Abstract
human epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er en viktig terapeutisk mål hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer og anti-EGFR antistoffer cetuximab og panitumumab er godkjent for behandling av slike pasienter. Til tross for disse fremskritt, kan varigheten av responsen hos noen pasienter være begrenset. Siden er EGFR stand til å danne heterodimerer med de andre medlemmene av den HER (human epidermal reseptor) familie, er det viktig å undersøke co-uttrykk og prognostisk betydning av alle medlemmer av hennes familie i pasienter med kolorektal kreft. Uttrykket av hennes familiemedlemmer ble bestemt i vevsprøver fra 86 pasienter med Dukes C og D (metastatisk) tykktarmskreft ved hjelp av immunhistokjemi. Snittene ble scoret av prosentandelen av positive tumorceller og intensitet av farging. Deres assosiasjoner med clinicopathological parametere og total overlevelse og sykdomsfri overlevelse ble evaluert ved hjelp av univariat og multivariat analyse. Overall, 43%, 77%, 52% og 92% av tilfellene var henholdsvis EGFR, HER-2, HER-3 og HER-fire positive. Interessant, 35%, 24%, 43% og 18% av tilfellene hadde co-uttrykk av EGFR henholdsvis /HER-2, EGFR /HER-3, EGFR /HER-4 og alle fire medlemmer av hennes familie. Av disse er bare uttrykk for EGFR og co-uttrykk av EGFR /HER-4 var assosiert med dårligere sykdomsfri overlevelse i både univariat og multivariat analyse. Co-uttrykk for alle medlemmer av hennes familie i tykktarmskreft støtter behovet for videre undersøkelser på deres prediktiv verdi for respons på behandling med anti-EGFR mAbs og hvorvidt en slik sub-populasjon av pasienter kan ha nytte av behandling med den nye generasjonen av pan -hennes hemmere
Citation:. Khelwatty SA, Essapen S, Bagwan jeg, Grønn M, Seddon AM, Modjtahedi H (2014) Co-uttrykk for hennes familiemedlemmer i pasienter med Dukes «C og D tykktarmskreft og deres Konsekvenser for pasient Prognose og overlevelse. PLoS ONE 9 (3): e91139. doi: 10,1371 /journal.pone.0091139
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 11. desember 2013, Godkjent: 07.02.2014; Publisert: 07.03.2014
Copyright: © 2014 Khelwatty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av en bevilgning fra BRIGHT kreft veldedighet (UK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er fortsatt en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis. I 2013, er tykktarmskreft anslått til å være den fjerde hyppigste kreft kreft (142 820), men den nest største årsaken til kreftdødsfall (50830) etter lungekreft i USA [1]. For tiden, av de forskjellige stoffer som er utviklet for målrettet terapi av humane kreftformer, anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) monoklonale antistoffer (mAbs), cetuximab og panitumumabs, og den anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) mAb bevacizumab har vært innlemmet i behandlings paradigmer for flertallet av pasienter med metastatisk kolorektalcancer [2] – [5]. Selv om inkludering av disse midler har forbedret overlevelse av pasienter med metastatisk kolorektal kreft, kan varigheten av responsen være begrenset. I tillegg har det ikke vært noen pålitelig logisk markør for respons på disse anti-EGFR-målrettede terapier [6] – [10]. Utvikling og identifisering av slike markører ikke bare kan hjelpe i valg av en mer spesifikk sub-populasjon av pasienter med kolorektal kreft som er mer sannsynlig å dra nytte av slik behandling, men de kan også redusere unødvendige behandlinger og dermed høye kostnader til helsetjenester system [11].
i de siste fire tiår, avvikende uttrykk for ulike medlemmer av hennes familie og deres ligander har blitt rapportert i en rekke humane kreftformer. I noen studier har disse vært assosiert med resistens overfor konvensjonelle former for terapi og en dårligere prognose [6], [12], [13]. Det er imidlertid store variasjoner i rapporterte uttrykk av hennes familiemedlemmer i pasienter med kolorektal kreft [6], [14] – [16]. I tillegg til dannelsen av homodimerer, de familiemedlemmene som for eksempel EGFR er i stand til å bli aktivert ved å danne heterodimerer med andre medlemmer av familien sin [17] – [19]
Selv om et begrenset antall. studier har undersøkt uttrykk og prognostisk betydning av enkelte medlemmer av hennes familie i pasienter med kolorektal kreft [20] – [23], men til vår kunnskap, det har vært noen omfattende studier på co-uttrykk og prognostisk betydning av fullstendige medlemmer av hennes familie i pasienter med kolorektal kreft å date [6]. Derfor, i denne studien har vi undersøkt uttrykket nivåer av alle medlemmer av hennes familie, individuelt så vel som deres co-uttrykk i tumorprøver fra 86 pasienter med Dukes C og D tykktarmskreft. Vi har også undersøkt noen sammenheng mellom uttrykket av hennes familiemedlemmer og clinicopathological parametere, sykdomsfri overlevelse og total overlevelse.
Materialer og metoder
Pasientinformasjon
Etisk godkjenning ble hentet fra forskning og utvikling komité Royal Surrey County Hospital for undersøkelse av vevsprøver fra pasienter med tykktarmskreft for bruk i denne retrospektive studien. Som eneste arkiverte vevsprøver ble inkludert i denne studien, etisk komité fravikes behovet for samtykke og pasientjournaler /informasjon ble analysert anonymt. Åtti-seks pasienter med Dukes «C og D tykktarmskreft, som gjennomgikk radikal kirurgi ved Royal Surrey County Hospital (Guildford, UK) mellom april 2002 og november 2007 ble inkludert i denne retrospektive studien. De med ingen oppfølging informasjon, mis-diagnose, og ufullstendig histologi ble ekskludert. Tilfeller av peri- og postoperativ død ble også ekskludert fra denne studien, som var de med tumorvev i en tilstand for dårlig for immunhistokjemisk bruk. Detaljert clinicopathological informasjon, inkludert pasientens alder og kjønn var tilgjengelig for den enkelte pasient.
Immunohistochemistry
Formalin faste parafininnstøpte (FFPE) deler av vevsprøver (3 um) ble kuttet i seriesnitt og ble farget ved anvendelse av følgende primære antistoffer muse-anti-EGFR (01:10, Novacastra, UK), muse-anti-HER-2 (1:150, Insight bioteknologi, UK), muse-anti-HER-3 (1:20, Novacastra , UK) og kanin-anti-HER-4 (01:20, Fisher Scientific, UK). Etter antigen gjenfinning, ble tumorsnitt inkubert med primære antistoffer anti EGFR, HER-3 og HER-4 i 60 minutter og HER-2 for 32 minutter. Protokoll optimalisering ble gjennomført ved hjelp av etablerte hennes positive kreftcellelinje pellets, nemlig EGFR overekspresjon menneskelige tykktarmskreft cellelinje Difi, som var vennlig levert av Dr Z Fan (MD Anderson Cancer Centre, USA), HER-2 overekspresjon human brystkreft cellelinje SKBR3 (HER-2), og HER-3 og HER-4-positiv human brystcarcinoma cellelinje MCF-7 som tidligere beskrevet [24]. Farging ble utført på en Venatana Benchmark XT Autostainer med Ultra DAB kit (Roche, UK). Til slutt ble alle lysbilder rehydrert og kontra med haematoxylin, montert og dekselet sklei.
Scoring System
I dagens litteratur, cut-off verdier for å oppnå positive HER farging av tumor seksjoner er variabel . I denne studien ble den farging av tumorseksjoner mottok basert på prosentandelen av tumorceller som hadde sitt immunfarging (ie 5% + 10%, og 50%) og intensitet av farging (dvs. negativ 0, svak positiv 1+, 2+ moderat positiv og sterkt positive 3+) og om fargingen var hovedsakelig tilstede i membranen, cytoplasma eller kjernen av cellene [15]. Av HER farging, HER-4 hadde de høyeste nivåene av bakgrunnsfarging og derfor farging over bakgrunnsnivå ble ansett [22]. To uavhengige observatører (inkludert en konsulent histopathologist), uten forutgående kunnskap om clinicopathological parametere, utført scoring og eventuelle misforhold i scoring ble løst ved samtidig revurdering av farging av begge observatører.
Statistical Analysis
Sammenhengen mellom immunhistokjemi score og pasient clinicopathological data ble vurdert ved hjelp av Chi-Squared test (Pearson Chi-Square) og Fishers eksakte test. Kaplan-Meier-overlevelsesplottene ble brukt til å utføre univariat analyse og forskjellene mellom grupper ble evaluert ved å utføre log rank-test. For multivariasjonsanalyse ble Cox fler regresjonsmodellen benyttes og P≤0.05 ble betraktet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av PASW statistikk 21 (SPPS Inc.).
Resultater
Clinicopathological Funksjoner
Pasient clinicopathological egenskaper er oppsummert i tabell 1. Median pasient oppfølgingstid var 6 år. Ingen av pasientene hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Femtito pasienter fikk postoperativ adjuvant kjemoterapi, som var overveiende 5-fluorouracil basert med noen pasienter som får oksaliplatin og irinotecan basert terapi. En dårligere total overlevelse ble observert hos pasienter med Dukes «D sammenlignet med Dukes C (3,2 ± 0,6 versus 6,2 ± 0,4 år,
P = 0.005
), og de med mer enn 3 positive lymfeknuter (4,3 ± 0,4 versus 6,7 ± 0,5
P = 0,008
). Ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom pasient utfall og de andre clinicopathological parametre (Tabell 1.).
Immunhistokjemisk Uttrykk av hennes familiemedlemmer
I cut off verdi på ≥5%, tumor prøver fra 43%, 77%, 52% og 92% av tilfellene var EGFR, HER-2, HER-3 og HER-fire positive (Tabell 2). I motsetning til EGFR, som hadde overveiende membranøs flekker, den dominerende plassering av HER-2, HER-3 og HER-4 immunfarging ble cytoplasmiske (tabell 2 figur 1). I denne studien har vi undersøkt samtidig uttrykk for alle medlemmer av hennes familie i tykktarm kreft pasienter og resultatene er presentert i tabell 3. Samtidig uttrykk av EGFR med HER-2, HER-3, HER-4, og HER-2 /HER-4 var til stede i 35%, 24%, 43% og 76% av tilfellene undersøkt (tabell 3). Interessant, ble 18% av pasientene i denne studien funnet å co-uttrykke alle fire medlemmer av hennes familie (tabell 3 figur 2).
Farging av EGFR 3+, HER-2 3+, HER-3 2+, og HER-4 3+ i formalinfiksert parafin innebygd tumorsnitt farget immunohistochemically, som beskrevet under metoder og pasienter delen. Forstørrelse:. × 200
Samtidig uttrykk av EGFR, HER-2, HER-3, og HER-4 i en formalinfiksert parafin innebygd tumorsnitt farget immunohistochemically som beskrevet under metoder og pasienter delen. Forstørrelse:. × 200
Prosentandelen av hennes positive tykktarm kreft tilfeller ble også evaluert når farging var til stede i mer enn 10% og 50% av tumorceller (tabell 2). Bruke cut-off verdier på over 10% og 50%, andelen av tilfeller med EGFR positive tumorer var 30% og 4%, HER-2 positive svulster were12% og 8% og hennes-3 positive svulster var 45% og 22 %, henholdsvis (tabell 2). Antallet av HER-4 positive tumorer forble den samme uavhengig av cut-off-verdier for prosentandelen av positive tumorceller, som alle pasientene hadde HER-4 immunofarging i mer enn 50% av tumorcellene i denne studien (tabell 2) .
Expression og Co-uttrykk for hennes familiemedlemmer er assosiert med Clinicopathological Parametere
Sammenhengen mellom clinicopathological egenskaper og uttrykk for hennes familiemedlemmer ble bestemt av Chi-squared test. Alle underkategorier (dvs. prosentvise positive celler, intensitet og plassering av den farging), som ble funnet å ha en statistisk signifikant sammenheng med clinicopathological parametere er oppsummert i tabell 4.
Ved farging var tilstede i større enn 5% av tumorcellene, ble en signifikant sammenheng funnet mellom ekspresjon av EGFR og alder (
P = 0,022
), og tumorstedet (
P = 0,022
), med en betydelig høyere antall pasienter over 70 år som har EGFR positive svulster i venstre colon (tabell 4). I tillegg ble et betydelig høyere antall Dukes «C svulster funnet å uttrykke HER-4 (
P = 0,011
) (tabell 4). Som EGFR uttrykk, samtidig uttrykk for EGFR /HER-4 ble også signifikant assosiert med pasienter over 70 år (
P = 0,031
) og presentere svulster i venstre kolon (
P = 0,039
) i denne studien. I tillegg ble et betydelig høyere antall svulster i venstre kolon funnet å co-express EGFR /HER-2 /HER-4 (
P = 0,036
) (tabell 4).
på avskåret verdi på over 10%, uttrykket av HER-2 ble assosiert med involvering av mer enn 3 positive lymfeknuter (
P = 0,047
) (Tabell 4). I tillegg er en betydelig høyere antall svulster som uttrykker HER-3 (
P = 0,037
), eller co-uttrykker EGFR /HER-3 (
P = 0,035
), eller HER-3 /HER-4 (
P = 0,026
) ble funnet i tumorer pT4 scenen i denne studien (tabell 4). Når analysert basert på intensiteten av HER farging, ble en signifikant sammenheng funnet mellom HER-fire farging intensitet av 1+ og 2+ og et høyere antall G3 svulster (tabell 4).
sykdomsfri overlevelse er signifikant assosiert med Expression og Co-uttrykk for hennes familiemedlemmer
Sammenhengen mellom uttrykket av individuelle, to, tre eller alle fire medlemmer av hennes familie og sykdomsfri overlevelse ble undersøkt ved hjelp av Kaplan-Meier kurver og log rank-test. Sykdomsfri overlevelse ble funnet å være signifikant dårligere hos pasienter med EGFR uttrykk ved avskåret verdier av både over 5% (
P = 0,019
) og 50% (
P = 0.005
), membranøs ekspresjon av EGFR (P = 0,004) og EGFR farging intensitet på 1+ (
P = 0,041
) (Figur 3 og Tabell 5). I tillegg var det en signifikant sammenheng mellom co-uttrykk av EGFR og HER-4 på over 5% eller over 10% av kreftceller og dårligere sykdomsfri overlevelse (
P = 0,019
) (tabell 5 ). Samtidig uttrykk for HER-2 /HER-3 ble også funnet å være signifikant assosiert med dårligere sykdomsfri overlevelse (
P = 0,031
) (tabell 5).
Kaplan-Meier overlevelses~~POS=TRUNC kurver~~POS=HEADCOMP som viser virkningen på sykdomsfri overlevelse av pasienter med EGFR-ekspresjon (A), membranøs EGFR-ekspresjon (B), EGFR 1+ immunofarging (C) og EGFR /HER-4-ko-ekspresjon (D). En log-rank test verdi på
P≤0.05
ble ansett statistisk signifikans.
Bilder
Til slutt, i multivariat analyse, uttrykket av EGFR ved avskåret verdier av både above5 % (
P = 0,027
) og 50% (
P = 0,015
), membranous uttrykk av EGFR (
P = 0,007
) og EGFR 1+ farging (
P = 0,048
) ble funnet å forbli uavhengige prognostiske faktorer for dårlig sykdomsfri overlevelse. Ser på co-uttrykk av reseptorer, bare EGFR /HER-fire farging på over 5% tumorceller forble som en selvstendig prognostisk faktor for dårlig sykdomsfri overlevelse i denne studien (tabell 5). Ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom HER uttrykk og total overlevelse i denne studien.
Diskusjoner
Den avvikende uttrykk for hennes familiemedlemmer og spesielt EGFR har blitt rapportert i et bredt spekter av humane kreftformer og har vært forbundet med metastase og dårlig prognose [6], [25], [26]. Som et resultat har det vært en betydelig utvikling av molekyl terapier målrettet mot EGFR og påfølgende godkjenning av anti-EGFR-mAb, for eksempel cetuximab og panitumumab, for behandling av pasienter med metastatisk kolorektal kreft [2], [27]. Men til tross for omfattende studier, er det i dag ingen pålitelige markører for å forutsi respons på behandling med disse EGFR-hemmere [6], [28]. I flere studier,
KRAS
mutasjoner hos pasienter med tykktarmskreft er assosiert med resistens mot behandling med anti-EGFR-antistoffer, og det er den eneste biomarkør for å forutsi pasientens resultater ved behandling med målrettede anti HER behandling i tykk- og endetarmskreft [ ,,,0],29]. Men til tross for disse fremskritt, er det klart at ikke alle pasienter med kolorektal kreft med villtype KRAS ville få nytte av anti-EGFR mAbs og objektive svar har også blitt rapportert hos pasienter med KRAS muterte tumorer [30]. En årsak til dette kan være at KRAS har ingen direkte interaksjon med antistoffbinding på antigen området, og derfor er det klokt å undersøke uttrykket av andre medlemmer av hennes familie, som har vist seg å aktivere nedstrøms trasé, via heterodimerisation og kryss -Snakk, og drive tumorgenesen av tykktarmskreft hos disse pasientene [17] – [19]
Flere andre studier har undersøkt uttrykk for de enkelte medlemmer av hennes familie som en prognostisk indikator, men ingen klar. foreninger har blitt funnet mellom uttrykket av hennes proteiner og prognose i pasienter med kolorektal kreft [31] – [37]. Den rapporterte ekspresjon av EGFR mellom 8 til 100%, HER-2 fra 1% til 89%, HER-3 16-89%, og HER-4 11-81% hos pasienter med kolorektal kreft [6], [14 ] – [16], [20] – [22], [38]. Den store variasjonen i rapportert uttrykk for hennes familie proteiner ved immunhistokjemi i kolorektal kreft kan ha bidratt til de motstridende data om deres prognostisk betydning ved kolorektalkreft [6]. Faktisk faktorer som bruk av ulike antistoffer, forskjeller i antigen henteteknikker, poengsystemer, ulike pasientpopulasjoner, utvalgsstørrelser [f.eks microarray (TMA)], og ulike prøvenummer kan bidra til store variasjoner i rapporterte uttrykk av hennes familiemedlemmer i litteraturen [6], [28].
I denne studien har vi undersøkt uttrykk for alle medlemmer av hennes familie i 86 pasienter med Dukes «C og D tykktarmskreft. Siden uoverensstemmelser i scoring system som bruk av forskjellige cut off verdier for henne farging er en viktig medvirkende faktor for den store variasjonen i sin rapportert uttrykk i litteraturen, i denne studien farging ble scoret og evaluert ved hjelp av tre forskjellige cut off verdier av 5%, 10%, og 50% (tabell 2). Av de 86 sakene, fant vi 43%, 77%, 52% og 92% av tilfellene å ha EGFR, HER-2, HER-3, og HER-fire farging stede i 5% av tumorceller henholdsvis ( Figur 1). Heri, mens vi ikke fant noen sammenheng mellom uttrykket av hennes familiemedlemmer og total overlevelse, er dette i samsvar med andre studier i litteraturen [6]. I motsetning til total overlevelse, i denne studien uttrykk for EGFR og co-uttrykk av EGFR /HER-4 ble assosiert med sykdomsfri overlevelse i både univariat og multivariat analyse (Figur 3 tabell 5). Ekspresjon av EGFR er signifikant assosiert med dårlig sykdomsfri overlevelse og sykdom tilbakefall i to andre studier. I en studie Galizia et al. [34] undersøkte ekspresjon av EGFR i vevsprøver fra 154 Dukes «A-D tykktarmskreftpasienter og funnet membran ekspresjon av EGFR å være signifikant assosiert med dårlig sykdomsfri overlevelse, både i univariat og multivariat analyse. I en annen studie som involverte 102 avanserte pasienter med kolorektal kreft, ble 75,5% av tilfellene fant å uttrykke EGFR, som var signifikant assosiert med sykdom tilbakefall [39]. I motsetning til dette, Leung et al. [23] i sin studie av 127 tykktarmskreftpasienter som bruker TMA seksjoner, fant ingen signifikant sammenheng mellom uttrykk av EGFR, og pasienten utfallet, men fant HER-tre uttrykk for å være en signifikant prediktor for overlevelse utfallet. Som forklart ovenfor, kan forskjeller som for eksempel bruk av TMA seksjoner i stedet for hele vev blokker, den heterogene natur av svulster, og ved bruk av forskjellige cut off-verdier være noen av de medvirkende faktorer for de motstridende data på ekspresjon og prognostisk betydning av HER proteiner i tykk- og endetarmskreft. I tillegg, som vi undersøkt den prognostiske betydningen av hennes familiemedlemmer i bare 86 pasienter i denne studien, ville dette kreve ytterligere validering i større gruppe av pasienter med kolorektal kreft.
Flere studier tyder på at heterodimerisation av hennes familie medlemmer spiller en avgjørende rolle i tumorgenesen, og spesielt kan de også spille en viktig rolle i utvikling av resistens overfor terapi i pasienter med kolorektal cancer, [17] – [19]. Men til dags dato bare fire studier har bestemt uttrykk for alle de individuelle medlemmer av hennes familie, men co-uttrykk nivåer av alle medlemmer av hennes familie har ikke tidligere blitt rapportert i tykk- og endetarmskreft [20] – [23]. Så vidt vi vet, er dette den første studien som rapporterer både individuelt uttrykk og co-uttrykk for alle hennes familiemedlemmer i vevsprøver fra pasienter med Dukes C og D tykktarmskreft. Interessant, vurderer cut-off verdier på 5% og 10% positive tumorceller, fant vi co-uttrykk av EGFR /HER-4 for å bli signifikant assosiert med sykdomsfri overlevelse hos pasienter med Dukes «C og D tykktarmskreft i denne studien (tabell 5). Mens noen studier rapporterer assosiasjoner mellom co-uttrykk for HER-2 /hennes-4 eller HER-3 /HER-4 og sent svulst stadier [21], [22], så vidt vi vet den betydelige co-uttrykk av EGFR /HER-4 med dårligere sykdomsfri overlevelse i kolon kreftpasienter har ikke tidligere blitt rapportert. Våre resultater tyder på at heterodimer dannelsen av EGFR og HER-4 kan spille en viktig rolle i tumorgenesen av tykktarmskreft og bidra til raskere sykdommen tilbakefall hos disse pasientene. Interessant, har vi funnet co-uttrykk av alle fire medlemmer av hennes familie i 18% av tilfellene undersøkes og 35%, 24% og 43% av tilfellene hadde co-uttrykk av EGFR med HER-2, HER-3 og HER-fire kroner. Derfor er det viktig å undersøke om co-uttrykk for andre medlemmer av hennes familie i EGFR positive kreftformer kan bidra til motstand, eller en dårlig respons på behandling med anti-EGFR mAbs cetuximab og panitumumab hos pasienter med tykktarmskreft [ ,,,0],6].
i konklusjonen, co-uttrykk for alle medlemmer av sin familie i en betydelig prosentandel av pasienter med metastaserende tykktarmskreftpasienter rapportert her sammen med viktigheten av heterodimerisation mellom medlemmer av hennes familie i aktivering av HER signalveier, støtter behovet for videre studier på deres co-uttrykk, prognostisk betydning og prediktiv verdi for respons på behandling med henne hemmere, i en større populasjon av pasienter med kolorektal kreft. Særlig bør slike studier rakne om dette sub-populasjon av pasienter kan ha nytte av behandling med den nye generasjonen av pan-HER hemmere [40], [41].
