Abstract
Bakgrunn
Cub og Sushi flere domener 1 (CSMD1) genet, som ligger på den korte arm av kromosom 8, koder for en type jeg transmembrane protein og funksjonen er foreløpig ukjent . CSMD1 uttrykk er ofte tapt i mange epiteliale kreftformer. Vårt mål var å karakterisere forholdet mellom CSMD1 somatiske mutasjoner, allel ubalanse, DNA metylering og kliniske karakteristika i pasienter med kolorektal kreft.
Metoder
Vi sekvensert CSMD1 koding regioner i 54 kolorektal tumorer bruker 454FLX pyrosekvensering plattform for å avhøre 72 amplikonene dekker hele kodende sekvens. Vi brukte heterozygote SNP allel forholdstall på flere CSMD1 loci å bestemme allel balanse og antyde tap av heterozygositet. Til slutt utførte vi metylering spesifikk PCR på 76 kolorektal tumorer å fastslå DNA metylering status for CSMD1 og kjent metylering mål ALX4, RUNX3, NEUROG1, og CDKN2A.
Resultater
Ved hjelp 454FLX sekvensering og bekrefter med Sanger-sekvensering ble 16 CSMD1 somatiske mutasjoner identifisert i 6 av de 54 svulstene kolorektal (11%). Den nonsynonymous til synonymt mutasjon forholdet av de 16 somatiske mutasjoner var 15:01, et forhold betydelig høyere enn den forventede 02:01 forholdet (p = 0,014). Dette forholdstallet indikerer et nærvær av positiv utvelgelse for mutasjoner i CSMD1 proteinsekvensen. CSMD1 allelisk ubalanse var til stede i 19 til 37 informative tilfeller (56%). Pasienter med allel ubalanse og CSMD1 mutasjoner var betydelig yngre (gjennomsnittsalder, 41 år) enn de uten somatiske mutasjoner (gjennomsnittsalder, 68 år). De fleste av tumorer ble metylert ved ett eller flere CpG-loci i CSMD1-kodingssekvensen, og CSMD1 metylering signifikant korrelert med to kjente metylering mål ALX4 og RUNX3. C: G T: a. Erstatninger ble betydelig overrepresentert (47%), noe som tyder på omfattende cytosin metylering disponerer for somatiske mutasjoner
Konklusjoner
Deep amplicon sekvensering og metylering spesifikke PCR viser at CSMD1 endringer kan korrelere med tidligere kliniske presentasjon i kolorektale svulster, og dermed ytterligere impliserer CSMD1 som en tumor suppressor gen
Citation. Shull AY, Clendenning ML, Ghoshal-Gupta S, Farrell CL, Vangapandu HV, Dudas L, et al . (2013) somatiske mutasjoner, Allele tap, og DNA metylering av Cub og sushi flere domener 1 (CSMD1) Gene avslører Association med tidlig alder av diagnose i pasienter med kolorektal kreft. PLoS ONE 8 (3): e58731. doi: 10,1371 /journal.pone.0058731
Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 29 november 2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 07.03.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Støtte for dette prosjektet ble gitt av National Institutes of Health gi 7R21CA127683. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen med ca 1 million årlige tilfeller på verdensbasis [1]. Dette komplekset lidelse er vanligvis kjennetegnet ved en overflod av somatiske mutasjoner [2]. Men hver svulst sin egen unike mutasjons landskapet [3], og de underliggende mekanismene som gir opphav til denne mangfoldige landskapet er dårlig forstått. Aktivering mutasjoner i adenomatøs polypose coli (APC), Kirsten ras (KRAS) og fosfatidylinositol 3-kinase (PIK3CA) gener er svært vanlig i kolorektal kreft [4]. Det er sannsynlig at den rette kombinasjonen av mutasjoner kan gi en spesiell klon av celler som en proliferativ fordel. Mutasjoner som forårsaker eller bidrar til tumorprogresjon blir ofte referert til som sjåfører, mens mutasjoner som tilbyr ingen selektiv fordel blir ofte referert til som passasjerene [5], [6], [7]. Flertallet av somatiske mutasjoner som akkumuleres i tumorer er tause passasjerer [8], [9], mens små delmengder av mutasjoner er faktiske drivere [10], [11]. Ved å anta at alle tause (synonyme) mutasjoner er passasjerer, har bakgrunn frekvensen av somatiske mutasjoner i kolorektal kreft blitt rundet for å være en mutasjon pr megabase [12]. Gener som er oftere muterte enn den anslåtte bakgrunnen satsen kan være førere av neoplastisk utvikling. Ved å anta at alle tause mutasjoner er passasjerer og at ikke-stille (nonsynonymous) mutasjoner kan enten være drivere eller passasjerer, den generelle forholdet mellom nonsynonymous å synonymt (NS /S) mutasjoner i et gitt gen kan gi ytterligere bevis om hvorvidt det genet er under positiv eller negativ seleksjon for endringer i aminosyresekvensen. Gener som akkumulerer mutasjoner, men er under ingen seleksjonspress, har en forventet nonsynonymous å synonymt (NS /S) ratio på ca 02:01. Dette forventede-forholdet er basert på de første to nukleotid-posisjonene i kodonet som dikterer den kodede aminosyren og den tredje «wobble» posisjon slik at for kodon redundans. Denne mekanistisk oppsett av den genetiske koden gir dobbelt så mange muligheter for en gitt enkelt nukleotid substitusjon for å endre aminosyresekvensen som det finnes muligheter for å erstatte en nukleotid likevel bevare aminosyresekvensen. Gener med en overrepresentasjon av ikke-synonyme mutasjoner har et NS /S-forhold som er statistisk signifikant høyere enn den forventede 02:01 og kan trygt antas å være under positivt trykk selektivt å endre aminosyresekvensen i løpet av prosessen for tumorutvikling [ ,,,0],1. 3]. Derfor kan et høyt NS /S forholdet mellom somatiske mutasjoner gir statistiske bevis om et mutert gen er en driver for tumorprogresjon [3], [5].
Cub og Sushi flere domener 1 (CSMD1) gen er en roman kandidat tumor suppressor genet ligger på p arm av kromosom 8 (2792875 … 4852328). CSMD1 ofte vist å bli slettet [14], [15], [16], mutert [2], [10], [17], eller metylert [14], [18] i mange kreftformer. Faktisk er CSMD1 uttrykk ofte tapt i brystkreft [19], mens CSMD1 mister allel balanse i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) og lungekreft [20]. . CSMD1 har også vist seg å være metylert i HNSCC cellelinjer [21]
Den første ekson av CSMD1 havner en metylert CpG island (Kromosom 8: 4848969-4852635) [21], en sekvens rik på C: G basepar finnes CpG eller CpHpG sammenhenger [22]. CPG Island Methylator Phenotype (CIMP) [23] beskriver en undergruppe av kolorektal tumorer som viser høy metylering frekvens av spesifikke CpG øyer. Disse CIMP svulster har distinkte kliniske, patologiske, og molekylære signaturer som proksimale svulst beliggenhet, dårlig differensiering, og mikro ustabilitet. Viktige kliniske sammenhenger med CIMP har også blitt observert i bryst og hjernesvulster [24] indikerer at fenomenet er ikke bare vev bestemt. Det er ennå ikke klart om CIMP status forårsaker eller er bare knyttet til disse fenotyper. Metylering av spesifikke CIMP gener er bare løst korrelert med undertrykkelse av genekspresjon; derfor andre mekanismer som påvirker klinisk atferd CIMP svulster kan være viktig. Kimcellelinje nukleotidsubstitusjoner som involverer C: G T: A overganger antas å være katalysert av cytosin metylering [25]. Disse erstatninger føre til et genom-wide underrepresentasjon av CpG dinukleotider i forhold til hva som forventes ved en tilfeldighet alene. Genome metylering har dermed påvirket genomsekvens evolusjon og polymorfisme landskapet i de fleste virveldyr. Ved tilsvarende resonnement, er det mulig at CIMP status av tumorceller eller deres forstadier til kreft forløpere (stamceller) kan disponere metylert gener å akkumulere C: G T: a. Somatiske mutasjoner
Somatiske mutasjoner i svulstene kan gi historiske bevis for CSMD1 stanse ved metylering i kreftstamceller. Tykktarm stamceller som ligger på bunnen av kryptene kan være den primære mål for malign transformasjon [26], [27]. Mutasjoner som kommer i stamceller [28], [29], [30], [31] har en mulighet til å vedvare lenge nok for akkumulering av samarbeidende onkogene mutasjoner. Selv om epigenetisk stanse av CSMD1 kan bidra til ondartet transformerte fenotype, [32], [33], [34], [35], [36], [37], somatiske mutasjoner som akkumuleres som et resultat av metylering kan også bidra til malignitet av ukjente mekanismer. Ved å undersøke flere metoder for CSMD1 endringer (mutasjon, metylering, og allele tap), observerte vi signifikante sammenhenger av CSMD1 tap av funksjon med tidlig alder av diagnose i pasienter med kolorektal kreft. Korrelasjonen mellom CSMD1 tap av funksjon og klinisk presentasjon kan bidra til å gi innsikt i neoplastisk utvikling av tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Tumor Utvalg og DNA Isolation
De- identifiserte kirurgiske prøver ble innhentet fra South Carolina Biorepository System (Palmetto Health, Richland, Palmetto Health, Baptist, og Lexington Regional Medical Center, Lexington, South Carolina). Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Review Board of Palmetto Health, Lexington Medical Center, University of South Carolina og Georgia Health Sciences University, og alle skriftlige pasient samtykke ble innhentet før studiestart. De identifiserte kliniske data ble hentet fra svulsten-registeret, og den manuelle konservering av patologi poster ble gjennomført av vev bankpersonell.
Vi valgte 54 mikro-stabil kolorektal tumorer for denne studien. Alle kirurgiske prøver var frisk frosset, forankret i Optimal Cutting Temperatur forbindelse (Sakura Finetek, Torrence, CA), og delt. Prøvene ble kuttet i 10 um tykke skiver og festet til Sigma silane-prep ä lysbilder. Platene ble fiksert med 75%, 95% og 100% etanol og xylen. Sektorene fra begynnelsen og slutten av hver vevsprøve ble farget med Mayers Hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO) og eosin (Harleco, Lawrence, KS) løsninger for å spesifikt oppnå grensene for tumorvev. Alle pasienteksempeldata er gitt i tabell 1.
Henting av svulsten og normale epitelceller fra vevssnitt ble utført ved hjelp av mikro-disseksjon teknikk utviklet i vårt laboratorium. Tumor og normale celler ble identifisert for mikro-disseksjon med bruk av to forberedte H 60 sykluser ved 94 ° C i 10 sek, 62 ° C i 45 sek, og 62 ° C i 5 min. De endelige mal konsentrasjoner av svulsten og normal DNA var 3NG /mikroliter.
Screening for mikro Ustabilitet i Svulster
Påvisning av mismatch reparasjon mangelfulle svulster ble utført gjennom forsterkning av mikro locus, slik at svulster viser hypermutator fenotype kan utelukkes. Alle tumorer ble opprinnelig pre-screenet for mikro ustabilitet (MSI) ved hjelp BAT26 primere, og de med ustabilitet ble ekskludert. Deretter ble svulster med somatiske mutasjoner til CSMD1 analysert med tre ekstra NCI MSI loci: BAT25, D2S123 og D17S250 primere. Primere som brukes er oppført i tabell S1 i File S1 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Ingen av tumorene viste ustabilitet ved BAT26 locus, og bare en prøve (Tumor ID 587) viste moderat mikro ustabilitet ved BAT25 locus. PCR amplikonene ble generert med følgende protokoll: PCR mester blanding ble fremstilt ved hjelp av 5 ul KAPA 5x HiFi buffer (KAPA Biosystems Woburn, Massachusetts), 0,75 mL av 10 mM dNTP, 3,00 mL av primere (endelig konsentrasjon 2,5 um), 0,50 mL av KAPA HiFi Hotstart polymerase (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,00 mL 10X SYBR Grønn (Invitrogen, Carlsbad, California), 8,75 mL av PCR Vann (Invitrogen, Carlsbad, California), og 1 mL av DNA mal på 3NG /mikroliter. Termiske sykluser ble utført på en MyIQ termisk iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) ved anvendelse av følgende protokoll: 1 syklus med 95 ° C i 2 minutter; 3 sykluser med 63 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 15 sekunder; 3 sykluser 98 ° C i 20 sekunder, 60 ° C i 15 sek, 72 ° C i 15 sekunder; 3 sykluser med 98 ° C i 20 sekunder, 57 ° C i 15 sek, 72 ° C i 15 sekunder; 49 sykluser med 98 ° C i 20 sekunder, 56 ° C i 15 sek, 72 ° C i 15 sekunder; En syklus 55 ° C i 30 sekunder; 80 sykluser med 55 ° C i 30 sek. PCR-produktene ble kjørt på 10% TBE-Urea gels (Bio-Rad, California, USA) i henhold til produsentens retningslinjer og fotografert ved hjelp av en Alpha Imager og Antall One ™ programvare (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
Utarbeidelse av amplikonene for Sequencing
eksoner for CSMD1 og KRAS gener ble identifisert med Sequence Viewer på NCBI Nettsted (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer) . PCR-primere ble utformet for de 71 eksoner av CSMD1 og for 2 vanlige hotspot mutasjoner i KRAS (ekson 2, kodon 12 og 13) ved hjelp av PRIMER3 åpen kildekode (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input .htm;. (tabell S1 i File S1) KRAS ble sekvensert bare på mutasjon hotspots grunn til å prøve begrensninger fremover og bakover tag sekvenser, 454A og 454B, henholdsvis ble lagt til primere som er beskrevet i veiledningen til Amplicon Sequencing (454. life Sciences, Branford CT). PCR amplikonene for 454 sekvensering ble generert ved hjelp av 7,5 mL av KAPA 5x HiFi buffer (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,125 mL av 10 mM dNTP, 2,25 mL av primere (sluttkonsentrasjon 2,5 mikrometer), 0,75 mL KAPA HiFi Hotstart polymerase (KAPA Biosystems Woburn, MA), og 1 mL av DNA mal på 5 ng /ul Termisk sykling ble utført ved hjelp av en MyIQ termosykler (Bio-Rad, Hercules CA) og følgende touchdown protokoll:. en syklus, 95 ° C i 2 min, 3 sykluser med 94 ° C i 10 sek, 64 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek, 3 sykluser ved 94 ° C i 10 sek, 61 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 sykluser med 94 ° C i 10 sek, 58 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 50 sykluser ved 94 ° C i 10 sek, 57 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek. PCR-produktene ble analysert ved elektroforese på en 3% agarosegel og fotografert ved hjelp av en Alpha Imager og Antall One ™ (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Amplikonene ble renset ved hjelp SPRI Ampure perler (Agencourt, Beverly, MA) etter produsentens protokoll.
Sekvense med 454FLX Platform
SPRI-Ampure perle renset PCR-produkter (CSMD1 og KRAS) ble kvantifisert bruker Quanti-iT PicoGreen dsDNA analysen (Invitrogen, Carlsbad, California) og Fluoroskan Ascent FL
(
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). De amplikonene ble forsterket av emulsjon PCR der emPCR Kite II og III (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) og begge veier sekvensert på 454 GS FLX genomet sequencer (University of South Carolina Environmental Genomics Kjerne Facility, Columbia, SC). Amplikonene fra hver av de 54 svulster, samt 2 parede normale prøver, ble sekvensert til en gjennomsnittlig dybde på 1800 ganger med over 90% av amplikonene som representeres av mer enn 300 sekvens lyder per prøve. Over 500 000 individuelle sekvensering leser ble hentet fra amplikonene.
Variant Detection Analyse
454FLX sekvensering leser ble justert til referansesekvensen fra NCBI (hg19 Bygg 37) og analysert ved hjelp av programvaren CLC Genomics Workbench 4 (CLC Bio, Aarhus, Danmark). Vi analyserte våre sekvense data fra tykktarmssvulster og matchet normale prøver ved hjelp av Probabilistic Variant Detection Tool levert av Genomics Workbench. Mutasjoner sett i den komplementære normalt vev, det dbSNP databasen, eller 1000 genomer Prosjekt ble ansett for å være kimlinje-mutasjoner. De resterende mutasjoner ble betraktet som sannsynlige somatiske mutasjoner. Våre mutasjon samtaler ble gjort i henhold til robuste og strenge sekvense kriterier satt av CLC Genomics Workbench med en sannsynlighet samtale på 100 for å slette falske mutasjon observasjoner. Eventuelle homopolymerområder ble også ekskludert fra vår dataanalyse. Vi ekskluderte også oppdaget innsetting /sletting (Indel) varianter fra vår studie, siden 454FLX sekvensering er ikke sensitiv i å oppdage Indel tallet.
Somatisk Mutation validering gjennom Sanger-sekvense
Sanger-sekvensering av høy konsentrasjon variantene ble utført for å bekrefte de somatiske mutasjoner identifisert ved varianten deteksjonsanalyse. Beckman Coulter /Agencourt Genomisk Services (Beverly, MA) og kjerne genomikk anlegget på Georgia Health Sciences Universitetet utførte Sanger-sekvensering, utnytte de samme 454A og B-koder som tidligere beskrevet med 454FLX sekvensering. PCR amplikonene ble generert med følgende protokoll: PCR mester blanding ble fremstilt ved hjelp av 7 mL av PCR vann (Invitrogen, Carlsbad, California), 10 ul 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 pl Primer mix ( endelig konsentrasjon 2,5 mikrometer), og 1 mL av DNA mal på 3NG /mikroliter. Termiske sykluser ble utført med den følgende protokoll: 1 syklus med 98 ° C i 2 minutter; 3 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 63 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 57 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 49 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 56 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; En syklus på 55 ° C i 30 sekunder; 80 sykluser med 55 ° C i 80 sykluser. Sanger kromatogrammene ble analysert ved hjelp av CLC Genomics Workbench 4. Etter å ha blitt godkjent av Sanger-sekvensering, ble CSMD1 somatiske mutasjoner registrert og deponert i Leiden Åpne Variasjon Database (lovd) (Leiden University Medical Center, Nederland).
Allelic balanse Testing fra 454FLX CSMD1 Sekvenser
Vi brukte Sequential Sannsynlighet Ratio test (Sprt) for å påvise statistisk signifikante allele ubalanser i tumorprøver [39], [40]. Den Sprt er designet for å teste to konkurrerende hypotese bruker sekvensielt påløpt observasjoner over tid i forhold til forhåndsdefinerte øvre og nedre grenser for data [59]. Hypotese 1 er at allelene er balansert, så de forventede allele proporsjonene på informativ loci bør være 50%. Hypotese 2 er at en av de to alleler som er tilstede i den normale prøven er fullstendig fraværende i tumoren, slik at den forventede dominerende alleliske andel på informative loci skal være 100% for tumorprøver uforurensede med normal DNA. I tilfeller som gjennomgår LOH hvor svulsten DNA er forurenset med opp til 50% normal-DNA, er den forventede dominerende alleliske andel 66,7%. Konfidensintervall kurver ble konstruert for å korrekt identifisere balanserte og ubalanserte alleler hele serien av totale tellinger allel observert i 454FLX data, slik at for opp til 50% kontaminering av tumor med normal DNA. Den øvre kurve etablerer terskelen for alleliske ubalanse, mens den nedre kurve etablerer terskelen for alleliske balanse. Hvis en svulst største allel andel overskrider den øvre grense tumoren ble klassifisert som ubalansert. I motsetning til dette, hvis allelet andelen er mindre enn den nedre grensen kurve, ble tumoren klassifisert som balansert. Dersom den observerte allelet forhold inntraff mellom de to kurvene, ble prøvene klassifisert som ubestemt. I alle tilfeller ble to eller flere informative alleler som kreves for å være ute av balanse for å kalle en svulst ubalansert.
CSMD1 mRNA Expression Analysis i HCT116 WT og HCT116 DNMT1 /DNMT3B DKO
Expression of CSMD1 mRNA ble bestemt ved å utføre kvantitativ real-time PCR på HCT116 WT og HCT116 DNMT1 /3B DKO cDNA. HCT116 WT og DNMT1 /3B DKO cDNA ble generert ved først å isolere mRNA fra hver enkelt ved hjelp av Dynabeads mRNA isolert sett (Invitrogen, Carlsbad, CA) og deretter ble omdannet til cDNA ved anvendelse av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR amplikonene ble generert med følgende protokoll: PCR mester blanding ble fremstilt ved hjelp av 3 mL av PCR vann (Invitrogen, Carlsbad, California), 10 ul 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 pl Primer mix (slutt konsentrasjon 2,5 pM), og 5 pl av cDNA templat. Termiske sykluser ble utført med den følgende protokoll: 1 syklus med 98 ° C i 2 minutter; 3 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 64 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 61 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 sykluser med 98 ° C i 10 sek, 58 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 40 sykluser av 98 ° C i 10 sek, 57 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; En syklus på 95 ° C i 30 sekunder; 80 sykluser med touchdown gradient som starter ved 95 ° C og avtagende ved -5 ° C hver syklus.
Metylering Analyse bruker Metylering Spesifikk PCR /High Resolution Melt Curve Analyse
Vi renset DNA fra svulster og kontroll cellelinjer ved Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter Genomics, Beverly, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. To hundre nanogram genomisk DNA ble bisulfite endret av EZ DNA Metylering – Gold Kit (Zymo Research), etter produsentens protokoll. HCT116 og HCT116-DNMT1 /3B dobbel knockout (DKO) DNA [43] ble anvendt som positive og negative kontroller for metylering status for alle genene som ble undersøkt. CSMD1 er metylert og ikke uttrykt i villtype HCT-116 celler. I kontrast, er CSMD1 unmethylated og uttrykt i DKO celler [60]. CSMD1 genet metylering ble forespurt på 3 posisjoner og ble kåret CSMD1-1 (Chr8: 4852196-4852032), CSMD1-3 (4851450-4851301) og CSMD1-5 (4851422-4851291). Metyleringen spesifikke PCR-primere brukt er vist i Tabell S2 i File S1. Hver svulst generert et autentisk produkt enten med denaturert primere eller med unmethylated primere, men aldri begge deler. Tilfeller der ingen produktet ble observert med enten primerpar ble vurdert uninformative. De metylering Resultatene av svulstene er vist i tabell S3 i File S1.
metylering spesifikk PCR /høy oppløsning smelte Curve Analysen ble gjennomført i henhold til tidligere beskrevet protokoller [61]. PCR-reaksjonen ble utført ved bruk av 3-6 ng av bisulfitt modifisert DNA i et totalvolum på 20 ul, inneholdende 12,5 ul av 2X KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems Woburn, MA), (for analyse av genomisk posisjon 3265577 KAPA HRM rask PCR-kit ble benyttet); og 2.5pmol av primere [62]. Reaksjonssykkelbetingelsene var 94 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med 30 sek ved 94 ° C, Gene-spesifikke varmebehandlingstemperaturen i 30 sek, forlengelse ved 72 ° C i 30 sek, og et datainnsamlings vindu ved 76- 77 ° C i 30 sek. Assosiasjonskurver ble generert for alle produkter, og tilstedeværelse eller fravær av autentiske produkter ble bestemt ved sammenligning med positive og negative kontroller. Alle reaksjoner ble utført ved hjelp av en MyIQ Ensfargede Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad).
Statistical Analysis
Binomisk sannsynlighet ble brukt til å sammenligne betydningen mellom nonsynonymous å synonymt somatiske mutasjoner av CSMD1 i kolorektal pasienter. Sammenligning av gjennomsnittsalder på diagnose eller klinisk presentasjon for genetisk balanserte og ubalanserte pasienter med somatiske mutasjoner ble gjort av Mann-Whitney U test. Spearman Rank Correlation ble brukt til å sammenligne forholdet mellom denaturert loci.
Resultater
Frekvenser og karakter av somatiske mutasjoner
CSMD1 genet spenner 2,05 MB genomisk DNA på p arm av kromosom 8. den kodende sekvens del av genet er 11,740 nukleotider (0,0234 Mb pr diploid-genomet). Vi sekvensert totalt 54 kolorektal tumorer tilsvar til 1,26 MB CSMD1 CDS DNA. Vi identifiserte og Sanger-verifisert 16 somatiske mutasjoner i 6 av de 54 kolorektal tumorer (11%) (tabell 2). Vi beregnet en somatisk mutasjon rate på 11.90 mutasjoner /MB, en rente som er merkbart høyere enn de genom-wide bakgrunn mutasjon priser av mikro-stabil kolorektal kreft [3], [38].
de somatiske mutasjoner ble betydelig anriket for nonsynonymous endringer i forhold til synonymt endringer. For Sanger bekreftet varianter, identifiserte vi 15 nonsynonymous (NS) mutasjoner og en synonymt (S) mutasjon, for en NS /S forhold på 15:01. Sannsynligheten for dette mange (eller flere) nonsynonymous mutasjoner som oppstår ved en tilfeldighet alene er 0,014, argumenterer mot hypotesen om at CSMD1 er en passasjer genet påvirket av en mutator fenotype. Jo mer sannsynlig forklaring er at nonsynonymous mutasjoner er valgt for under kolorektal kreftutvikling. Det er viktig å merke seg at tumor 517 hadde 10 somatiske mutasjoner i CSMD1, ni av disse var nonsynonymous. Sannsynligheten for dette mange nonsynonymous mutasjoner som oppstår ved en tilfeldighet alene er 0,1. Den alternative hypotesen er at seleksjonspress kjørte opphopning av flere CSMD1 nonsynonymous varianter innenfor samme svulst, muligens bosatt i egne subkloner. De varierende undergrupper av mutasjonsfrekvenser i CSMD1 henspille på denne troen på at flere CSMD1 mutasjoner oppsto fra separate subkloner i samme svulst befolkningen (figur 1).
Ten CSMD1 somatisk mutasjon ble funnet i Tumor 517. Men disse spesielle mutasjoner forekommer ved varierende undergrupper av konsentrasjoner, noe som indikerer at hver enkelt undergruppe kan ha oppstått fra en uavhengig klon i populasjonen tumoren.
Siden progresjon av adenokarsinom kan drives av mutasjoner til KRAS onkogen, analyserte vi mutasjons hotspots i kodon 12 og 13 av exon 2 bruker Sanger-sekvensering av PCR-produkter. KRAS hotspot somatiske mutasjoner ble sett i 21 av de 54 kolorektal tumorer (~39%). Tre svulster finnes somatiske mutasjoner i både CSMD1 og KRAS, med to av de tre svulster som viser en høyere CSMD1 mutant allel frekvens enn KRAS mutant allel (tabell 1). Dette resultatet kan tyde på at CSMD1 somatiske mutasjoner predate KRAS somatiske mutasjoner, som antas å oppstå tidlig i løpet kolorektal tumorprogresjon. En svulst hadde CSMD1 mutasjon allel konsentrasjoner som var mindre enn KRAS mutant allel konsentrasjon, kanskje noe som indikerer at de CSMD1 mutasjoner i denne svulsten skjedde etter KRAS-mutasjoner. Likevel, klone skjuler den CSMD1 mutant allel utvidet tilstrekkelig til å tillate CSMD1 mutant allel å bli oppdaget, noe som viser at denne utvidelsen ikke var drevet av den muterte KRAS allel. For å kunne bestemme tidslinjer for CSMD1 og KRAS-mutasjoner, vil være nødvendig carful sekvensanalyse av tidlige lesjoner som adenomer. Likevel, våre observasjoner tyder på at CSMD1 nonsynonymous mutasjoner gir kreftceller med en selektiv fordel, som opererer uavhengig av fordelen levert av KRAS-mutasjoner.
Colorectal Svulster med CSMD1 LOH og somatiske mutasjoner Show Tidlig kliniske presentasjon
av de 54 svulster sekvensert, Tretti-sju hadde to eller flere loci som var heterozygote for germline varianter og kan derfor bli vurdert for CSMD1 allel ubalanse ved sekvensiell Sannsynlighets Ratio Test [39], [40]. Femtien prosent (19/37) av kolorektal tumorer var ubalansert på to eller flere sammenhengende CSMD1 loci (figur 2, tabell 1), noe som indikerer at CSMD1 tap av heterozygositet kunne ha skjedd i disse svulstene. Selv om forskjellen var ikke statistisk signifikant, gjennomsnittsalderen for diagnose for pasienter med CSMD1 allel ubalanse var yngre enn de med balanserte alleler (60 år mot 69 år, Mann-Whitney p = 0,052). Gjennomsnittsalderen ved diagnose for pasienter med CSMD1 somatiske mutasjoner var også yngre enn for de uten somatiske mutasjoner (58 vs. 66 år), men denne forskjellen var heller ikke statistisk signifikant. Tap av heterozygositet er en mekanisme som samvirker med somatisk mutasjon for å inaktivere tumorsuppressorgener. Vi observerte at pasienter med både ubalansert og muterte CSMD1 alleler var betydelig yngre i en alder av diagnose (41 år) enn pasienter med balansert og villtype CSMD1 (68 år, Mann-Whitney p = 0,0077). I motsetning til tidligere studier [17], gjorde vi ikke observere en signifikant sammenheng mellom CSMD1 somatisk mutasjon status og tumor stadium i denne serien av prøver. Likevel, det statistiske bevis på klinisk presentasjon sammenfaller med nyere studier utført av Kreft Genome Atlas (TCGA). Basert på en Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, TCGA sekvense data viste at pasienter med kolorektal kreft med CSMD1 endringer har en betydelig lavere sannsynlighet for overlevelse enn pasienter uten CSMD1 endringer (log-rank test p = 0,000565) [41]. Med et slikt bevis, identifisering av CSMD1 forandringer har potensiale til å bli brukt som markører i kolorektal cancer prognose.
Den øvre grense kurven vist i diagrammet viser den 95% CI terskel av CSMD1 loci blir klassifisert som ubalansert, mens den nedre grensen kurven viser 95% CI terskelen CSMD1 loci blir klassifisert som balansert. Svulster med to eller flere sammenhengende loci som ble ubalanserte ble klassifisert som å ha gjennomgått tap av heterozygositet. Loci som falt mellom de to tersklene ble ansett ubestemmelige for allel karakterisering. Visse loci i CSMD1 demonstrert allel balanse, selv om de bodde i svulster som var ubalansert for CSMD1. Dette resultatet henspiller på kromosom pauser som skjer i CSMD1 gensekvensen, nedstrøms undersøkte loci
Overskudd av CG . TA Mutasjoner og CSMD1 Metylering
Exome sekvensering av kolorektal kreft har avdekket at flere svulster har global overkant av CG TA somatiske mutasjoner [2], [3]. Vi har observert 7 ut av 15 (46,7%) CSMD1 somatiske mutasjoner var CG TA overganger (tabell 2). Denne klassen av mutasjonen oppstår fra ikke-enzymatisk deaminering av 5′-metylcytosin å produsere tymidin.
Tabell S1. Tabell S2. Tabell S3.
