Abstract
Et stort problem i kreftforskning er mangelen på en medgjørlig modell for forsinket metastaser. Heri vi viser at kreftceller trykt av SISgel, en gel-dannende normal ECM materiale fra tynntarmen submucosa (SIS), i flanketransplantater viser egenskapene til undertrykkelse og re-aktivering som er svært lik normal forsinket metastaser og foreslå disse undertrykte celler kan tjene som en ny modell for å utvikle terapeutiske midler for å målrette mot mikrometastaser eller undertrykkes kreftceller. Co-injeksjon med SISgel undertrykte ondartet fenotype av svært invasive J82 blærekreftceller og høyt metastatiske JB-V blære kreft celler i nakne mus flanketransplantater. Celler kunne forbli levedyktig opp til 120 dager uten å danne svulster og dukket opp mye mer høyt differensiert og mindre atypisk enn svulster fra celler co-injisert med Matrigel. I 40% av SISgel xenografter, vekst gjenopptatt i den ondartede fenotype etter en periode med undertrykkelse eller dvalen i minst 30 dager, og var mer sannsynlig med implantering av 3 millioner eller flere celler. Vanlig type I kollagen ikke undertrykke ondartet vekst, og tumorer utviklet seg om så vel med kollagen som med Matrigel. Et klart signal i genuttrykk over ulike cellelinjer ble ikke sett av transkriptomet microarray analyse, men i motsetning Reverse Phase Protein Analyse av 250 proteiner over 4 cellelinjer identifisert Inte Linked kinase (ILK) signaliserer at ble funksjonelt bekreftet av en ILK inhibitor. Vi foreslår at kreftcellene undertrykte på SISgel kan tjene som en modell for dvalen og re-oppvåkning for å tillate identifisering av terapeutiske mål for behandling av mikrometastaser
Citation. Hurst RE, Hauser PJ, Kyker KD, Heinlen JE , Hodde JP, Hiles MC et al. (2013) Suppression og aktivering av malignt Phenotype av ekstracellulær matriks i xenograft modeller av blærekreft: En modell for Tumor Cell «Dormancy». PLoS ONE 8 (5): e64181. doi: 10,1371 /journal.pone.0064181
Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA
mottatt: 23 april 2012; Akseptert: 12. april 2013, Publisert: May 24, 2013
Copyright: © 2013 Hurst et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av forskningsmidler R01CA75322, R01DK69808, et stipend fra Cook Biotech og et stipend fra Stephenson Cancer Center (REH); R01 CA136944 og R43 CA135867 (MAI) og R43CA139804 (PJH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Robert Hurst, Paul Hauser, Kim Kyker og Michael Ihnat er alle aksjonærer i DormaTarg, Inc. Michael Hiles og Jason Hodde er ansatt av Cook Biotech. Ingen av de andre forfatterne har konkurrerende interesser. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Uttrykk for den ondartede fenotype er verken en umiddelbar eller selv uunngåelig konsekvens av mutasjon av tumorsuppressorgener eller onkogener. Det har lenge vært kjent at uten ombygging den ekstracellulære matriks (ECM), kreftceller er i stand til å danne svulster [1], [2], og at den ECM seg selv inneholder elementer både antagonistiske og agonistiske av den ondartede fenotypen [1]. Betydningen av ECM har nylig blitt tydeligere som fenomenet uvirksom av metastatiske celler har blitt anerkjent [3] – [5], og at det første engasjerte trinn i metastaser er utslipp av mikrometa celler fra lokale inhibitoriske faktorer som har en tendens til å favorisere fortsatte dvalen [6], [7]. Dessuten er det funnet at cellene med abnormale genomer uttrykker tumorassosierte antigener i histopathologically normal urothelium [8] eller celler med p53-mutasjoner som er karakteristiske for primærtumor funnet i histopathologically normal munnslimhinnen [9] viser at kreftceller kan utgir seg for normale celler . Undertrykkelse av de ondartede egenskaper av celler med potensiale for tumordannelse godt kan ligge til grunn for tidsforsinkelsesperioden for primær tumorvekst, så vel som for lokal forsinket og distal tilbakefall. Kanskje «dvalen» kan bidra til grunn at selv med nyere «målrettede» behandlingsmetoder og milliarder av dollar i kreftforskning, har samlet kreftspesifikk overlevelse endret seg lite [10], [11]. Sovende celler har ikke engang blitt anerkjent som et potensielt mål inntil nylig [12], og helt klart slike celler er resistente mot konvensjonell kjemoterapi på grunn av svært begrenset effekt av adjuvant kjemoterapi [3], [13]. Det som trengs er et modellsystem som brukes til å undersøke mekanismene for undertrykkelse og aktivering av kreftceller ved ECM som også kan brukes til å identifisere og test-legemidler som er rettet mot ECM-trykkes kreftceller.
Vi har tidligere demonstrert at fenotypen til blærecancerceller ble radikalt forskjellig i tre-dimensjonal organotypiske kulturen når de dyrkes på en normal ekstracellulær matriks preparat (SISgel) sammenlignet med det som ble observert på en kreft-modulert permissive ekstracellulære matriks preparat (Matrigel) [14]. SISgel er et gel-dannende materiale avledet fra acellulær porcin tynntarmen submucosa, mens Matrigel er en basalmembran preparat oppnådd fra en mus sarkom [15]. Når dyrket på Matrigel blæren kreftceller rekapitulert fenotype rapportert for den opprinnelige svulsten. I skarp kontrast, ble de fleste ondartede egenskaper tapt når cellene ble dyrket på SISgel [14]. Cellelinjer avledet fra dyrket papillomer på SISgel dannes en lagdelt struktur som minner om normal urothelium, mens cellelinjer avledet fra høyere grad tumorer dannet en ikke-invasiv lag av celler [14]. Disse funnene antydet at veksten av kreftceller på normal ECM kunne gi en modell for å undersøke fenomenet undertrykkelse av malignitet ved normal ECM og dens rolle i metastase og tilbakefall.
I denne kommunikasjonen vi undersøkt om den fenotypiske undertrykkelse sett i organotypic kultur av blærekreft celler på SISgel er også observert
in vivo
. Positive funn støtter bruk av SISgel som en modell for undersøkelser av den sovende eller undertrykket tumorcelle fenotype og av mekanismer som normal ECM utøver en hemmende innflytelse på tumorgenese og metastasering. Funnene antyder sterkt at interaksjoner av kreftceller med normal ECM spiller en viktig rolle i tilbakefall og metastasering og videre foreslå at målretting undertrykte celler kunne representere en hittil uutnyttet poeng av sårbarhet i kreftbehandling.
Resultater
fenotypen av en av de aggressive blærekreftcellelinjer dyrket på SISgel, kollagen og Matrigel i kultur er vist i fig. 1. En invasiv, aggressiv fenotype på Matrigel og kollagen er observert. På Matrigel, cellene invaderte, men som en front, som er observert i kliniske tumorer. På kollagen, individuelle celler invaderte, mens noen celler forble på overflaten av gelen, og de som invaderte hadde en mesenchymale utseende. Cellene dyrket på Matrigel viste også en rekke størrelser og atom orienteringer som tyder på en aggressiv fenotype. Denne fenotype kontrast bart med det som ble observert på SISgel, hvor cellene ikke klarte å invadere og dannet et lag på toppen av gelen. Cellene viser en epitelial fenotype, og kjernene var mer ensartet og organisert som indikerer en normalisert fenotype.
Legg merke til tap av invasjon og av de mer ryddig utseende av cellene dyrket på SISgel. Alle forstørrelser er 200X. Bildene er representative for minimum 4 eksperimenter.
Vi neste fastslått om undertrykkelse av maligne egenskaper sett i tre-dimensjonale kultur ble også observert
in vivo
i flanke xenografter. Typiske resultater ved hjelp av J82-celler er vist i fig. 2. En fluorescens bilde av celler bare etter injeksjon, er vist i fig. 2A. Utseendet til en svulst som vokste fra celler ko-injisert med Matrigel er vist på fig. 2B. Fig. 2C viser det typiske resultat med celler ko-injisert med SISgel. Cellene blir stående som en flat spot som lyser svakt etter spennende belysning, men som regel ikke danner en voksende svulst og er fortsatt synlig i flere uker. I noen fraksjon av disse SISgel xenotransplantater imidlertid cellene flykte fra undertrykkelse og begynne å vokse som en aktiv tumor, som er illustrert i fig. 2D. Som vist nedenfor, fraksjonen som unnslipper til å gjenoppta aktiv vekst er avhengig av antallet av celler injisert.
(A) celler observert 24 timer etter implantasjon. (B) celler ko-injisert med Matrigel observert etter 60 dager viser aktivt voksende tumor. (C) celler ko-injisert med SISgel observert etter 50 døgn som viser cellene forblir levedyktige, men er ikke vokser inn i en tumor ( «lysende flekk»). (D) celler samtidig injisert med SISgel at rømt etter innledende undertrykkelse vist 60 dager etter injeksjon. Cellene forble som en glødende spot (se C) i 45 dager, deretter gjenopptatt rask vekst som en svulst. Veksten ble definert som to påfølgende økning i størrelse.
De svulster som dannes fra celler co-injisert med Matrigel, kollagen I eller som rømte fra celler co-injisert med SISgel ble undersøkt histopathologically sammen med en av flekker av undertrykte fluorescerende celler som ikke klarte å utvikle seg til en voksende svulst. Disse resultatene, som er presentert i figur 3, bekrefter at cellene blir undertrykt av SISgel. Fig. 3A viser en typisk seksjon fra JB-V celler som vokste inn i en svulst etter samtidig injeksjon med Matrigel. Utseendet er at av en aggressiv svulst med mange apoptotiske legemer og mitotiske tall. Cellene er markert pleiomorphic og svært anaplastic, områder av koagulative nekrose er til stede, og de fleste fartøyene vises unormal. Den histopatologi av en av de undertrykte flekker av celler som samtidig injisert med SISgel vist grovt i fig. 2C er vist i fig. 3B. I motsetning til de aktivt voksende tumorer, cellene er mer differensiert, mindre anaplastisk eller pleiomorphic med normalt utseende fartøy, svært få mitotiske figurer, og mimal bevis på apoptotiske eller nekrotiske områder. Fig. 3C viser et snitt av en av de svulster som vokste fra SISgel etter en periode uvirksom på 8 uker. Svulsten er histopathologically likhet med fig. 3A og bekrefter at når svulster flykte fra undertrykkelse, de fortsette i en aggressiv fenotype. Fig. 3D viser at celler ko-injisert med kollagen også danne en aggressiv-vises tumor med egenskaper som ligner på figurene 3A og 3B. Trichrome farging for kollagen i alle vev viste at etter den tid disse tumorer eller lapper av undertrykte celler ble høstet, hadde den opprinnelige kollagen i ko-injeksjon medium forsvunnet (ikke vist). Den eneste merkbare kollagen i fig. 3B var skipene. Fig. 4 kontraster ekspresjon av spredning markør, Ki67 og mesenchymale markør, vimentin i flanke xenografter og bekrefter histopatologisk vurderingspresentert i fig. 3. Som det er vist at svært få celler i undertrykkes cellevev er i cellesyklusen, og det er svært lite vimentin uttrykk. I motsetning til dette ble de aktivt voksende tumorer, karakterisert ved et høyt nivå av ekspresjon av begge deler, noe som indikerer et aggressivt voksende fenotype. Svulster fra J82 celler var veldig lik de presenterte for JB-V celler i alle henseender.
Har identifisert histopathologically er vist som følger. Områder i ondartede celler er skissert i svart, og områder med koagulative nekrose er skissert i gult. Svarte piler illustrerer apoptotiske legemer. Gule piler identifisere mitotiske tall. På zoomnivået vises her disse er vanskelig å skille, men ble identifisert under høyt makt. (A) Cells co-injisert med Matrigel som umiddelbart presentert en ondartet vekstmønster. Den patologisk beskrivelse bemerket store deler av koagulative nekrose med akutt betennelse (de små, tette celler er nøytrofile) med et areal på svært atypiske celler avslørende merket atom pleomorphism, alle tegn på høy klasse neoplasi. (B) Celler co-injisert med SISgel som forble i undertrykt eller sovende fenotype. Dette lysbildet ble lest som celler med moderat cellulær atypi og pleomorphism med minimal bevis på koagulative nekrose, mitose og apoptose. (C) celler som samtidig injisert med SISgel som først presentert en undertrykt fenotype i 8 uker, men deretter gjenopptatt vekst i den maligne fenotype. Dette ble lest som inneholder et område på koagulative nekrose med akutt betennelse og områder med markert atypiske celler sammen med fremtredende mitose og apoptose. Noen felt inneholdt multinucleated tumor kjempeceller vanligvis indikerer høy grad av neoplasi (D) Celler co-injisert med Collagen jeg demonstrere en ondartet vekst mønster som ligner på dem som er vist i paneler A og C. Alle bilder er på 400X.
JB-V-celler ko-injisert med Matrigel og merket for Ki67 (A) og vimentin (C). JB-V-celler ko-injisert med SISgel og i den undertrykte fenotypen merket for Ki67 (B) og vimentin (D). Styrer utelate det primære antistoff (ikke vist) var helt negativ for begge merkene. Bilder på 200X.
Kaplan-Meier plott av dataene er vist i fig. 5A med et endepunkt på begynnelsen tumorvekst; det er i dette tilfelle «overleve» regnes som overlevelse av en undertrykt fenotype. Fordi alle eksperimentene inneholdt Matrigel positive kontroller med de samme celletall i de samme mengdeforhold som ble anvendt for SISgel, fig. 5A kombinerer forsøkene med ulike celletall. Når ko-injisert med Matrigel, celler utviklet seg til tumorer i løpet av 30 dager i 100% av dyrene, selv med så få som 250 000 celler. Med SISgel, dette var helt klart ikke tilfelle, og bare ca 40% av dyrene etter hvert utviklet voksende svulster etter en forsinkelse på mellom fire og så lenge som 18 uker. Forskjellen i oppførsel mellom celler som samtidig injisert med Matrigel og SISgel var meget statistisk signifikant (p 0,0001). Totalt 70 xenotransplantater ble fremstilt fra SISgel. Av de 60% av dyrene der ingen svulst utviklet mange av de implanterte cellene forble som et grønt fluorescerende flekk, men i enkelte tilfeller stedet ikke lenger var merkbar etter flere uker. I to xenografter hvor de implanterte cellene hadde tydeligvis forsvunnet, svulster dukket opp igjen i ett dyr på 12 uker etter den første injeksjonen, mens i et annet dyr en voksende svulst var tydelig forming av 15-16 uker. Selv om i det minste 95% av cellene ble fluorescerende når stilles i to tilfeller, re-emergent tumorer mislyktes i å uttrykke GFP som vist ved grov undersøkelse, og i en annen, viste brutto undersøkelse en mosaikk av fluorescerende og ikke-fluorescerende celler. Gjenveksten av den ondartede fenotype er avhengig celle nummer, med flere svulster mer sannsynlig å oppstå når mer enn 3 millioner celler blir injisert enn når færre enn 3 millioner celler ble injisert (p 0,0001) (figur 5B.). Det var ingen merkbar forskjell i virkemåten til JB-V og J82-celler (p-verdier på overlevelseskurver ble alle er større enn 0,2), selv om de JB-V celler var blitt valgt til å være svært metastatisk og å vokse fortrinnsvis i blæren [ ,,,0],16].
(A) SISgel vs Matrigel. (B) Tre eller flere millioner celler implantert vs. færre enn tre millioner celler.
Vi testet også om gel co-injisert med kreftceller var dominant over kreftcellen fenotype oppnådd i kultur. Tabell 1 oppsummerer veksten av tumorer i henhold til ECM som de ble dyrket i kultur, så vel som hvilke ECM var ko-injisert inn i flanken med tumorcellene etter vekst på ECM i kultur. ECM ko-injisert inn i dyr med blæretumorceller reguleres enten tumorer dannet, og fenotypen etablert av ECM hvorpå cellene ble dyrket ble overvunnet ved den ko-injisert ECM. Som forventet, celler som var ko-injisert med Matrigel jevnt dannet voksende tumorer, uavhengig av hvor de var blitt dyrket i kultur. Co-injeksjon med SISgel trykt blære kreft celler som hadde vært aktivt voksende og fullt uttrykke maligne fenotype på Matrigel
in vitro.
Interessant celler dyrket på Matrigel og co-injisert med kulturmedium alene var ikke i stand til tumor dannelse, noe som ytterligere støtter at den lokale matrisen er viktigere enn fenotypen av cellene på det tidspunkt de ble injisert. Ingen forskjell i størrelse, veksthastighet eller grovt utseende var detekterbar mellom tumorer dannet fra celler som var blitt dyrket i suppressiv fenotype på SISgel men var ko-injisert med Matrigel sammenlignet med celler som hadde blitt dyrket på Matrigel eller plast, og ble co- injisert med Matrigel.
på grunn av at hovedkomponenten i SISgel er kollagen i [17], vi også ko-injisert J82-celler som var blitt dyrket på plast med kollagen I. i motsetning til SISgel, kollagen svulster vokste raskt; og i åtte av 12 dyr i tre forskjellige eksperimenter svulster vokste innenfor tidsrammen etablert for Matrigel. I disse samme eksperimentene ingen av 12 dyr co-injisert med SISgel utviklet svulster. Forskjellen mellom cellene ko-injisert med kollagen og SISgel var svært signifikant (p = 0,0013), men forskjellen mellom cellene ko-injisert med kollagen og Matrigel var ikke (p 0,05).
Vi har også undersøkt mekanismen for undertrykkelse ved å sammenligne genekspresjon og proteinekspresjon profiler av celler dyrket på SISgel med de samme celler dyrket på Matrigel. Microarray studiene var i hovedsak uninformative, noe som tyder på at fenomenet undertrykkelse ikke er regulert på genuttrykk nivå. Selv om 243 gener ble uttrykt forskjellig mellom J82 celler dyrket på SISgel vs. Matrigel og 214 ble uttrykt forskjellig fra JBV celler dyrket under de samme betingelsene, var det svært lite overlapping. Bare 11 gener som var felles for de to lister, og ingen ble gående uttrykt forskjellig på tvers av matriser i den samme retning av begge cellelinjer. Undersøkelse av ontologier av genet settene viste at sett av gener differensielt uttrykt av de to cellelinjene dyrket på Matrigel eller SISgel var forskjellige ontologier. Vi konkluderer med at mangelen på en konsistent genekspresjon signatur mellom ulike cellelinjer dyrket på annen matrise fremstillingen viser at de åpenbare fenotypiske forskjeller må resultere fra differensial ekspresjon på proteinnivået i stedet for på genekspresjon nivå av regulering.
Reverse Phase protein Array (RPPA) protein analyse for 250 viktige signalproteiner gjorde identifisere (fig. 6A) en konsekvent signatur på tvers av alle 4 cellelinjer. Pathway analyse ved hjelp av IPA genet navn viste følgende var sterkt signifikant involvert. PI3K /AKT Signa (p = 1,00 × 10
-8, mTOR, GSK3A, GSK3B, TNNB1, EIF4E), insulinreseptoren signale (p = 1,70 × 10
-8 BRAF, RB1, mTOR, GSK3B, CTNNB1 ) og ILK signale (p = 9,12 × 10
-8 mTOR, IRS1, GSK3A, GSK3B, CTNNB1). Den funksjonelle rollen til ILK ble bekreftet ved bruk av et lite molekyl inhibitor av ILK, som viste at inhibering av ILK i J82-celler dyrket på Matrigel produsert en ikke-invasiv fenotypen meget lik den som er observert når cellene ble dyrket på SISgel som vist i fig. 7. Den typiske invasive svulster-lignende fenotype er vist på fig. 7A med J82 celler dyrket på Matrigel. I motsetning til dette er det invasive fenotype avskaffet ved 10 uM QLT0267 tilsettes til kulturmediet for cellene dyrket på Matrigel (fig. 7B). Fenotypen er lik den som sees når cellene dyrkes på SISgel (fig. 1), bortsett fra at flere lag er dannet.
Symbolet (V) angir antistoff ble validert for å vise et enkelt bånd ved Western blot. A «p» indikerer at antistoffet er rettet mot et fosforylert form av proteinet, med aminosyre posisjon og identitet tilgjengelig. De to mTOR oppføringer representerer duplikater. En fullstendig liste over de antistoffer som brukes på den tiden av analysen er gitt som Tabell S1.
J82 celler dyrket på Matrigel i fem dager uten ILK inhibitor (topp) eller med 10 mm QLT0267 ILK inhibitor (nederst panel). Merk undertrykkelse av invasjonen. Alle forstørrelser er 200X. Bildene er representative for 3 forsøk.
Diskusjoner
Når en kreftcelle får den nødvendige slik at kreftfremkallende mutasjoner eller metastatisk celle rømming fra sirkulasjon er det likevel i et normalt miljø som ikke er givende av tumorvekst på grunn av gjentatte, omfattende kontroller som funksjon å skille og hemme replikasjon av epitelceller [1], [2], [7]. Escape fra disse normale kontroller representerer sannsynligvis det første, forpliktet steg i dannelsen av primære, lokalt tilbakevendende, og metastatiske svulster. Vi foreslår at kulturmodell presenteres tidligere [14] og xenograft modell presenteres her representerer en ny modell for å undersøke de viktige fenomener av undertrykkelse av malignitet og dvalen, og for å identifisere nye behandlingsformer for å angripe metastase og tilbakefall på sitt mest sårbare punkt.
Denne modellen fanger opp flere viktige elementer av undertrykkelse og reaktivering som er observert klinisk. Den ondartet fenotype av blærekreftcellelinjer er undertrykt av SISgel
in vitro
, og
in vivo
når implantert med SISgel i flanke xenografter. Ikke bare gjør cellene ko-injisert med SISgel mislykkes i å vokse umiddelbart som tumorer (fig. 2), men de er i det vesentlige histopathologically normalisert over aktivt voksende fenotypen (Fig. 3B vs fig. 3A, C og D). Videre har de fleste celler er ikke i cellesyklusen og ekspresjon av vimentin er sterkt redusert i løpet av det som ses i aktivt voksende tumorer (fig. 4). Dette er ikke bare en generell vekst-undertrykkende effekt av SISgel fordi tidligere studier viste at kreftceller seeded på SISgel har omtrent samme hastighet på spredning som på Matrigel, og bare når de begynner å nå samløpet gjør frekvensen av spredning langsom drastisk [13 ]. Celler co-injisert med SISgel kan forbli undertrykt i flere uker eller måneder, lenge etter at SISgel absorberes, bare for å fremstå som voksende svulster, som skjedde med om lag 40% av implantater med SISgel. I de resterende 60%, cellene enten forble levedyktig som en grønn fluorescerende flekk eller forsvunnet helt. Tre observasjoner tyder på at gjenveksten av en tumor er på grunn av en liten populasjon av celler i stedet for til hovedpopulasjon. For det første gjenveksten var positivt korrelert med antall celler implantert (Fig. 5B). For det andre, i to tilfeller GFP-merket humane kreftceller tilsynelatende forsvunnet, men på et senere tidspunkt etter den første injeksjonen stedet dukket opp igjen og vokste til en svulst. Til slutt, to re-emergent svulster ikke klarte å uttrykke GFP, og en var en mosaikk av GFP-uttrykke og ikke-uttrykkende celler. Fordi minst 90-95% av de injiserte cellene uttrykte GPF, de findins foreslår re-emergent tumorer avledet klonalt eller fra et meget lite antall celler som enten opplevd delesjon av GFP-genet fra sin innføringsstilling i genomet eller aldri anskaffet en i utgangspunktet. I motsetning til dette øyeblikkelig, hurtig tumorvekst i Matrigel antyder overlevelse og vekst av bulk-celler under disse permissive betingelser og er iboende i en betydelig andel av de injiserte cellene.
Selv om andre mekanismer kan være involvert i å produsere uvirksom eller undertrykkelse [4], [5], [18] – [21], vises de engasjerte trinn som skal unnslippe fra det undertrykkende normal ECM [7], [22]. Funnene bekrefter vår tidligere hypotese om at ECM utøver en undertrykkende effekt
in vivo
basert på tap av maligne egenskaper på SISgel
in vitro product: [23]. Den undertrykkende effekt av SISgel er ikke på grunn av den dominerende protein, kollagen jeg, eller fravær av noen faktor i SISgel nødvendig for ondartet voksen fordi svulster dannet med co-injisert kollagen Jeg vokste nesten like godt som de vokste ved samtidig injisert med Matrigel . Undertrykkelse av SISgel ser ut til å være aktive, ikke passive, ved at noen faktor i normal ekstracellulære matrise aktivt undertrykker ondartet fenotype, som ble foreslått mer enn 15 år siden av Renato Iozzo [1]. Tidligere forskning i våre laboratorier antydet at, i motsetning til melke epitelceller, ble α6β4 inte ikke involvert [24]. Microarray og proteomic studier innblandet komplekse nettverk som involverer TGFp, cMYC og en serie av transkripsjonsfaktorer [23], [25], [26]. Fordi en konsekvent gen signatur ikke kan identifiseres, er det sannsynlig at et protein bryter regulerer konvertering mellom de ondartede og undertrykte fenotyper. De RPPA Resultatene tyder på at ILK signalering er involvert, som er støttet av det funn at inhibering ILK selv hindrer invasjon. Videre forskning vil være nødvendig for å identifisere reseptoren og detaljerte signaleringsmekanismer.
Selv om fenomenet undertrykkelse av malignitet er mest åpenbart knyttet til metastaser, fenotypisk undertrykte kreftceller trolig også spille en viktig rolle i lokal tilbakefall. Selv om noen 80-85% av blærekreft er i utgangspunktet ikke muskel invasiv, den lokale tilbakefall, opptil 70% i enkelte studier [27], med noen 15-25% går videre til dødelig muskel invasiv sykdom [27] gir en større klinisk problem. Tilbakefall i arr der marginene var tumor-free er mest sannsynlig ikke skyldes manglende oppdage frank tumorceller i den opprinnelige histopatologiske undersøkelser, men er resultatet av markedsføringen av undertrykte celler ved arret mikro [28]. Videre, finne celler med avvikende DNA innhold og biomarkør uttrykk i morfologisk normal urothelium [8] for pasienter med blærekreft sterkt støtter hypotesen om at ECM-modulert undertrykkelse av ondartede fenotype skjer
in vivo
. Identifisere og målretting slike celler kan gi et stort fremskritt i behandlingen av blærekreft. Lignende funn i hode og nakke plateepitelkarsinom foreslår problemet kan være mer allmenn [9].
Selv om undertrykkelse av malignitet ved normal ECM sannsynlig opererer generelt og er av betydning for patobiologi av menneskelig blærekreft, forståelse undertrykkelse mekanismen kan identifisere nye mål for kontroll av ikke bare blærekreft men andre krefttyper med forsinket mikrometastaser eller lokalt residiv. Både
in vitro Hotell og
in vivo
modeller som presenteres her skal vise seg nyttig i å identifisere disse mekanismene og i å gi medgjørlig modeller for identifisering av nye legemidler for å målrette kreftceller undertrykt av den normale ekstracellulære matrise. Forebygging forsinket metastase kan redde tusenvis av liv hvert år.
Materialer og metoder
Fluorescent Protein Uttrykke blærekreft Cells
JB-V cellelinjen ble avledet fra J253 TCC linje (ATCC, Manassas, VA) ved C. Dinney [16] for å være svært metastatisk. Den J82 linjen er en aggressiv TCC linje hentet fra ATCC. Cellene ble transfektert med pLEGFP-C1 retrovirus (Clontech, Mountain View, CA) utarbeidet av co-transfeksjon av emballasjen cellelinje GP2-293 (Clontech, Mountain View, California) med pVSV-G vektor (Clontech, Mountain View, CA ) inneholdende en virale kappe-genet. Supernatant fra pakkingscellene som inneholder infeksiøs virus ble oppsamlet hver 24. time i 4 dager. Fluoriserende målceller ble gjort ved å infisere JB-V og J82 urothelial overgangscelle karsinom-cellelinjer med 1 ml frisk, virusholdige supernatant /brønn inneholdende 100.000 målceller sammen med 8 ug /ml polybrene (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Hver påføring av viral supernatant ble filtrert gjennom en 0,4 um sprøytefilter før påføring til målceller. Supernatanten ble fjernet og friskt virusholdig medium etterfylles på målceller hver 24. time inntil 4 forandringer av medier var fullført. Virusinneholdende medium ble erstattet med Minimum Essential Medium, MEM, (Life Technologies, Carlsbad, CA) inneholdende 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% L-glutamin, 1% natriumpyruvat og 10% føtalt kalveserum, og cellene ble tillatt å vokse til 90% samløpet. Stabile transfects ble valgt ut gjennom sekvensiell sortering og berikelse av fluorescerende celler ved hjelp av flowcytometri.
vekst av celler på ECM
Gel matriser ble gjort ved å legge enten 0,8 ml iskald Matrigel (Becton-Dickinson , Bedford, MA), SISgel, eller type i kollagen (BD Biosciences, San Jose, CA) på polyetylentereftalat membraner av seks-brønns cellekulturinnsatser (Falcon, Becton Dickinson Laboratorium, Franklin Lakes, NJ), som deretter ble tillatt til gel ved 37 ° C. SISgel ble stilles enten ved oppløste tynntarmen submucosa gitt til oss av Cook Biotech (West Lafayette, IN) eller ved materialet vi forberedt oss fra decellularized tynntarmen submucosa ved hjelp av etablerte teknikker [29]. I korthet, første SIS ble delvis spaltet med pepsin ved pH 2,8 ved 4 ° C i 12 dager. Dette representerer en optimalisering; for lite fordøyelse og materialet danner klumper i stedet for geldannelse, og overdreven fordøyelse produserer materiale som ikke vil gel. Pepsin ble inaktivert ved å heve pH til 10 og inkubering av gelen ved 4 ° C i 2 timer, etterfulgt av å senke pH-verdien til 4 med 6 N HCl. Produktet ble dialysert mot 10 mM HCl og steriliseres med CHCI
3, som deretter ble dialysert ut mot 10 mM HCl. For å danne en gel, ble materialet blandet med 1/10
th volum av 10X fosfatbufret saltløsning og en liten mengde av fenolrødt for å hjelpe til med pH-justering. PH ble justert til 7,4 med steril 1 M NaOH ved bruk av en visuell fargestandard som ble kontrollert mot et pH-meter. Kollagen geler ble fremstilt ved å blande rottehalecollagen, type I med 1/10
th volum av 10X PBS, justere pH til 7,4 ± 0,1, og deretter lagdeling 0,8 ml på Transwell innsatser som beskrevet ovenfor. Celler ble lagt på enten Matrigel, SISgel eller kollagen i en konsentrasjon på 5 × 10
5 celler /200 mL media, og 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA) som inneholder 1% penicillin, streptomycin og 10% føtalt kalveserum ble lagdelte under transwell støtter i 6-brønns plater som beskrevet [14]. Kulturer ble dyrket i 6 dager med medie endringer annenhver dag. Kulturer ble fjernet fra transwells, faste i 1% formalin etter liggende med agarose eller SISgel å hindre tap av celler på skjæring av seksjoner. Seksjoner (5 mikrometer) ble farget med hematoksylin og eosin. (https://www.affymetrix.com/browse/level_seven_software_products_only.jsp?productId=131414 categoryId=35623#)
