Abstract
intratumor heterogenitet (ITH) fører til en undervurdering av mutasjons landskapet portrettert av en enkelt nål biopsi og dermed påvirker behandlingen presisjon. Omfanget av tykktarmskreft (CRC) genetisk ITH er ikke godt forstått i kinesiske pasienter. Derfor gjennomførte vi dypt sekvensering ved hjelp av OncoGxOne
™ Plus panel, målretting 333 kreftspesifikke gener i multi-regionen biopsi av primære og levermetastatiske svulster fra tre kinesiske CRC pasienter. Vi fastslått at omfanget av ITH varierte mellom de tre tilfellene. I gjennomsnitt, 65% av alle mutasjonene oppdaget var vanlig i enkelte svulster.
KMT2C
avvik og
NCOR1
mutasjon var de eneste stedsnærværende hendelser. Etterfølgende fylogenetisk analyse viste at svulster utviklet seg i en forgrenet måte. Sammenligning av de primære og metastatiske svulster viste at
PPP2R1A plakater (E370X),
SETD2 plakater (I1608V),
SMAD4 plakater (G382T), og
AR
spleising sete-mutasjoner kan være spesifikke for levermetastatisk kreft. Disse mutasjonene kan bidra til initiering og progresjon av fjernmetastaser. Kollektivt, vår analyse identifisert et betydelig nivå av genetisk ITH i barnekonvensjonen, som bør vurderes for personlig terapeutiske strategier
Citation. Lu YW, Zhang HF, Liang R, Xie ZR, Luo HY, Zeng YJ, et al. (2016) tykktarmskreft Genetisk heterogenitet Avgrenset av Multi-Region Sequencing. PLoS ONE 11 (3): e0152673. doi: 10,1371 /journal.pone.0152673
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 23 november 2015; Godkjent: 17 mars 2016; Publisert: 29 mars 2016
Copyright: © 2016 Lu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Sequencing data er tilgjengelige fra Sequence Hent Archive (SRA) database (tiltredelse antall SRP065361)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Foundation of Medical ledende talent i Yunnan-provinsen (No. L-201205) KHW, Foundation of Yunnan Institute of Digestive Disease (No. 2014NS122) KHW, Ministry of Science and Technology i Yunnan-provinsen, Kunming Medical University (NO. 2015FB100) HFZ, National Natural Science Foundation of China (81460007) XYK. https://www.nsfc.gov.cn/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste årsakene til dødsfall på verdensbasis, og står for anslagsvis 1,2 millioner nye tilfeller og 600.000 dødsfall hvert år [1]. CRC er den tredje vanligste kreftsykdommen og den femte største årsaken til kreft dødsfall i Kina. Forekomsten av CRC har også økt i den kinesiske befolkningen i de senere år [2]. Selv om betydelig fremgang har blitt gjort om CRC behandling, herunder målrettet terapi, fem års relativ overlevelse for pasienter med fjernmetastaser er bare 12,5% [3]. Derfor er sterkt ønskelig en omfattende forståelse av molekylærbiologi av CRC. Disse nye innsikter vil deretter forbedre behandlingen av CRC.
intratumor heterogenitet (ITH) fører til en undervurdering av mutasjons landskapet portrettert av en enkelt nål biopsi og dermed påvirker behandlingen presisjon. Med utviklingen av neste generasjons sekvensering (NGS), har ITH nylig blitt belyst i betydelig detalj i flere krefttyper [4-7], inkludert CRC [8, 9]. Kim et al. [8] utført multi-regionen biopsi av primære og levermetastatisk regioner fra fem CRC gjennom hel-exome sekvensering og observert at bare 19,8% -53,9% av mutasjonene i en gitt prøve var universell. De har også identifisert
APC
,
KRAS
, og
TP53
mutasjoner i alle regionale biopsier. Sekvenser dekning av studiet er relativt lav, noe som kan føre til overse den lavfrekvente mutasjonen. Mens det i Kogita studien, [9] de bare rettet 50 kreftgener, og følgelig den identifiserte omfanget av CRC genetisk ITH var begrenset. I tillegg har ikke blitt etablert omfanget av CRC genetisk ITH hos kinesiske pasienter.
Vi har utført dyp dekning sekvensering ved hjelp av atVelg Target berikelse Kit og OncoGxOne
™ Plus panel av DNA fra multi-region biopsi av primære og levermetastatiske svulster i tre kinesiske CRC pasienter å karakter CRC ITH i kinesiske pasienter. Vi bestemt mutasjon landskapet og identifisert betydelig grad av genetisk ITH i CRC.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Tre pasienter med multi-regional primære tykktarmskreft kirurgisk resected i første Folkets sykehus i Yunnan-provinsen mellom oktober 2013 og april 2014 ble inkludert i studien. Patologisk svulst staging ble gjennomført i henhold til TNM klassifikasjon (tabell 1). Denne studien ble godkjent av etisk komité av det første Folkets sykehus i Yunnan-provinsen (2014YXLH029). Alle pasientene i studien gitt skriftlig informert samtykke for bruk av resected vev.
DNA
De formalinfiksert, parafin-embedded (FFPE) prøver ble utsatt for histologisk vurdering vil bare de som inneholder tilstrekkelig med tumorceller (minst 70% tumorceller), som bestemmes av hematoxylin og eosin-farging, og passet normale vev ble valgt ut for DNA-isolasjon. Genomisk DNA ble isolert ved hjelp av QIAamp
® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens prosedyre med små modifikasjoner. Genomiske DNA-prøver ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop 2000 spektrofotometer (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Den isolerte DNA ble lagret ved -80 ° C inntil analyse.
mikro testing
mikro ustabilitet (MSI) status ble bestemt for hvert tilfelle ved å bruke fem mononukleotid eller dinukleotidpolyfosfater mikro markører (BAT25, BAT26, D17S250, D2S123, og D5S346) [10]. Primere ble 5′-merket med HEX, FAM eller TET (Sangon Biotech Co., Ltd, Shanghai, Kina). All mikro loci ble amplifisert fra matchet normal og tumor-DNA gjennom fluorescens multipleks-polymerase kjedereaksjon (PCR). Deretter ble PCR produktene sekvensert på ABI 3730XL automatisert sequencer ved hjelp av et fragment analyse programvare (Gene Scan, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Mikro markør stabilitet ble analysert ved hjelp av GeneMapper programvare. MSI status ble klassifisert som MSI-høy hvis ≥30% av markører var ustabil, MSI-lav hvis. 30% av markører var ustabil, og ingen endringer eller tilleggs topper for mikro stabil (MSS) tykktarmskreft
Target berikelse og sekvense
Prøve sekvens berikelse og bibliotek forberedelse ble utført ved å bruke atVelg Target Enrichment Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og OncoGxOne
™ Plus kreft panel (GENEWIZ, Inc ., South Plainfield, NJ, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. OncoGxOne Plus, en målrettet onkologi panel, inneholder 333 kreftspesifikke gener (inkludert alle kjente kreft driver gener og 64 målrettede og kjemoterapi relaterte gener). I korte trekk ble 200 ng genomisk DNA fra hver prøve fragmentert av akustisk skjærpåvirkning på en Covaris instrument. Brøkdeler av 150-200 bp ble ligert til atVelg Adaptor Oligo og PCR-forsterket i 10 sykluser. For målet berikelse, ble hele biblioteket hybridiserte ved hjelp av atVelg Oligo Capture Kit for 16 eller 24 timer ved 65 ° C. Biotinylerte hybrider ble tatt til fange, og beriket bibliotekene ble gjennomført under 16 PCR-sykluser. De resulterende rensede bibliotekene ble samlet og sekvensert ved hjelp av Illumina
® MiSeq
™ NGS instrument for 2 × 150 parvise end sekvense leser (Illumina, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens protokoller. Genene i OncoGxOne
™ Plus kreft panel er oppført i S1 tabell.
Bioinformatikk analyse
Sekvense data ble tilgjengelig gjennom MiSeq Reporter. Datakvalitet ble undersøkt ved hjelp av FastQC (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) og deretter justert til det humane genomet referanse (hg19) ved hjelp av Burrows-Wheeler justeringsverktøyet for å generere et bam fil [11]. Variant kall ble utført ved hjelp av Genome Analysis Toolkit, som standard [12]. Rå variant samtaler ble filtrert ut ved hjelp av allelfrekvenser 5% og endret leser 7X. Deretter ble de resulterende varianter kommentert av Illumina Variant Studio versjon 2.2.3 (Illumina, San Diego, CA, USA) og ANNOVAR [13]. Kjente single-nukleotid polymorfismer ble ekskludert ved hjelp varianter inthedbSNP 137 (hg19) [14] og SNPs presentert i 1000 genomer data. De potensielle germinal mutasjoner ble sekvensert i matchet normalt vev.
fylogenetisk analyse
Vi utledes forfedrenes relasjoner mellom primærsvulster og metastaser av Pasient 3 ved mutasjon profiler. Nabotrær ble konstruert som tidligere beskrevet av Kim et al. [8], med noen modifikasjoner. Vi brukte phytools [15] for å beregne nabo avstander og nabo algoritme implementert i PHYLIP [16] programvarepakke for å utlede fylogenetisk tre.
Resultater
Oversikt over NGS data
Tre CRC-pasienter (P1, P2, og P3) ble inkludert i denne studien. Deretter ble 10 prøver fra 3 pasienter sekvensert, med en median dekning av 250 leser. Vi identifiserte ~ 8000 somatiske single-nucleotide variasjoner (SNVs) (4.444 til 8348) og ~ 850 (457 til 1154) somatiske innsettinger og slettinger (indels) i de 10 biopsiprøver fra de tre CRC tilfellene (tabell 2).
Pasient en
En 62 år gammel mann ble diagnostisert med MSS tykktarmskreft, med en 3,5 cm x 3 cm x 1,2 cm svulst. To regioner (P1-1 og P1-2) av primærtumor oppviste en moderat differensiert adenokarsinom, og den patologiske stadium av svulsten var T2N1M0. Pasienten fikk ingen tidligere behandling.
nonsynonymous somatiske punktmutasjoner og indels som fører til protein endringer er oppsummert i S2 tabell. Deres distribusjoner i forskjellige regioner over hele svulsten ble kartlagt (figur 1A). Ved sammenligning av mutasjonen spektra mellom primære områder, fant vi ut at 24% (11/45) av mutasjonene var spesifikke for P1-1, mens 13% (6/45) av mutasjonene var spesifikke for P1-2. De resterende 63% av mutasjonene ble deles av begge regioner. Ved å sammenligne våre resultat med 127 betydelig muterte gener identifisert av Kandoth et al. [17], fant vi ut at P1-1 og P1-2 inneholdt
APC plakater (428_429del),
KIT plakater (A755T),
KMT2C plakater (R909K, C391X, G315S D348N, P309S, og .Y816_I817delinsX),
NCOR1 plakater (S63L),
NRAS plakater (G12D), og
PIK3CG plakater (K344Q) mutasjoner. P1-1 inneholdt syv ekstra mutasjoner, nemlig
APC plakater (Q706X),
KMT2D plakater (3860_3861del),
KMT2C plakater (S338L, K306fs og skjøting stedet mutasjon)
BRCA2 plakater (T3030fs), og
ErbB4
spleising nettstedet mutasjon. P1-2 inneholdt en annen
AR plakater (57_58del) mutasjon.
En genetisk ITH i Pasient 1. Den regionale fordelingen av 45 somatiske varianter i 3 primære tumor regioner (P1-1 og P1-2 ); B Genetisk ITH i Pasient 2. Den regionale fordelingen av 33 somatiske varianter i 3 primære tumor regioner (P2-1, P2-2 og P2-3); C Genetisk ITH i Pasient 3. Den regionale fordelingen av 58 somatiske varianter i 3 primære og 2 metastatiske regioner. Varmen kart indikerer nærværet (grå) eller fravær (mørke blå) av en mutasjon i hver region. De fargefeltene over kartet varmen spesifisere hvilke kategorier av mutasjoner.
Pasient 2
En 60 år gammel kvinne ble diagnostisert med MSS tykktarmskreft, med en 3,8 cm x 3,5 cm x 1,2 cm tumor. Tre regioner (P2-1, P2-2 og P2-3) av primærtumor viste en moderat differensiert histologi og høyre leverlapp metastasering. Flere lymfeknutemetastaser (PN2) ble påvist, og den patologiske stadium av svulsten var T2N4M0. Pasienten fikk ingen tidligere behandling.
For Pasient 2, var rettet resequencing av DNA fra de tre regionene i primærtumor gjennomført. Denne prosessen avslørte 25 nonsynonymous punktmutasjoner og 8 indels (S2 Table). Deres distribusjoner i forskjellige regioner over hele svulsten ble kartlagt (figur 1B) som beskrevet av Gerlinger et al. [5]. Vi skilles de 33 mutasjoner i 23 stedsnærværende mutasjoner (de som presenteres i alle regioner i hvert CRC), 6 private mutasjoner (de som presenteres i én region), og resten kalt delte mutasjoner. I gjennomsnitt én biopsi viste 28 somatiske mutasjoner, sto for 85% av alle mutasjoner observert i denne svulsten. Mutasjons landskap av de ulike regionene var svært like hverandre.
Vi identifiserte flere betydelig muterte gener, inkludert
ATRX plakater (P571A),
CHEK2 plakater (P358S),
KDM6A plakater (A1038T),
NCOR1 plakater (N208K, S63L),
KMT2C plakater (A746S, G892R, P309S, R909K, D348N, og Y816_I817delinsX), og
AR product: (57_59del), som var allestedsnærværende mutasjoner.
TGFBR2 plakater (E125fs) var bestemt til P2-1,
SETD2 plakater (I1608V) mutasjon var bestemt til P2-2,
TP53 plakater (T218P),
KMT2C product: (K339N) var spesifikke for P2-3.
APC plakater (L693fs) og TP53 (R89W) ble delt av P2-2 og P2-3.
NCOR1 plakater (K85N) ble delt av P2-2 og P2-1.
KMT2C plakater (Q755X) deles av P2-1 og P2-3.
Pasient 3
En 71 år gammel kvinne ble diagnostisert med MSS-høy og moderat differensiert tykktarmskreft, med en 9 cm x 5 cm x 3 cm primærtumor og en 1,5 cm x 1 cm x 0,5 cm høyre leverlapp metastasering. Tre regioner (P3-1, P3-2, og P3-3) av de primære kreft og metastatiske to regioner ble resekterte, og den patologiske stadium av svulsten var T3N2M2. Pasienten fikk ingen forutgående behandling. For denne pasienten, var rettet resequencing utført på DNA fra de tre regionene (P3-1, P3-2, og P3-3) av primære tumorer og metastatiske to regioner. Prosessen avdekket 47 nonsynonymous punktmutasjoner og 11 indels (S2 Table). Deres distribusjoner i forskjellige regioner på tvers svulsten ble kartlagt (figur 1C).
Vi konstruerte et fylogenetisk tre (figur 2), som viste et forgrenet, i stedet for en lineær, tumorutvikling, for å representere den evolusjonære historie Barnekonvensjonen. P3-2 mutasjon spektrene var mer lik L1 og L2, som indikerer at opprinnelsen til fjernmetastaser kan spores tilbake til en av de primære områder.
Branch lengder i treet er proporsjonal med antallet av nonsynonymous mutasjoner i de tilsvarende grener.
Totalt mål sekvense identifisert 45 somatiske mutasjoner per biopsi, sto for 78% av alle mutasjoner observert i denne svulsten. 60% av alle mutasjoner oppdaget av multi-region sekvensering i colectomy prøven var allestedsnærværende mutasjoner stede i alle regioner. Når vi analyserte den primære kreft, var det i gjennomsnitt 45 somatiske mutasjoner påvist per biopsi, som utgjorde 87% av alle identifiserte mutasjoner i denne svulsten. For de metastaser, en enkelt biopsi avslørte 92% av alle mutasjoner påvist i denne svulsten.
I de betydelig muterte gener, fant vi ut at
KRAS plakater (G13D),
PIK3CA product: (E545),
TP53
en spleising nettstedet mutasjon,
APC plakater (E854fs),
KMT2C plakater (E141G, K339N, P309S, og Y816_I817delinsX),
SETBP1 product: (Q1558L), og
NCOR1 plakater (S63L) var allestedsnærværende mutasjoner, mens
CDKN2A plakater (D74A),
SMAD4 plakater (W168X),
NCOR1 product: (N208K),
KMT2C plakater (G315C og K306fs) og
INHBA plakater (V58I) var spesifikke for den primære kreft.
PPP2R1A plakater (E370X),
SETD2 plakater (I1608V),
SMAD4 plakater (G382T), og
AR
spleise sete-mutasjoner var bestemt til levermetastatisk kreft . Men disse mutasjonene var fraværende i de primære kreft regionene.
KRAS
,
TP53
, og
PIK3CA
mutasjoner, som har ofte blitt brukt som molekylære biomarkører i CRC, også presentert i alle regionene.
Metastatisk tumorspesifikke mutasjoner
Ved å sammenligne mutasjon landskapet mellom primære og metastatiske regioner, vi har oppdaget at flere mutasjoner var spesifikke for metastatiske regioner. SMAD4 er en nøkkel transduser av transformerende vekstfaktor-β supersignalering, som regulerer celleproliferering, differensiering og apoptose [18]. Tap av Smad4 er korrelert med CRC metastase [19-21]. I mellomtiden hører AR til en familie av nukleære reseptorer som fungerer som transkripsjonsfaktorer. AR har vist seg å regulere cellemigrering ved å undertrykke nukleær faktor kappa B /matrise metallopeptidase 9 reaksjonsvei og videre inhibering av leverkreft metastase [22, 23]. AR spleisevarianter er kjent for å fremme tumormetastase [24].
PPP2R1A
-genet koder for det strukturelle subenhet av PP2A-enzym, som er et sterkt konservert serin /treonin-fosfataser som betjener et bredt spekter av biologiske roller, herunder den negative regulering av signal transduksjon, cellesyklusprogresjon [25] og genekspresjon. PPP2R1A forenkler tumorcelle-lymfatisk endotelcelle interaksjoner under melanom celle metastase [26].
Diskusjoner
Den multi-regionen mutasjon landskapsanalyse av de tre CRC svulster gitt betydelige bevis for ITH, med Graden av ITH varierende mellom de tre tilfellene. I Pasient 1, sekvensert vi to romlig atskilte områder av primær kreft. Deres mutasjons spektra viste en 63% overlapping. I Pasient 2, en enkelt biopsi viste 28 somatiske mutasjoner i gjennomsnitt, sto for 85% av alle mutasjoner observert i denne svulsten. I motsetning til dette, i Pasient 3, ble det observert 78% av alle mutasjoner i denne tumor. Av alle de somatiske mutasjoner avslørt av multi-region sekvensering, 30% til 40% var heterogene og dermed ikke kan påvises i hver sekvensert regionen. Kim et al. [8] fastslått at 46% -80% av mutasjonene var umulig å oppdage på tvers av alle de regionale biopsier i sin årsklasse. Nivået av genetisk ITH i sine prøver var høyere enn det i våre. Sekvenserings Resultatene av de primære kreft pasienter 1 og 2 var mer lik hverandre enn de av prøvene fra den nevnte studien. Disse funnene antyder at enkelte kreft biopsier ikke nøyaktig kan representere en svulst er genomisk mutasjons landskapet, som i betydelig grad påvirker målrettet terapi.
Vi bygget et fylogenetisk tre ved hjelp av data fra pasient 3. Treet indikerte at CRC utviklet seg i en forgrenet , i stedet for en lineær, måte. Det forgrenede evolusjon modellen har blitt validert i flere typer kreft [27], inkludert CRC [8]. Tradisjonelt er CRC anses å utvikle seg på en lineær måte [28]. Nyere studier viser at både evolusjon modeller finnes i CRC [29].
Forgrenet svulst evolusjon understreker nødvendigheten av å målrette mutasjoner som ligger i hoved stammen av fylogenetisk tre. Vi fastslått at
KMT2C Hotell og
NCOR1 plakater (S63L) ble mutert i alle regioner sammenlignet med betydelig muterte gener rapportert av Kandoth et al. [17]. KMT2C er medlem av den menneskelige trithorax /blandet avstamning leukemi familie [30] og er involvert i histone modifikasjon.
KMT2C
ofte endret på mange typer kreft, inkludert leverkreft [31], kutant plateepitelkarsinom [32], og esophageal plateepitelkreft [33]. I vår forskning, fant vi ut at hver pasient har minst syv mutasjoner i
KMT2C
, den kliniske betydningen av dette gjenstår å få den godkjent. Vi har også observert en
NCOR1
missense mutasjon. NCOR1 er en 270 k nukleær reseptor corepressor [34] som deltar i ligand-avhengig transkripsjonen undertrykkelse av østrogen reseptor-α [35].
KMT2C Hotell og
NCOR1
kan representere to mulige målrettbare gener i innstillingen av heterogenitet.
KRAS
,
TP53
, og
PIK3CA
er de betydelig muterte gener i CRC [36]. Men bare Pasient 3 hadde disse mutasjoner i vår kohort. Disse mutasjonene ble identifisert i alle regioner innhentet fra pasienten og viste høy samsvar mellom matchet primære og metastatisk CRC. Dette resultatet er i samsvar med at av Brannon et al. [37]. Den primære kreft mutasjon spektra nøyaktig representerer de av metastatiske lesjoner i form av tilgjengelige spådd CRC biomarkører.
PPP2R1A plakater (E370X),
SETD2 plakater (I1608V),
SMAD4 plakater (G382T), og
AR
spleise sete-mutasjoner ble bestemt å være potensielle metastatiske tumorspesifikke mutasjoner. Vi antar at disse mutasjonene kan kjøre CRC metastaser. Gitt den begrensede utvalgsstørrelsen, må frekvensen av disse mutasjonene i CRC metastaser vurderes i en større kohort. Videre funksjonelle studier er nødvendig for å løse sine roller i CRC metastaser.
Genomisk analyse fra enkelt nålbiopsier kan undervurdere mutasjons landskapet av heterogene svulster. ITH kan delvis forklare den dårlige validering av CRC biomarkører grunn av sampling bias. Rekonstruere svulst klonal struktur og identifisere de allestedsnærværende endringer som ligger i bagasjerommet på det fylogenetiske treet kan bidra til oppdagelsen av mer effektive biomarkører og terapeutiske tilnærminger.
I konklusjonen, identifiserte vi den betydelige graden av ITH i CRC. I sammenheng med dette fenomenet, fant vi ut at CRC utviklet seg i en forgrenet måte, og flere molekylære hendelser kan bidra til CRC progresjon. Vi undersøkte bare tre tilfeller på grunn av økonomiske begrensninger. Videre studier med store utvalgsstørrelsene bør gjennomføres for å bekrefte disse funnene.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. OncoGxOneTMPlus kreft genet liste
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152673.s001 product: (PDF)
S2 Table. Genetiske endringer per pasient
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152673.s002 plakater (XLSX)
