen av høyfrekvente nonclonal mutasjoner av et enkelt gen er ny og representerer en ny modus for genetisk endring som kan fremme tumorprogresjon. Analyse av mutasjoner i kreft har blitt brukt for å forutsi utfallet og lede terapeutisk mål identifisering men slike analyser har fokusert på klonale mutasjoner. Våre studier viser at i noen tilfeller høyfrekvente nonclonal mutasjoner kan trenge å bli vurdert som godt
Citation. Cai Y, Wang J, Ren C, Ittmann M (2012) Hyppig heterogene missense mutasjoner av GGAP2 i prostatakreft : Konsekvenser for tumorbiologi, klonalitet og Mutasjon analyse. PLoS ONE 7 (2): e32708. doi: 10,1371 /journal.pone.0032708
Redaktør: Sharon A. Glynn, National University of Ireland Galway, Irland
mottatt: 01.12.2011; Godkjent: 31 januar 2012; Publisert: 28 februar 2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering: Støtte for MI ble gjort mulig via Department of Defense Prostate Cancer Research program (W81XWH-07-1-0023; http:. //Cdmrp .army.mil), National Cancer Institute til Dan L. Duncan Cancer Center (P30CA125123, www.nih.gov) og ved bruk av fasilitetene på Michael E. DeBakey Department of Veterans Affairs Medical Center (www.houston .va.gov). Støtte for YC ble gjort mulig via Department of Defense Prostate Cancer Research program (W81 WH-07-01-0220, https://cdmrp.army.mil). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En rekke genetiske og epigenetiske forandringer er blitt beskrevet i prostatakreft. Tallrike studier har funnet konsistente mønstre av eksemplar nummer endringer som tap av 8p og 13q14 og gevinst på 8q24 i klinisk lokaliserte og avanserte prostatakreft [1], [2]. Epigenetiske endringer så som metylering er også vanlig i prostata kreft. I motsetning til de fleste studier til dags dato vises bare sjeldne klonale punktmutasjoner i klinisk lokalisert prostatakreft [2], [3]. I mer avanserte prostatakreft, klonale punktmutasjoner av tumorsuppressorgener slik som PTEN [4] og p53 [3] er mer vanlig, i motsetning til den lave frekvensen av mutasjon av disse genene i lokaliserte kreft [5], [6], men er fortsatt ikke vanlig forhold til de fleste kreftformer. Aktivering klonale mutasjoner i onkogener, slik som RAS, er ikke vanlig i prostata kreft i USA [3], i motsetning til de mer hyppig mutasjon ble observert i andre vanlige humane cancerformer så som kolon og lungekreft. Klonal androgen-reseptor-mutasjoner er vist i kastrering motstandsdyktig prostatakreft og ser ut til å bli valgt for som en mekanisme som prostata kreft celler kan overleve i miljøet lav androgen [3]. Således tilgjengelige data indikerer at klonale punktmutasjoner, særlig av onkogener, er sjeldne i klinisk lokalisert prostatakreft.
GGAP2 (også kjent som PIKE-A) er et G-protein som har en sterk GTPase-aktivitet, som forventet fra sitt RAS homologi domene. Den inneholder også en GAP-domene kan aktivere GTPase aktivitet enten via intra eller inter interaksjon. GGAP2 binder seg til aktivert AKT og sterkt forbedrer sin aktivitet, og dette samspillet er fremmet av GTP bindende [7]. Vi har vist at aktivert AKT kan binde og fosforylere GGAP2 ved serin 629, noe som forbedrer GTP-binding ved GGAP2 og AKT-aktivering [8]. Fosforylert GGAP2 kan også binde p50 subenheten av NFkB og forbedrer NFkB transkripsjonen aktivitet. Økt aktivering av fosfatidyl-inositol-3 kinase /AKT og NFkB trasé har begge blitt identifisert som kritiske stier i kreft initiering og progresjon i en rekke menneskelige maligniteter, inkludert prostatakreft. Vi har vist betydelig økt ekspresjon GGAP2 i de fleste humane prostatakreft [8]. Når GGAP2 er uttrykt i prostatakreftceller det forbedrer spredning, fokus dannelse in vitro og tumorprogresjon in vivo. Dermed økte GGAP2 uttrykk, som er til stede i tre fjerdedeler av menneskelige prostata kreft, kan aktivere to kritiske stier som har vært knyttet til prostata kreft initiering og progresjon, og kan øke tumorprogresjon in vivo.
Hu et al har identifisert mutante former av GGAP2 i sarkom, neuroblastom og glioblastom cellelinjer [9]. In vitro studier viser disse mutante former har forbedret GTPase aktivitet og sterkere aktivere AKT enn villtype GGAP2. I samsvar med disse observasjonene de GGAP2 mutantene fremme vekst av glioblastom celler og transformasjon av NIH3T3 celler [10]. Vi søkte derfor å identifisere mutasjoner av GGAP2 i menneskelige prostata kreft prøver. Vi har funnet høye frekvenser av missense mutasjoner GGAP2 i klinisk lokalisert human prostatakreft. Overraskende, mutasjonene er heterogene og nonclonal, med flere forskjellige mutasjoner er til stede i mange tumorer. Tilstedeværelsen av disse mutasjonene var forbundet med aggressiv klinisk oppførsel og øker AP-1 transkripsjonen aktivitet. Således er GGAP2 den hyppigst muterte onkogen i human prostata cancer hittil men mutasjonene er heterogene i stedet for klonal, noe som tyder på merket klonal heterogenitet i klinisk lokaliserte humane prostatakreft. Tilstedeværelsen av høyfrekvente nonclonal mutasjoner av et enkelt gen er romanen og representerer en ny modus for genetisk endring som kan fremme tumorprogresjon.
Resultater
Mutasjon analyse av GAP domenet GGAP2
for å finne ut om GGAP2 er mutert i prostatakreft vi i første omgang fokusert på GAP domene, siden denne regionen er en viktig negativ regulator av GGAP2 aktivitet. Vi analyserte cDNA fra 15 kreftformer og 9 godartet prostata vev fra radikal prostatektomi prøver. GAP-domene ble amplifisert og individuelle kloner ble isolert og sekvensert. Resultatene er vist i tabell 1. Tolv av femten krefttilfeller hadde minst en klon med et GGAP2 missense og /eller stoppe mutasjoner mens kun to av 9 godartede tilfellene hadde slike mutasjoner. De godartede tilfeller hadde bare en enkelt mutant klone hver mens opptil 42 prosent av kloner i krefttilfellene ble mutert. Totalt 38 av 206 kloner fra kreft vev var mutant versus 2 av 137 i godartet. Denne forskjellen var svært statistisk signifikant (p 0,001, chi square). For å utelukke en gjenstand på grunn av revers transkripsjon eller muligheten for at mutante vitnemål kan bli transkribert fortrinnsvis eller har økt stabilitet vi direkte analysert GAP domenet i genomisk DNA fra 46 kreft og 22 godartet vev. Som vist i tabell 1, 20 av 46 kreftvevet inneholdt minst en mutant klon, og i 12 av 46 kreft vev mer enn 30% av kloner inneholdt missense mutasjoner eller stoppe. Bare en enkelt mutant klon ble identifisert fra godartet vev. Totalt sett 52 av 334 kloner fra kreft vev var mutant versus 1 av 167 fra godartet vev (p 0,001, chi square). Kombinere cDNA og genomisk analyse, 32 av 61 krefttilfeller finnes kloner med GAP domene mutasjoner og i 14 tilfeller 30% eller mer av klonene var mutant.
Overraskende fant vi at missense mutasjoner var svært heterogen . Det var ingen tilbakevendende missense mutasjoner som involverer mer enn to svulster. I vev med flere muterte kloner var det bare to tilfeller med to identiske muterte kloner. Det var variasjon i fordelingen av missense mutasjoner med regionene mellom aminosyrene 640-660 og 700-710 som har relativt hyppigere mutasjoner mens mutasjoner var uvanlig fra aminosyrer 540-570, men det var ingen statistisk signifikante «hot spots». I flere kloner fant vi 2 mutasjoner i samme klon. Dette er i likhet med den observasjon av Hu et al [9], som syntes multiple mutasjoner i flere mutante GGAP2 cDNA isolert fra sarkom og glioblastoma cellelinjer. I tillegg til de multiple missense mutasjoner, observerte vi 3 stopp mutasjoner, alle ved den karboksyterminale delen av GAP-domenet (aa 703-709) som ligger mot karboksyenden av den GGAP2 proteinet og vil resultere i et avkortet protein. Av notatet, Hu et al [9] fant en avkorting på aminosyre 756 i GGAP2 cDNA fra CRL-2098 osteosarkom celler.
Med dette overraskende heterogenitet vi vurdert muligheten for at dette kan representere en PCR misincorporation gjenstand. Men vi fant bare tre tause mutasjoner blant 540 kloner fra kreft vev (versus 90 missense eller stopp) mens i godartet vev vi fant 2 tause mutasjoner blant 304 kloner (versus 3 missense mutasjoner). Andelen av missense og stoppe versus taus mutasjon var mye høyere i kreftvev enn i den godartede vev og forskjellen var statistisk signifikant (p = 0,02, Fisher eksakte test). Dette er uforenlig med en tilfeldig misincorporation. For ytterligere å belyse dette punkt, vi systematisk bestemt konsekvensene av overgangs mutasjoner på aminosyresekvensen for alle nukleotider i GAP-domenet. Vi bare undersøkt overganger siden 82% av de observerte mutasjonene var overgangs mutasjoner (data ikke vist). Systematisk overgang mutasjon av hvert nukleotid i GAP domene ville gi 273 missense, 15 stop mutasjoner og 162 tause mutasjoner. Forskjellen i andelene av missense og stoppe versus tause mutasjoner vi observerte (90 og 3) sammenlignet med den forutsagte fordeling (288 og 167) var meget statistisk signifikant (p 0,001, chi sq). Til slutt, vurderte vi muligheten for at kreftvev hadde en økning hastighet av mutasjonen rettet mot de første og andre baser i hvert kodon som fører til tilfeldig missense mutasjon i alle gener. Vi undersøkte derfor fem kreft og 5 godartet vev for mutasjoner i β-aktin. Vi fant ingen mutasjoner i 32 kloner fra kreftvev og 36 kloner fra godartede vev. Andelen av missense og stoppe kloner i GGAP2 var statistisk signifikant høyere enn i β-aktin (p = 0,02, chi sq). Dermed observerte heterogene mutasjoner i GAP domenet av GGAP2 er faktisk ekte.
Mutasjon analyse av GTPase domenet GGAP2
GTPase Domenet er også en viktig regulator av GGAP2 aktivitet. Vi undersøkte derfor cDNA fra 23 kreft og 12 godartede vev for GTPase domene mutasjoner. Resultatene var svært lik den som ble observert med GAP domene (tabell 2). Femten av 23 kreftformer som finnes missense mutasjoner versus en av 12 godartet vev. I fire krefttilfeller, 40% eller mer av kloner var mutant, mens bare en enkelt mutant klon ble observert i godartet vev. Totalt sett 28 av 188 kloner fra kreft vev ble mutert versus 1 av 88 i godartet vev (p 0,001, chi kvadrat). Den generelle mønsteret av mutasjoner i kreftvevet var lik den GAP domene ved at mutasjoner var svært uensartet, både innenfor en enkelt kreftvev og mellom kreft vev. Vi har funnet en dobbel mutant klon, i likhet med GAP-domenet. Av notatet, ble ingen stopp mutasjoner observert. Gitt den aminoterminale plasseringen av GTPase-domenet vil eventuelle stopp mutasjoner nesten helt sikkert utbytte inaktivt protein fordi det ville mangle PH domene. Vi fant bare to stille mutasjoner, en i en kreft og en fra godartet vev. I ni vev av 35 analyserte (26%) som detekteres vi flere kloner inneholdende en tidligere beskrevet stille polymorfisme (Rs17852479) ved L246 som ikke resulterer i en hvilken som helst aminosyre-endring. Denne polymorfisme forekommer i ca 28% av individene i tidligere studert populasjoner, i likhet med våre funn. Et sammendrag av mutasjonen analyse av GGAP2 er vist i Tabell 3.
GAP Domene Mutasjoner Øk AP-en transkripsjonen aktivitet
Vi har vist at NFkB kan øke uttrykket av FOS i prostatakreftceller og dermed AP-1 aktivitet [11]. For å teste om GGAP2 og mutant GGAP2 påvirket AP-en transkripsjon vi brukte seterettet mutagenese til ingeniør GGAP2 uttrykk konstruerer inneholder 9 forskjellige missense mutasjoner. Disse mutante konstruksjoner eller villtype eller tomme vektor kontroller ble co-transfektert med en AP-en reporter konstruere inn 293T celler og normalisert luciferase aktivitet målt. Som vist i figur 1, villtype GGAP2 gir en beskjeden økning AP-1 drevet transkripsjon. Flere mutante kloner viste markert forbedring av AP-1-promoteren transkripsjon i celler transfektert med mutanten sammenlignet med villtype GGAP2 (fig. 1).
Stjernene indikerer statistisk signifikant økning i forhold til villtype (WT) GGAP2 av ANOVA (p 0,05). Mean +/- SEM. Mutasjon og antall transfections vises.
Association of GAP domene mutasjoner med kliniske og patologiske parametre for aggressiv sykdom
For å avgjøre om tilstedeværelsen av missense eller stoppe mutasjoner i GAP domene var assosiert med aggressiv sykdom vi undersøkt i andelen av slike mutante kloner i prostata cancer med forskjellige kliniske og patologiske parametere forbundet med aggressiv sykdom (figur 2). Tidlig PSA tilbakefall etter radikal prostatektomi er assosiert med død av sykdom [12]. Kreft med tidlig PSA tilbakefall hadde 49 mutasjoner blant 172 kloner analysert, mens tilfeller uten tidlig PSA tilbakefall hadde bare 34 mutasjoner i 234 kloner. Denne forskjellen var statistisk signifikant (p 0,001, chi sq). I samsvar med dette, vi også funnet betydelig økt andelen av GAP mutasjoner i tilfeller med bekkenlymfeknutemetastase (p = 0,027, chi kvadrat), sædvæske invasjon (p = 0,027, chi kvadrat), extracapsular forlengelse (p = 0,015, chi kvadrat ) og høyere Gleason score (Gleason 5/6 Versus 7-10, p = 0,002, chi kvadrat). Disse funnene sterkt støtter ideen om at GAP domene mutasjoner i GGAP2 kan fremme prostata kreft progresjon.
brøkdel av kloner som inneholder missense eller stoppe mutasjoner for tilfeller med hver indikert kliniske eller patologiske parameter vises. Alle forskjeller mellom patologiske og kliniske variabler var statistisk signifikant. Spesifikt: for tidlig PSA tilbakefall ( 2 år etter kirurgi) versus ingen eller sent tilbakefall (p 0,001, chi kvadrat); extracapsular forlengelse (ECE) versus ingen ECE (p = 0,015, chi kvadrat); sædvæske invasjon (SVI) versus ingen SVI (p = 0,027, chi kvadrat); bekken- lymfeknutemetastase (LN) versus uten metastase (p = 0,027, chi sq); Gleason 5/6 versus 7-10 (p = 0,002, chi kvadrat).
Diskusjoner
Klonale mutasjoner i klinisk lokalisert prostatakreft er uvanlig og vanligvis innebærer tumorsuppressorgener (anmeldt i [3]). Mutasjoner i onkogener som RAS er uvanlig i amerikanske menn med prostatakreft, men RAS-mutasjoner har blitt identifisert oftere i prostata cancer fra japanske menn [3]. Vi har identifisert hyppige mutasjoner av GGAP2 i lokalisert prostatakreft. Totalt sett, halvparten av cancere inneholdt minst en mutant GAP domene klone og i 20% av kreft, 30% eller mer av kloner var mutant i GAP-domenet. Overraskende, mens det var 10 forskjellige tilbakevendende mutasjoner disse bare dukket opp 2-3 ganger hver, samlet GAP domene mutasjonene var heterogene og nonclonal. Lignende funn ble observert i analysen av GTPase domene. Flere linjer av bevis hevde at disse funnene ikke er en gjenstand inkludert: sjeldenhet av mutasjon i godartet prostata vev; dominans av missense mutasjoner i kreftvevet; det sparsommelige tause mutasjoner i kreftvevet og fravær av mutasjoner i β-aktin.
Mens både overekspresjon og nonclonal mutasjon av GGAP2 er vanlig i prostata kreft forholdet mellom disse to endringene er uklart. Begge kan potensielt aktivere siganaling aktiviteter GGAP2 i prostata kreft, selv om detaljerte studier vil være nødvendig for å avgjøre om disse aktivitetene er de samme for ulike spesifikke mutasjoner. I noen tilfeller kan overekspresjon kan potensielt forbedre de biologiske aktiviteter knyttet til mutasjon, selv om det er også mulig at mutasjon kan kompensere for manglende overekspresjon. Detaljerte studier av GGAP2 uttrykk, nonclonal mutasjon og markører for veien aktivering i et stort antall svulster vil være nødvendig for å forstå effekten av disse forskjellige endringer i prostatakreft.
intratumorale genetisk heterogenitet involverer punktmutasjoner av gener som p53 eller K-RAS i ulike regioner av enkelt makroskopiske tumorer har blitt bemerket i kreftformer som tykktarmskreft [13] og hjernesvulst [14]. Det skal bemerkes at i vår tilfeller alle tumorer representere en enkelt 6 mm svulst fokus og således våre kreft alle var fra en enkelt svulst fokus og er således heterogen vi observerte er forskjellig fra dette geografiske genetisk heterogenitet. I vårt tilfelle, gjenspeiler den observerte heterogenitet heterogenitet på cellenivå innenfor en enkelt svulst fokus.
Er mutasjonene vi observert betydelig? Den missense mutasjon frekvens observert i GAP domene i kreftvev var 370 × 10
-6 per bp sekvensert og for GTPase domene 298 × 10
-6 per bp. Bielas et al [15] har vist at hyppigheten av tilfeldig mutasjon i kreftvev er ca. 2,1 x 10
-6 per bp på tvers av flere cancertyper. Dermed vår observerte frekvensen for missense mutasjon i GGAP2 er 100 ganger høyere enn bakgrunnen frekvensen av mutasjonen, sterkt antyde selektiv vekst fordel for de muterte kloner. Vi har også funnet en signifikant sammenheng mellom frekvensen av mutasjon i GAP domene og kliniske og patologiske parametere forbundet med aggressiv sykdom, noe som indikerer at de er klinisk signifikant. Det skal bemerkes at i 20% av tilfellene undersøkte at mer enn 30% av kloner fra kreft var mutant i GAP-domenet. Gitt at vev som ble analysert var tilnærmet 80% kreft i gjennomsnitt, vil minst 75% av kreftceller inneholder et mutant allel (forutsatt at en mutasjon per celle) i slike tilfeller. Dette er et minimumstall, siden den ikke inneholder GTPase domene mutasjoner og potensielle mutasjoner i andre regioner av GGAP2, som har blitt rapportert [9]. Dermed observerte høyfrekvente heterogene mutasjoner kunne bidra direkte til lokal tumorvekst i mange tilfeller. I tillegg kan de mest potente mutasjoner fremmer metastase av spesifikke cellulære kloner. Det er bevis for å støtte konseptet at nonclonal p53 mutasjoner i primær prostatakreft kan gi opphav til metastatiske lesjoner [16]. Den høye frekvensen av ulike nonclonal mutasjoner i GGAP2 kan gi mange potensielle metastatiske kloner.
De fleste studier av mutasjoner i kreft har med rette fokusert på klonale mutasjoner siden det er lettere å se betydningen av slike mutasjoner. Heterogene nonclonal mutasjoner vil ikke bli oppdaget av mange analytiske metoder eller ikke er videre analysert siden det er uklart om de kan være PCR gjenstander eller bare passasjer mutasjoner. Våre funn tyder på at det i enkelte tilfeller høyfrekvente heterogene nonclonal mutasjoner kan oppstå og kan være av klinisk betydning. Det gjenstår å fastslå hvor ofte det er tilfelle med andre tumorsuppressorgener og onkogener. I noen tilfeller grupper har analysert primære prostatacancere for tilstedeværelsen av mutasjonen ved hjelp av enkeltkjedet conformation polymorfi analyser, etterfulgt av sekvensering av unormalt vandrende bånd og funnet forholdsvis høy andel av mutasjon i noen gener. For eksempel, ved bruk av denne tilnærmingen, mutasjoner i plexin-B1 ble påvist i 46% av primær prostatakreft [17], men det er vanskelig å bestemme nøyaktig prosentandelen av tumorceller i en tumor med denne mutasjon. Gitt at mutasjonene er hyppige nok til å gi et tydelig bånd på enkelt strandet konformasjon polymorfi analyser må de være ganske hyppig, men ikke klonal. Dette er i kontrast til våre funn i GGAP2 hvori mutasjoner er meget heterogen. Dermed variable nivåer av nonclonal mutasjoner, fra svært heterogen til oligoklonale kan eksistere i prostatakreft. På den annen side, ved hjelp av en metode som ligner på vår, Steinkamp et al [18] sekvensert androgen receptor mRNA fra kastrering motstandsdyktig prostatakreft metastasering. De fant høy grad av heterogenitet i mutasjonene med mange mutasjoner som er til stede i bare 5-10% av kloner. Dette funnet er i likhet med hva vi har observert i GGAP2. Androgen reseptor spiller en sentral rolle i patogenesen av prostatakreft og overlevelse, slik at det er sterkt selektivt trykk for å opprettholde mutasjoner som fører til aktivitet i møte med anti-androgen behandling. Vi har vist at GGAP2 ofte overuttrykt i prostata cancer, og kan aktivere to hovedveier prostatakreft progresjon dvs. NFkB og AKT veier. I tillegg har den en forholdsvis stor negativ regulatorisk domene som kan være utsatt for forstyrrelser, noe som kan gjøre det langt lettere å aktivere enn noen onkogener slik som RAS som krever spesifikke punktmutasjoner. Ytterligere analyser vil være nødvendig for å fastslå i hvilken grad andre gener, inkludert tumorsuppressorgener og andre onkogener, har høy frekvens ikke-klonal missense eller stoppe mutasjoner.
Potensialet for høy frekvens nonclonal mutasjon legger et lag av kompleksitet til den komplekse mutasjons landskapet av vanlige kreftformer som har blitt avslørt av storskala sekvensering [19], [20], [21]. Av notatet, har det blitt vist at nonclonal mutasjoner i K-RAS i lungekreft behandles med tyrosinkinasehemmere betydelig innvirkning overlevelse [22]. Dermed vil det være viktig å finne ut i hvilken grad nonclonal mutasjoner oppstår på tvers av et bredt spekter av gener i prostata og andre kreftformer, og om de påvirker overlevelse og respons på behandling.
Materialer og metoder
menneske~~POS=TRUNC vevsprøver
Normal randsone og kreft vev ble samlet inn med skriftlig informert samtykke fra menn som gjennomgår radikal prostatektomi ved Baylor College of Medicine Prostate Cancer Program Tissue Bank og hurtigfrosset som beskrevet tidligere [23]. Pasientene var i alderen 43-73 år og var hovedsakelig kaukasiske. I alle tilfeller preoperativ bildebehandling og klinisk undersøkelse viste klinisk lokalisert sykdom. Patologisk iscenesettelse av radikal prostatektomi prøver og bekken lymfeknuter viste ca 30% Stage 2 (T2N0); 50% Stage 3 (T3N0) og 20% Stage 4 (Alle T, N1). Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke til å donere vev for forskning og disse studiene ble godkjent av Baylor College of Medicine Institutional Review Board. Godartede vev ble bekreftet å være fri for kreft og kreftvevet inneholdt minst 70% karsinom. RNA og DNA ble ekstrahert som tidligere beskrevet [24], [25]. PSA residiv ble definert som serum PSA . 0,2 ng /ml, med tidlig tilbakefall være tilbakefall innen 2 år etter kirurgi
Mutasjon analyse
N-terminal GTPase domene og C-terminal GAP domene av GGAP2-genet ble amplifisert ved hjelp av PCR og klonet inn i PCR-2,1 TOPO vektor ved hjelp av TOPO TA-kloningssett (Invitrogen). PCR ble utført ved anvendelse av platina Taq (Invitrogen) for å minimalisere misincorporation. Primere som brukes for kloning var: for GTPase domene Forward: CCGCTCCATTCCTGAACTG; Omvendt: GTTGCTGCTTGCGCAAG for GAP domene: Spiss: CACAGACAGCCAAAGCGA; Omvendt: CCAAAAGCAGGAGAACGGTAG. DNA ble sekvensert i begge retninger og alle basepar forandringer kalles av maskinen lese av sekvensen ble bekreftet ved visuell undersøkelse av sekvenserings traser. Kloner med dårlig kvalitet sekvense spor ble ikke analysert. Ingen nye rapporterings bakterie linje varianter ble oppdaget.
Side mutagenese
Enkelt nucleotide mutagenese ble utført i henhold til produsentens protokoll (Stratagene). Kort sagt ble primere med målet mutasjoner anvendt i PCR for å generere GGAP2 ekspresjonskonstruksjoner som inneholder 9 forskjellige missense mutasjoner. Anvendte primerene er vist i tabell 4. Dpn1enzyme ble tilsatt til PCR-produkter i 1 time ved 37 ° C for å fordøye templat plasmid-DNA før transformasjonen. Kloner ble sekvensert for å bekrefte mutasjoner.
luciferase transkripsjonen reporter analyser
luciferase transkripsjons reporter ble utført som beskrevet tidligere [11] ved hjelp av 293T celler. Både AP-1 luciferase reporter vektor og PRL Renilla Luciferase vektor ble oppnådd fra Stratagene (Cat # 219077 og # E2810). PRL Renilla luciferaserapportørplasmid vektorer er beregnet for bruk som en intern kontroll journalister i kombinasjon med AP-en til cotransfect 293T celler. Forbigående transfeksjon ble utført i triplikat i 24-brønners plater. Luciferase-aktiviteten ble bestemt og normalisert til Renilla luciferase signal for hver prøve. Uavhengige analyser ble utført fra 3-9 ganger.
Statistisk analyse
For å sammenligne priser av mutasjon mellom grupper chi kvadrat eller Fisher presis analyse ble utført. Luciferaseaktiviteten av mutante kloner ble sammenlignet ved bruk av variansanalyse (ANOVA). For alle tester p 0,05 ble betraktet som signifikant
Takk
Hjelp av Patricia Castro er takknemlig erkjent
..
