Abstract
multiresistens er fortsatt et stort hinder for effektiv kjemoterapi av tykktarmskreft. ABCG2, som en halv-transportør av den G familien av ATP-bindende kassett transportør gener (ABC-transportører), er kjent for å spille en avgjørende rolle i multimedikamentresistens. Men den molekylære mekanismen for å kontrollere ABCG2 uttrykk i legemiddelresistens av tykktarmskreft er uklart og knapt rapportert. I denne studien undersøker vi systematisk potensialet rolle c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) signal veien i ABCG2-indusert multiresistens i tykktarmskreft. I hydroksycamptothecin (HCPT) resistente cellelinje SW1116 /HCPT fra human tykktarmskreft cellelinje SW1116, er ABCG2 den viktigste faktoren for multiresistens, annet enn godt studert ABCB1 eller ABCC1. Våre funn tyder på at blokkering av JNK veien ved pathway inhibitor SP600125 reduserer uttrykket nivå og transport funksjon av ABCG2 i narkotika-resistente celler SW116 /HCPT. Spesielt de eksperimenter av små interfererende RNA rettet mot JNK1 og JNK2 viser at bare stillhet JNK1 genet har lik effekt som SP600125 på defosforylering av transkripsjonsfaktoren c-Jun og uttrykk for ABCG2 protein, mens de tilsvarende fenomener ikke ble observert etter stillhet av JNK2 genet. I mellomtiden, induserer SP600125 den apoptose av SW116 /HCPT celler ved å fremme spaltning av PARP og undertrykke den anti-apoptotiske protein Survivin og bcl-2, og øker følsomheten av SW1116 /HCPT til HCPT. Til sammen vårt arbeid viste at JNK1 c-jun /signalveien var involvert i ABCG2-mediert multiresistens i tykktarm kreft celler. Definitivt, hemming av JNK1 /c-jun veien er nyttig for å reversere ABCG2-mediert legemiddelresistens i HCPT-resistente tykktarmskreftceller
Citation. Zhu MM, Tong JL, Xu Q, Nie F, Xu XT Xiao SD, et al. (2012) Økt JNK1 signalveien er ansvarlig for ABCG2-mediert multiresistens i Human tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (8): e41763. doi: 10,1371 /journal.pone.0041763
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 12 januar 2012; Godkjent: 28 juni 2012; Publisert: 01.08.2012
Copyright: © Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 30770964, https://159.226.244.22/portal/proj_search.asp) og Key laboratorium Program of Science and Technology Commission av Shanghai kommune (No. 06DZ22027, http: //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
multiresistens, der cellene motstå mange strukturelt og funksjonelt ubeslektede narkotika, er et stort hinder for effektiv kjemoterapi for kreft. Når det gjelder mekanismene for multimedikamentresistens, er det viktigste at akkumulering av medikament i cellene reduseres med redusert innover transport eller økt utstrømning medikament, for eksempel overekspresjon av adenosintrifosfat (ATP) -binding kassett (ABC) transportører [1]. Naturligvis har dypt forståelse molekylære mekanismen for transporter uttrykk tilt intenst konsentrasjon for mer vellykkede terapeutiske protokoller underliggende resistens.
I det menneskelige genom, har 48 ulike ABC-tilhengere blitt identifisert og delt inn i syv underfamilier (AG) basert på sekvenslikhets [2]. ABCG2, som en halv transportør medlem av ABCG underfamilien, er et 655 aminosyre protein som inneholder en ATP-bindende domene og transmembranområdene seks [3]. ABCG2 er opprinnelig identifisert i anticancer-medikament-resistente humane kreftcellelinjer av in vitro-seleksjon [4] – [6]. Så vel som til den godt studert multimedikamentresistent protein P-glykoprotein (ABCB1), overekspresjon av ABCG2 resultater i kreftceller resistente mot forskjellige kjemoterapeutiske medikamenter ved ekstrudering av disse forbindelser ut av cellene, for eksempel topotekan og metotreksat [7], [ ,,,0],8]. I vår tidligere forskning, både genet chip og real-time PCR-resultater basert på SW1116 /HCPT celler indikerte at uttrykket av ABCG2 økt betydelig i kontrast med foreldre SW1116 celler [9]. Nærmere bestemt mRNA ekspresjon av ABCG2 i SW1116 /HCPT cellene forsterkes mer enn 200 ganger i kontrast med foreldrecellene SW1116, mens andre transportører som ABCB1, ABCC2, ABCC3 og ABCC6, økte bare 0,5 til 1,0 ganger. Resultatene antydet at ABCG2 bør spille en viktig rolle i motstanden av SW1116 /HCPT celler til hydroksycamptothecin (HCPT), en inhibitor av topoisomerase I og mindre toksisk enn camptothecin. Det er imidlertid ikke klart og ubesvart den molekylære mekanisme av ABCG2 ekspresjon og regulering i medikamentresistens.
Bortsett fra overekspresjon i multiresistente cancerceller, ABCG2 er også mye uttrykkes i en rekke normale vev, inkludert i epitelet av tynntarmen, leveren canalicular membranen og kanaler og lobules av brystkreft [10]. Dessuten, spiller ABCG2 en viktig rolle i opprettholdelsen av stamcelle-fenotypen korrelerer med dårlig prognose av kjemoterapi [11]. Initial karakterisering av ABCG2 arrangøren avslører at det er TATA-mindre med flere aktivator protein 1 (AP1) bindingsseter [12].
C-Jun NH2-terminal kinase (JNK) er et medlem av mitogen aktivert protein kinase familien som binder den NH2-terminale aktiveringsdomenet av transkripsjonsfaktoren c-Jun som et viktig medlem av familien AP1. Aktiviteten av JNK har vært implisert i regulering av celleproliferasjon, apoptose og tumor transformasjon. Viktigere er det tidligere rapporter viste at modulering av JNK-aktivering kan være en ny fremgangsmåte for å reversere multimedikamentresistens, gjennom regulering ekspresjonsnivået av flermedisinresistens protein, slik som P-glykoprotein (ABCB1) og MRP1 (ABCC1) [13] – [16 ]. Imidlertid er forholdet av JNK-aktivering og ABCG2 ekspresjon nesten ikke studert, særlig i colon cancerceller. Nylig ble det rapportert at kreftceller med ABCG2-overekspresjon hadde tydelig endring i endogen JNK-aktivitet [17], [18]. Og forskjellige topoisomerase-inhibitorer ble funnet å aktivere JNK og å indusere celle apoptose [19] – [21]. Med disse tankene, fokuserte vi på uttrykket sammenhengen mellom ABCG2 og involvering av JNK /c-Jun i HCPT bestandig tykktarmskreft celleunderlinjen SW1116 /HCPT. Nedenfor er resultatene av våre studier viser at inhibering av JNK-reaksjonsveien er i stand til å ned-regulere ABCG2 og JNK-reaksjonsveien kan bli utnyttet for å overvinne ABCG2-mediert resistens mot flere legemidler i tykktarmskreft.
Materialer og Metoder
Material
RPMI1640 kulturmedium og kvegfosterserum (FBS) ble kjøpt fra GIBCO Livet Technology (Gibco, GrandIsland, New York). MTT [3- (4, 5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid], dimetylsulfoksyd (DMSO), BSA, fumitremorgin C (FTC), Hoechst33342, propidiumjodid (PI) og SP600125 var kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). HCPT ble kjøpt fra Tiancheng Pharmaceutical Co. (Changchun, Kina). Antistoffer spesifikke for kanin JNK, P-JNK (Thr183 /tyr185), c-Jun, P-c-Jun (Ser63), survivin, BCL-2, PARP ble hentet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Mouse monoklonalt antistoff mot ABCG2 ble kjøpt fra Santa Cruz (CA, USA). Kanin polyklonalt antistoff mot GAPDH, anti-kanin-IgG, anti-muse-IgG ble oppnådd fra Kangcheng Biotechnology (Shanghai, Kina). SP600125 ble oppløst i DMSO.
Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje SW1116 (hentet fra Academy of Military Medical Science, Shanghai, Kina) og dens HCPT fast underlinjen SW1116 /HCPT ( etablert og opprettholdt i vårt laboratorium) [9], [22], [23], ble dyrket i kolber med RPMI1640 supplementert med 10% varme-inaktivert FBS, 2 mmol /l L-glutamin, 100 U /ml penicillin, og 100 U /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. SW1116 /HCPT celler ble etablert ved å øke konsentrasjonen gradient av HCPT på en trinnvis måte og viste 120.0-, 48.2- og 2,1-gangers resistens overfor HCPT, adriamycin og oxymatrine sammenlignet med deres tilsvarende parentale celler, respektivt. SW1116 /HCPT celler ble holdt i dyrkningsmediet som allerede er beskrevet, og i nærvær av 100 ug /l HCPT og inkubert i medikamentfritt medium i minst en uke før bruk.
Lie Interference RNA (siRNA) for JNK1 og JNK2
Spesifikk JNK1 /2 siRNA (JNK1: GACCAUUUCAGAAUCAGACUU; JNK2: GAUGCUAACU UAUGUCAGGUU) ble utformet i henhold til cDNA sekvens av JNK1 /2 [24]. Den negative kontroll siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) kodede sekvenser av styre siRNA har ingen vesentlige homologization med human- og mus-cDNA. SiRNA ble syntetisert ved GenePharma selskap (Shanghai, Kina). SW1116 og SW1116 /HCPT celler ble transfektert med 100 nM siRNA i 48 timer ved hjelp Lipofectamine ™ 2000 Transfeksjon Reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter siRNA transfeksjon med JNK1 /2 siRNA ble JNK1 /2 protein uttrykk nivåer oppdaget av Western blot.
semikvantitativ Reverse Transcription-PCR av ABCG2
Celler ble behandlet med enten 20 mikrometer SP600125 eller 100 nM JNK1 /2 siRNA, og total RNA ble deretter ekstrahert ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, San Diego, CA) ifølge produsentens instruksjoner. RNA renhet og utbytte ble bestemt ved spektrofotometrisk analyse. cDNA-syntese ble utført ved anvendelse av RNA LA PCR-sett (Takara, Tokyo, Japan). Real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn PCR Master Mix og en ABI-7300H Sequence Detection System (Applied Biosystems). Alle forsøk ble utført in triplo og normalisert til den interne referanse-genet glycer-aldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). Relativ mRNA uttrykk ble beregnet ved hjelp av to
(- Delta CT) metode som beskrevet tidligere [25], hvor CT (syklus teller) er grensesyklus verdi
Western Blot analyse
Hele cellelysat ekstrakter ble fremstilt, og proteinkonsentrasjoner ble målt ved BCA protein Assay Reagent (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL). Proteinekstrakter (30 ug /felt) ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Etter elektroforese ble proteinet overført til en polyvinylidendifluorid-membran (Millipore, Bedford, MA). Membranene ble blokkert i en time i Tris-buffret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween 20 og 5% ikke-fett tørrmelk og deretter inkubert med primære antistoffer ved 4? over natten og deretter pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur, henholdsvis. Spesifikke proteiner ble visualisert med ECL Western blotting system i henhold til produsentens instruksjoner (Pierce Bioteknologi). For å sikre lik protein lasting, ble membranen undersøkt med et monoklonalt antistoff spesifikt for GAPDH.
utstrømning analysen
Den kjente substrat for ABCG2, ble Hoechst 33342 valgt å evaluere utstrømming analysen av ABCG2. SW1116 og SW1116 /HCPT celler ble inkubert med Hoechst 33342, og andelen av celler som ekskluderer Hoechst 33342 ble evaluert av MoFlo (DakoCytomation, Fort Collins, CO, USA) [26]. Den spesifikke inhibitor av ABCG2, fumitremorgin C (FTC), ble anvendt som den positive kontroll [27]. I korthet ble cellene inkubert (10 * 6 celler /ml) i forvarmet RPMI 1640 (supplert med 10% FBS) inneholdende 5 ug /ml Hoechst 33342 ved 37 ° C i 90 minutter med periodevis rysting. Kontrollcellene ble inkubert i nærvær av 10 uM av FTC i 30 minutter. Etter inkubering ble cellene deretter vasket i iskald PBS og resuspendert i kald PBS inneholdende 1 mg /ml PI å merke døde celler for flowcytometrisk analyse. Bare hendelser fra levedyktige celler ble anvendt for dataanalyser. Den Hoechst 33342 fargestoff ble eksitert ved 355 nm, og utslipps fluorescens ble påvist ved hjelp av 450 nm og 675 nm filter systemer. Alle data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, OR, USA).
Cell Proliferation og levedyktighet Analyser
Virkningene på celleproliferasjon ble evaluert ved hjelp av MTT analysen. Forskjellige konsentrasjoner av legemidler ble anvendt, i området fra 0,1 mg /L til 0,8 mg /L av HCPT for SW1116 celler, og 0,1 mg /L til 62,5 mg /L av HCPT for SW1116 /HCPT celler. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners mikrotiterplater ved en initial densitet på 3 x 10
3 celler /brønn. Etter inkubasjon i 24 timer ble cellene inkubert med 20 mikrometer SP600125, serielle fortynninger av HCPT og forbindelsen med SP600125 og HCPT for utpekte perioder (24 eller 48 timer), henholdsvis. For siRNA transfeksjon eksperimenter ble celler transfektert med 100 nM siRNA, inkludert ingen siRNA, negativ siRNA og siRNA rettet mot JNK1 og JNK2. Etter transfeksjon av 12 timer, ble forskjellige konsentrasjoner av HCPT tilsatt. Analyser ble utført ved 24 og 48 timer etter transfeksjon i henhold til produsentens protokoller. Tyve mikroliter av MTT-løsning (1 mg /ml) og tilsatt til hver brønn, og etter 4 timer ble 150 ul DMSO tilsatt til hver brønn og inkubert i 10 minutter. Absorbans ble målt med en mikroplateleser ved 570 nm. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
apoptose analysen
Apoptose ble bestemt ved flowcytometri analyse ved hjelp annexin-V FITC og PI dobbel farging analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Jingmei, Shenzhen, Kina) som beskrevet tidligere. I korthet, etter behandling, ble både flytende og trypsinert adherente celler høstet og resuspendert til tetthet på 1 x 10
6 celler /ml i 200 ul bindingsbuffer inneholdende 5 ul av annexin-V fluorescein-isotiocyanat og 5 ul av PI, deretter inkubert i 10 minutter i mørket ved romtemperatur. Analyse ble umiddelbart utført ved hjelp strømningscytometer.
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 programvare (SPSS, Chicago, IL). Kontinuerlige data ble presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) i minst tre gjentatt enkelte forsøk for hver gruppe. Statistiske forskjeller ble bestemt ved hjelp av ANOVA og t-test for uavhengige utvalg. En verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Resistente cellelinjer Present økt uttrykk av ABCG2 og høyere aktivitet av JNK /c-jun Pathway
Blant mange ulike mekanismer for å tolke utviklingen av multiresistens fenotype i kreftceller, den mest omfattende studert ene er basert på ABC transportører. vises HCPT fast underlinjen SW1116 /HCPT som ble valgt fra SW1116 cellelinje med økende konsentrasjoner av HCPT multiresistens fenotype av deres brede kryssresistens og defekter i intracellulær akkumulering av legemidlet.
I fig. 1A, SW1116 /HCPT vises åpenbart overekspresjon av ABCG2, mens nesten ingen ABCG2 uttrykk ble observert i foreldrecellelinjer SW1116. Mens andre transportører som ABCB1, ABCC2, ABCC3 og ABCC6, økte bare 0,5-1,0 ganger. Det indikerte at for multiresistent fenotype ble hovedsakelig mediert av økt uttrykk av ABCG2. Videre ble det nivå og aktivitet av JNK veien i SW1116 /HCPT undersøkt etter at cellene ble sluppet til rusfritt medium i 7 dager. Selvfølgelig, aktiviteten av JNK og transkripsjonsfaktor c-jun økte markert i SW1116 /HCPT enn i foreldrelinjene (Fig. 1B).
mRNA uttrykk for ABCB1, ABCC1-6, ABCG2 i SW1116 og SW1116 /HCPT celler ble målt ved real-time PCR. B. SW1116 og SW1116 /HCPT cellene ble høstet for å forberede cellelysatene. Lysatene ble underkastet SDS-PAGE og blottet med antistoffer. Nivåer av ABCG2, fosforylert JNK (P-JNK), total JNK, fosforylert c-jun (Pc-juni) og total c-jun ble oppdaget.
SP600125 og siRNA JNK1 hemme Aktivering av JNK /c-juni pathway
SP600125, som en hemmer av JNK vei, redusert P-JNK og Pc-jun uttrykk markert uten å endre total JNK og c-jun uttrykk (fig. 2A). Den små interfererende RNA (siRNAs) teknologi gir en kraftig tilnærming til målrettet behandling av kreft. Som tidligere rapportert, kan ulike JNK isoformer har forskjellige funksjoner. I vårt tilfelle ble den lille interfereing RNA målretting JNK1 og JNK2 som ble ubiquitously produsert valgt å blokkere JNK1 /2 signalveien i SW1116 /HCPT celler. Western blot analyse viste at proteinnivået JNK1 og JNK2 redusert 72,3% og 78,4% etter JNK1 /2 siRNA transfeksjon, sammenlignet med kontrollgruppene. Og delvis stillhet JNK1 resulterte i en betydelig nedgang i aktiviteten til P-JNK1 og P c-jun-. Imidlertid delvis stillhet av JNK2 bare redusert fosforylering av JNK2, men ikke fosforylering av c-Jun (Fig. 2B).
SW1116 /HCPT celler eksponert for DMSO og SP600125 ved konsentrasjoner 20 uM i 24 og 48 timer, med medium erstatning hver 24. time. Deretter uttrykk for fosfor-JNK /JNK og fosfor-c-jun /c-jun ble målt ved Western blot. B. SW1116 /HCPT-celler ble transfektert med kontroll med siRNA, siRNA JNK1 eller siRNA JNK2 i 48 timer, deretter ekspresjon av fosfo-JNK /JNK og fosfo-c-jun /c-Jun proteinnivåer ble målt ved Western blot.
hemming av JNK1 /c-jun pathway nedregulerer ABCG2 Expression nivå
for å undersøke om ABCG2 ble nedregulert ved å hemme JNK veien på mRNA-nivå, ABCG2 mRNA uttrykk ved semikvantitativ RT-PCR ble analysert. Ved behandling med 20 uM SP600125 i 24 eller 48 timer i fig. 3A, ble det observert at ABCG2 mRNA-ekspresjon i SW1116 /HCPT celler til å bli redusert omtrent 45,42% og 67,83%, henholdsvis. Videre ble den undertrykkende virkning av transfeksjon av JNK1 /2 siRNA undersøkt. Spesielt, stillhet JNK1 viste en sterkere effekt på nedregulere ABCG2 mRNA uttrykk enn stillhet JNK2 (Fig. 3B). De ABCG2 protein ekspresjonsnivåer ble deretter bestemt ved Western blot-analyse. Som vist på fig. 3C, SP600125 behandling i 48 timer undertrykkes ABCG2 proteinekspresjon 54,29%, noe som indikerer at inhibering av JNK-reaksjonsveien kan ned-regulere ABCG2 proteinekspresjon. Interessant, sammenlignet med signifikant effekt på nedregulere ABCG2 protein uttrykk som stillhet JNK1, var det ingen tydelig effekt for stillhet JNK2 (Fig. 3D).
Sanntids-PCR analyse av ABCG2 genuttrykk i SW1116 /HCPT celler ved behandling uten eller med over et tidsforløp SP600125 og JNK1 /2 siRNA. *,
P
0,05, **,
P
0,01. C og D. uttrykk for ABCG2 protein ble oppdaget av Western-blot analyse etter SP600125 og JNK1 /2 siRNA behandling.
Hemming av JNK1 /c-jun Pathway Hemmer utstrømningen analysen av ABCG2
Våre resultater påpekt SP600125 og JNK1 siRNA var i stand til å nedregulere den ABCG2 uttrykk i SW1116 /HCPT celler, så neste vi bestemte oss for å evaluere effekten av hemming av JNK veien på ABCG2 utstrømming. For dette formål ble Hoechst 33342 bestemt som et mål på ABCG2 ekspresjon /funksjon ved strømningscytometri. Den kjente ABCG2 inhibitor, FTC, ble anvendt som en positiv kontroll. Vi fant at SW1116 /HCPT celler, som overuttrykt ABCG2-genet, inneholdt svært lave nivåer av Hoechst 33342 opptaket i motsetning til moder SW1116 celler. Etter behandling med SP600125 i 48 timer, Hoechst 33342 opptaket markert økt i SW1116 /HCPT celler. Mens bare 1,9% av SW1116 /HCPT celler fortrinnsvis akkumulert Hoechst 33342, denne forbedrede til 21,1% etter behandling med SP600125 (fig. 4A). Hoechst 33342 akkumulering ble også vurdert i SW1116 /HCPT celler etter siRNA transfeksjon med JNK1 /2 siRNA i 48 timer. Som vist på fig. 4B, JNK1 siRNA transfeksjon induserte en økning i andelen av celler som akkumuleres Hoechst 33342 (fra 1,1% til 12,5%), mens det ikke var noen tydelig endring av Hoechst 33342 opphopning av taushet av JNK2 genet. Oppsummert flowcytometrisk analyse basert på Hoechst 33342 indikert hemming av JNK1 veien kunne ned-regulere uttrykk og transportaktiviteten av ABCG2.
Den intracellulære fluorescens av Hoechst 33342 ble analysert ved strømningscytometer i SW1116 celler og SW1116 /HCPT celler behandlet med eller uten SP600125. FTC som den positive kontrollen ble inkubert i 30 min. B. Hoechst 33342 ble påvist i SW1116 /HCPT celler etter transfeksjon med JNK1 eller JNK2 siRNA i 48 timer. Box er Hoechst33342 flekker bestandig området.
Hemming av JNK1 /c-jun Pathway fører til høyere apoptoseinduksjon i Resistente cellelinjer
For å oppdage rollen som JNK /c -jun pathway i overlevelse av multilegemiddelresistente cellelinjer, apoptoseinduksjon etter SP600125 behandling eller JNK1 /2 siRNA transfeksjon ble analysert ved strømningscytometri-analyse. Den totale apoptotiske sats etter SP600125 behandlings 48 timer var 9,26% for foreldre SW1116 celler, mens 14,95% for SW1116 /HCPT celler (
P
0,01). I tillegg SP600125 og stillheten JNK1 genet kunne synergi øke apoptose indusert av HCPT, i stedet for stillhet JNK2 genet. Sammenlignet med kontrollcellene (0,1% DMSO og HCPT), var det signifikant flere apoptotiske celler i SP600125 behandlingsgruppe (SP600125 og HCPT) i SW1116 /HCPT celler (60,63% sammenlignet med 29,45%), men ikke i SW1116-celler (30,87% vs. 29,45%) (fig. 5A). I SW1116 /HCPT celler, JNK1 siRNA transfeksjon synergistisk forbedret apoptose som indusert av HCPT, sammenlignet med den tilsvarende ikke-spesifikk transfeksjon med siRNA (29,97% mot 17,04%), mens JNK2 ikke har noen bemerkning effekt på forbedring av den apoptotiske rate (15,35% VS. 17,04%) (fig. 5B). PARP cleavage som en viktig begivenhet av apoptose og survivin, BCL-2 som markører for å blokkere apoptose og regulateing celledeling, ble utført av Western blot analyse. Resultatet viste at SP600125 kunne hemme uttrykket av survivin og BCL-2 og indusere spalting av PARP i motstandsdyktig SW1116 /HCPT celler (Fig. 5C). Således inhibering av JNK-reaksjonsveien induserte apoptose av SW1116 /HCPT celler ved å regulere ekspresjonen av apoptose-relatert protein.
apoptotisk rater SW1116 og SW1116 /HCPT celler behandlet med den angitte konsentrasjon av HCPT, med eller uten SP600125 i 48 timer, ble analysert ved hjelp av strømningscytometri-analyse etter farging med Annexin V /PI. B. apoptotisk priser av SW1116 /HCPT celler behandlet med kombinasjon av JNK1 /2 siRNA og HCPT, ble analysert. C. Effekten av SP600125 på apoptose regulator proteiner i SW1116 /HCPT celler ble målt ved Western-blot analyse.
Hemming av JNK1 /c-jun Pathway øker følsomheten av SW1116 /HCPT Cells til kreft narkotika
effektene av SP600125 og JNK1 siRNA på ABCG2 proteinnivå og på akkumulering av Hoechst 33342 antydet at JNK1 passivitet kan være i stand til å bevisstgjøre de SW1116 /HCPT celler til HCPT. Vi vurderte derfor ytterligere effekt av JNK-signal-inhibitorer i kombinasjon med HCPT. MTT-analysen viste at SP600125 kan redusere IC50-verdiene av HCPT i SW1116 /HCPT celler. På fig. 6A, etter kombinasjonsbehandling med SP600125 i 48 timer, IC50-verdier på HCPT ble redusert med 7-fold, fra 2,41 mg /l til 0,328 mg /l i SW1116 /HCPT celler og fra 0,154 mg /l til 0,142 mg /L i SW1116 celler. Tilsvarende JNK1 siRNA transfeksjon også sterkt øket følsomheten for SW1116 /HCPT celler til HCPT ved 7-fold, fra 2,27 mg /l til 0,310 mg /l, mens JNK2 siRNA transfeksjon øket motstand av SW1116 /HCPT celler til HCPT (IC50 fra 2,27 mg /l til 4,271 mg /l) på den motsatte (fig. 6B).
SW1116 og SW1116 /HCPT-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av HCPT, med eller uten SP600125, i 48 timer . Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Prosenten av levedyktige celler ble bestemt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. B. Celleviabilitet av SW1116 /HCPT celler ble bestemt ved MTT-analyse etter behandling med JNK1, JNK2, eller JNK1 og JNK2 siRNAs.
Diskusjoner
Den effektive kjemoterapi er sterkt begrenset av multiresistens for pasienter som lider av ondartede svulster, inkludert metastatisk kolorektal kreft. ABCG2 er en integrert membranprotein som et medikament efflukspumpen og er ansvarlig for «side befolkning» fenotype av stamceller og ser ut til å spille en betydelig rolle i beskyttelse mot hypoksi [28], [29]. Overekspresjon av ABCG2 kan resultere i oppkjøp av multiresistens til flere kreft narkotika [7], [8]. Egentlig vår Resultatet viste at konstitutiv overekspresjon av ABCG2 i multiresistent tykktarmskreftceller SW1116 /HCPT resulterte i stor motstand mot cellegifter, selv om de underliggende molekylære mekanismene forble ukjent i detalj. Dermed strategien for å reversere multimedikamentresistent fenotype basert på hemming av ABCG2 uttrykk eller dets transporter funksjon ved å styrke intracellulær akkumulering av kreftmedisiner fortjener en omfattende og dypt etterforskning.
JNK aktiveres av proinflammatoriske cytokiner, miljømessige stress ( f.eks, hypoksi, UV og g-stråling, varmesjokk, redox-stress, etc.) eller flere cytotoksiske legemidler. Dens aktivisering bidrar generelt til formidling av viktige cellulære hendelser. Aktiviteten av JNK har vært implisert i regulering av embryonisk morfogenese, celleproliferasjon, tumor transformasjon, og apoptose [30] – [33]. De fleste tidligere rapporter har identifisert de pro- eller anti-apoptose funksjoner av JNK, avhengig av celletype, dosering av stimulus eller varighet av behandling og aktivitetene til andre cellulære signalveier [34] – [38]. Men det er så langt ingen konsensus om sammenhengene mellom JNK sti og uttrykk for transportører. Nesten alle tidligere studier var fokus på P-glykoprotein-mediert multiresistens [15], [39], [40], men forholdet mellom JNK signalspredningsveier og ABCG2 transportører ikke er rapportert i tykktarm kreft celler.
i dette arbeidet ble virkningen av JNK veien på ABCG2 uttrykk /aktivitet og de implikasjoner på multiresistens mediert av disse transport dypt og systematisk undersøkt. Tre JNK gener er identifisert: JNK1, JNK2 og JNK3. JNK1 og JNK2 er allestedsnærværende uttrykt, mens JNK3 er hovedsakelig uttrykt i hjerne, testikler og hjerte [41]. Så rollene som enten JNK1 eller JNK2 i programmet av multiresistens ble alle undersøkt i denne studien.
SP600125 er en selektiv hemmer av JNK /c-jun signalveien, som kan vise 20 ganger høyere spesifisitet for JNK1 kinase i forhold til andre kinaser [42]. Viktigere, ble rollen som SP600125 på å reversere ABCG2-mediert multiresistens av SW1116 /HCPT celler observert i vårt eksperiment. Som vist på fig. 1B, fosforylering av JNKs ble økt i SW1116 /HCPT celler. I mellomtiden, c-jun aktivitet var betydelig svekket ved SP600125 eller etter transfeksjon med JNK1 siRNA i fig. 2. Vi fant også at hemming av JNK av SP600125 markert redusert mRNA nivå, protein nivå og transport aktivitet av ABCG2 i SW1116 /HCPT celler.
For å diskriminere effekten av JNK1 /2 signalveien på ABCG2 transporter, mer sammenligningsforsøk ble utført. Som forventet, blokaden av JNK1 aktivitet ved hjelp JNK1 siRNA ned regulert ekspresjon av transportproteinet ABCG2 og levedyktigheten til SW1116 /HCPT celler som gjorde SP600125, men ikke blokade av JNK2 aktivitet. Selv om mRNA uttrykk for ABCG2 ble redusert etter delvis stillhet JNK2, protein uttrykk var enda forhøyet. De aktuelle data indikerte at bare JNK1 vei forfremmet motstand mot HCPT og positivt regulerer ABCG2 protein uttrykk i multidrug resistente celler, men ikke JNK2 veien. Som tidligere rapportert, aktivering av JNK-reaksjonsveien er positivt korrelert med aktivering av transkripsjonsfaktor, c-juni I vårt tilfelle har vi også funnet at fosforylering av JNK1 og aktiviteten til transkripsjonsfaktoren c-Jun var de viktigste faktorene til overekspresjon av ABCG2 genet i resistente celler SW1116 /HCPT. Vi trodde at c-jun, som ett medlem av AP-1, er sannsynlig å spille rollen ved å påvirke på AP1 bindende områder av ABCG2 promoter.
PARP er et DNA-reparasjon enzymet aktiveres av DNA-skader og spalting av PARP har vært mye brukt som en biokjemisk markør for apoptose [43]. Dermed vi videre studert PARP nivåer i SW1116 /HCPT celler etter eksponering for SP600125 og stillhet JNK1 eller JNK2 genet. Western blot analyse viste at intensiteten av 89 kDa spalting av PARP bånd ble øket i celler behandlet med SP600125, i mellomtiden den bcl-2 og Survivin, som anti-apoptose-protein, ble redusert etter den lik behandling. Disse resultatene antydet at inhibering av JNK1 pathway effektivt forårsaket celledød gjennom induksjon av apoptose i celler multiresistens.
Nylig har flere bevis tyder på at anticancermedikamenter aktivere flere signalveier, hvorav noen er knyttet til utviklingen av legemiddelresistens av tumorceller [40], [44]. Som ovenfor nevnt i vårt tilfelle, kan inkubasjon med HCPT i 24 timer også indusere JNK-fosforylering i SW1116 celler, er dette resultatet støttes av forrige rapport at JNK ble fortrinnsvis aktiveres av HCPT i andre cellelinjer [21]. Alle disse resultatene tyder på at det JNK1 /c-jun signalvei er involvert i ekspresjon av genet ABCG2 i kolon kreftceller, og kan bidra til chemoresistance.
Som konklusjon, vi demonstrert at JNK1 /c-jun pathway er involvert i multiresistens for tykktarmskreftceller. Som SW1116 /HCPT celler presenteres høyere JNK /c-jun aktivitet enn SW1116 cellene, hemming av denne veien førte til mindre ABCG2 uttrykk og høyere apoptoseinduksjon i resistente celler. I tillegg korrelerer JNK1 /c-jun inhibering med nedregulering av Survivin og bcl-2 og PARP-spaltning. Videre undersøkelser med andre tumormodeller samt
in vivo
studier bidrar til å forstå rollen som JNK1 /c-jun veien i multiresistens. Selv om de ulike rollene JNK isoformer fortsatt uklare i detaljer til nå, er det ingen tvil om at JNK1 c-jun /signalkaskade bør vurderes som et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon i vår forskning.
