Abstract
Vi beskriver vellykket bruk av en ny tilnærming for å generere dimeriske myc-inhibitorer ved å modifisere og reversibelt å koble sammen to tidligere beskrevne små molekyler. Vi syntetiserte to rettede biblioteker av monomerer, som hver består av en ligand, en kontakt, og en bioorthogonal linker element, for å identifisere den optimale dimer konfigurasjon som kreves for å inhibere Myc. Vi identifiserte kombinasjoner av monomerer, betegnet som selv-sammen dimere hemmere, som viste synergistisk inhibering av Myc-avhengig cellevekst. Vi bekreftet at disse dimere hemmere direkte binde seg til Myc blokkere interaksjonen med Max og påvirke transkripsjon av myc avhengige gener. Kontroll kombinasjoner som ikke er i stand til å danne en dimer ikke viser noen synergieffekter i disse analysene. Sammen er disse dataene validere vår nye tilnærming til å generere mer potente og selektive inhibitorer av Myc av selvbygging fra mindre, lavere affinitet komponenter. Denne tilnærmingen gir en mulighet for å utvikle nye behandlingsformer mot Myc og andre utfordrende protein. Protein interaksjon (PPI) mål klasser
Citation: Wanner J, Romashko D, Werner DS, May EW, Peng Y, Schulz R, et al. (2015) Vendbar Kobling av to forskjellige lavmolekylære inhibitorer av Myc Genererer en Dimerisk inhibitor med forbedret Potens som er aktiv i Myc Over-Uttrykke kreftcellelinjer. PLoS ONE 10 (4): e0121793. doi: 10,1371 /journal.pone.0121793
Academic Redaktør: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA
mottatt: 08.12.2014; Godkjent: 19 januar 2015; Publisert: 15 april 2015
Copyright: © 2015 Wanner et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Coferon, Inc. gitt støtte i form av lønn for forfattere JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP og ST og LDA på tidspunktet for undersøkelsen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er artikulert i «Forfatter bidrag «-delen
Konkurrerende interesser:. JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP, ST og LDA er tilknyttet Coferon Inc på tidspunktet for undersøkelsen. LDA er nå tilknyttet Monterings biovitenskap, Inc. MP, FB og DEB er grunnleggerne og aksjonærene i Coferon, Inc. JW, KWF, DSW og LDA er forfattere på en patentsøknad innsendt av Coferon Inc, som dekker de molekylene som er beskrevet i dette manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Bruk av små molekyler som legemidler til hemmer kreft mål har gjort enorme framskritt i løpet av de siste 20 årene, med en rekke legemidler i rutinemessig klinisk bruk i et bredt spekter av ulike kreftformer. Denne tilnærmingen har vært spesielt vellykket for enzymatiske mål, der bindingsstedet er en godt definert, tydelig lomme i protein som gir seg til rasjonell utforming av svært potente hemmere. Men arbeidet med å utvide bruken av små molekyler for å målrette større eller uordnede flater som er kritiske for å regulere protein-protein interaksjoner (PPI) har blitt møtt med mer begrenset suksess. Prototypiske PPI-hemmere har en tendens til å være store i størrelse og har dårlig narkotika lignende egenskaper og så har begrenset nytte i klinikken. Det er klart at da innovative tilnærminger er nødvendig for å fullmuliggjøre oppdagelse av legemidler for det store antall av hva som er generelt ansett for terapeutisk relevante men undruggable target klasser i mange sykdomsområder.
Som en fremgangsmåte for å håndtere mer utfordrende medikament målene vi utvikler en ny teknologi for å tillate selvbygging av små molekyler til store dimere hemmere, først beskrevet av Barany og kolleger [1]. Den teknologiplattform gjør det mulig å levere dimere molekyler med en stor binding fotavtrykk å hemme biologiske mål som ofte har utfordret tradisjonelle medisinske kjemi tilnærminger (Fig. 1a). Dimerene er sammensatt av to monomerer, som hver omfatter en ligand, en kontakt, og en bioorthogonal linker element. Under fysiologiske betingelser, kan monomerene hurtig likevekt for å danne dimerer ved dannelse av reversible kovalente bindinger mellom linkerelementene. Linkerne er utformet for å være lavmolekylære grupper som lett kan legges til målrettede ligander via egnede koblinger. Ligandene, linkere og kontakter kan alle bli endret for å justere egenskapene til de monomere og tillate optimalisering av god stoff-lignende egenskaper for å oppnå den ønskede farmakokinetiske profil. Den optimaliserte monomerer kan absorberes, distribueres til vev, og inn i cellene. Inne i cellen, kan monomerene binde målet direkte, slik at målet for å drive selvbygging av dimeren. Alternativt kan monomerene re-likevekt inne i cellen for å danne dimer i oppløsning, og dimeren kan direkte binde og hemme målet. I hvilken grad hver vei bidrar til den hemmende virkning avhenger av den iboende affinitetene til ligander for sine respektive bindingssted til målet, kontakten lengde, og dimerisering konstant av linkerne som anvendes. Enten vei fører til målet proteinet som blir bundet av dimerer med en høyere affinitet og større spesifisitet enn de inngående monomerer. Den viktigste fordelen med denne tilnærmingen er at den gjør det mulig for den intracellulære generering av et stort molekyl-inhibitor, godt egnet for målretting av protein-protein interaksjon flater, samtidig som evnen til å kapitalisere på de legemiddel-lignende egenskaper til de småmolekylære komponenter.
A) Skjematisk representasjon av selvsammen dimer tilnærming. Individuelle monomerer (blå og grønn) består av ligand, kontakt og en paret bioorthoganol linker leveres til cellene, krysse plasmamembranen og reagerer og danner en aktiv dimer inhibitor i cellene. Dimer sammenstillingen kan forekomme i det cellulære miljø, eller på mål av interesse. B) Skjematisk fremstilling av borsyren /diol-likevekter som anvendes under dannelsen av dimer. Trigonale plane, nøytrale arter er i likevekt med de ladede kirale tetraeder arter. For en gitt diol, i det cellulære miljø ved pH 7,4 på likevektene blir bestemt ved pKas av borsyrer som anvendes og av de pKas av boronat estere dannet. Racemisering av de chirale ladet art inntreffer meget hurtig og den biologiske målet vil velge ut for de mest foretrukne dimer. C) Oppsummering av bibliotek utforming: Strukturer av to foreldre molekyler C01 (til venstre) og C02 (til høyre) og feste posisjoner; kontaktene er enten alkylkjeder eller PEG-enheter; R og R «er knyttet til kontaktene via amid eller karbon obligasjoner; syntetiske detaljer om utvalgte bibliotek medlemmer er gitt i tilleggs eksperimentelle prosedyrer.
En rekke bioorthogonal linkerne er mottagelig for denne teknologiplattformen. Vi og andre har beskrevet atom-effektiv arylborsyre linkere som kan reversibelt dimerisere med forskjellige katekoler og
cis
-alkyl diol samarbeidspartnere under vandige betingelser [1, 2, 3, 4] (Fig. 1B). Borsyrene og partner dioler etablere likevekt raskt, med dimerization konstanter typisk i mikrometer til mM rekkevidde [5, 6]. Viktigere, kan dimerization konstant justeres via substituenter. For eksempel er innføring av steriske effekter på hver sammenkoblende komponent disfavors boronat esterhydrolyse, skiftende monomer-dimer vekten mot dimerdannelse, noe som resulterer i forbedrede dimerisering konstanter [7, 8] og kan føre til forbedrede potenser av den resulterende dimerisk inhibitor. Begge boronic acid og diol linkerne kan legges til ønsket ligander gjennom et bredt spekter av tilkoblingsdelene ved hjelp av lettvinte syntesemetoder. Denne teknologien kan brukes på alle mål som består av to eller flere proksimale bindingsseter som kan bro med ligander bærer egnede kontakter og forbindelsesledd. Typisk dimerene dissosiere fra målet med langsommere off-priser, noe som fører til forlenget hemming av målet.
Her vi har anvendt denne teknologien for å utvikle inhibitorer mot c-Myc (referert til som Myc heretter) transkripsjon faktor. Myc tilhører en familie av transkripsjonsfaktorer som andre medlemmer inkluderer MycL og MYCN og disse transkripsjonsfaktorer har viktige roller i å kontrollere cellevekst, overlevelse og differensiering [9, 10]. Myc blir vanligvis strengt regulert, men dens ekspresjonsnivået kan økes betydelig i kreft, og dette er antatt å være en viktig drivkraft for tumorbiologi. Myc-aktivitet kan bli deregulert gjennom økt ekspresjon av enten genamplifikasjon [11] eller transgenet [12]. I mer begrensede tilfeller, særlig i Burkitt lymfom,
Myc
genet er mutert [13, 14] noe som kan resultere i en mer stabil protein [15, 16]. For å fungere biologisk danner Myc en heterodimer med sin partner Max, og den resulterende dimer binder seg til spesifikke promotor motiver, rekrutterer transkripsjonsaktiverings komplekser, og til slutt aktiverer Myc-avhengige gener. Det er klart at inaktivering av Myc kan føre til betydelige anti-tumoreffekter i musemodeller for kreft [17, 18]. I tillegg er funksjonell inaktivering av Myc i normalt vev ved hjelp av en dominant negativ form (OmoMyc) godt tolerert [19], som støtter konseptet at terapeutisk rettet mot dette reaksjonsveien kan være et middel for å behandle kreft.
Tallrike direkte og indirekte metoder har blitt utviklet for å målrette Myc biology [20]. Nylig små molekyler som hemmer BET familien av epigenetiske leser proteiner og innvirkning
Myc
genekspresjon har vist utmerket pre-klinisk effekt hos Myc-avhengige tumormodeller [21, 22, 23] og er for tiden i kliniske studier. Flere grupper har også rapportert små molekyl hemmere som binder direkte til Myc og hemmer dets interaksjon med Max [24, 25]. Disse inhibitorer, som opprinnelig ble introdusert av Prochownik et al, binde med mikromolar affinitet og forstyrre Myc: Max interaksjon, så vel som hemmer proliferasjon av myc-uttrykkende tumorcellelinjer. To slike små molekyler, 10058-F5 og 10074-G5, har vist seg å binde seg uavhengig av hverandre og samtidig til den uordnede konformasjon av den grunnleggende helix-loop-helix leucin zipper (bHLHZip) domene av Myc, og dermed hemme dets interaksjon med Max [26 , 27, 28]. I tillegg har nære analoger av 10058-F4 og 10074-G5 med lignende og forbedrede potenser blitt beskrevet [29, 30, 31, 32, 33].
Vi har utnyttet vår teknologiplattform til å utvikle selvsammen dimer hemmere av Myc ved hjelp av disse tidligere beskrevet små molekyler som vår starter individuelle ligander. Disse molekylene er også modifisert med vedlagte kontakter og linkerne er utformet for å lette reversible dimerdannelse. Vi viser at våre nye hemmere direkte binde seg til Myc med forbedret affinitet i løpet av de eksisterende små molekyl hemmere, forstyrre Myc: Max samhandling
in vitro
, og påvirke uttrykket av MYC regulert gener i celler som resulterer i anti-proliferative effekter i Myc-uttrykke tumorcellelinjer.
Materialer og metoder
Compound Synthesis
En fullstendig beskrivelse av syntetiske ruter for molekylene som er beskrevet i denne artikkelen kan bli funnet i S1 File .
Cell Culture, spredning og Synergy analyse
K562 (CCL-243), Daudi (CCL-213), Raji (CCL-86) og MV4-11 (CCL-9591) celler ble kjøpt direkte fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og rutinemessig dyrket under anbefalte forhold. Vekst og spredning ble bestemt ved bruk av Cell Titer 96 Vandig One Solution (Promega, Madison, WI). Alle celler ble platet på 10.000 celler pr brønn i vekstmedium i en klar 96-brønners plate. Etter 3 dager med behandling med forbindelsen reagens ble tilsatt, og absorbans ved 490 nm ble avlest etter inkubering i 4 timer ved 37 ° C. En kontrollplate med forbindelse fortynnet i media ved de samme konsentrasjoner ble behandlet på lignende måte, og disse verdiene subtraheres fra celleplaten data for å kontrollere for hvilken som helst forbindelse innblanding i analysen. Synergi, ble bestemt ved hjelp av Bliss modell av uavhengighet.
Cellelyse og Western blotting
legemiddelbehandlede celler ble vasket i PBS og lysert i RIPA-buffer (supplert med protease og fosfatase-inhibitorer) (Sigma, St. Louis, MO) på is i 30 minutter. Totalt proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en BCA kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blots ble utført ved oppløsning av proteiner ved SDS-PAGE og overføring til nitrocellulosemembraner. Membranene ble probet med antistoffer mot: c-Myc (9E10) (sc-40); HRP-konjugert GAPDH (FL-335) (sc-25778 HRP) (alle fra Santa Cruz Biotechnology); Max (AF4304) (R Kløyvet PARP (Asp214) (D64E10) XP (5625, Cell Signaling). Proteiner ble gjort synlige ved hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært mus eller kanin (1: 5000) (GE Healthcare) eller geit (1: 1000) (R .. 50 mikrometer Fig 3A og tabell 1) i samsvar med en fersk rapport ved hjelp av foreldre ligander 10058-F4 og 10078-G5, som viste slektskap 39,7 pM og 31,7 pM henholdsvis for Myc i en lignende SPR-analyse [35]. I motsetning til dette, en kombinasjon av E07 + N12 bundet med en Kd på 8,6 uM, en bemerkelsesverdig forbedring i forhold til de enkelte monomerer. Vi observerte lignende data med E08 + N11 dimer. Spesielt, observerte vi metning binding av kombinasjonene med støkiometri av dimer bindende mindre enn ett, utelukker muligheten for at forbindelsen aggregering forårsaket av dimerization var ansvarlig for den forbedrede binding observert.
A) hemmere viser mette binding av Myc i SPR eksperimenter. Likevekt Response enheter (RU), normalisert til maksimal mettede verdier i de enkelte forsøk er plottet (gjennomsnitt ± SEM) som en funksjon av inhibitorkonsentrasjon. B) doseresponskurver for inhibering av Myc: Max interaksjon som bestemt ved ELISA. De data som er representert som en fraksjon av aktivitet sammenlignet med en DMSO-behandlet kontrollprøve og er plottet som en middelverdi av 2-5 forsøk ± SD. X-aksen angir den konsentrasjonen av hver monomer som anvendes.
For å få bekreftet at det dimere inhibitoren kjørte forbedret binding til Myc, vi syntetisert en analog av N12 var lik på alle måter, bortsett fra at den mangler diolgruppe som kreves for omsetning med sin borsyre motstykke (C12, fig. 2C). C12 alene eller i kombinasjon med E07 hadde Kd-verdier 50 uM (Fig. 3A og tabell 1), støtter den konklusjon at evnen til å danne dimer var viktig for den forbedrede binding av disse monomerene
neste. spurte om binding av disse dimers til Myc kan forstyrre samhandlingen med sin transcriptional partner Maks. Vi utviklet en ELISA bruke renset Myc og Max protein som mulig for oss å måle effekter på Myc: Max bindende. ELISA-platen ble først belagt med Max protein og forbindelsene pre-inkubert med Myc-protein før tilsetning til den Max-belagt plate. Etter omfattende vasking ble Myc binding til Max oppdaget ved hjelp av et anti-myc antistoff. Vi først testet forelder ligandmolekyler, C01 og C02, og observerte lite hemming med enten av monomerene (IC
50 30 mm) eller kombinasjonen (IC
50 23 mm) på Myc: Max interaksjon (S1 tabell). Vi neste fokusert på en av våre identifiserte dimere hemmere, E07 + N12 og likeledes observert at enkelte monomerer E07 og N12 viste liten hemming av Myc: Max samhandling (IC
50 24 mikrometer og 30 mikrometer henholdsvis fig. 3B og tabell 1). I motsetning til dette, en kombinasjon av E07 + N12, dosert i et 1: 1 forhold, hemmet Myc binding til Max på en doseavhengig måte (IC
50 3,3 uM) (figur 3B og tabell 1.), En 8 gangers forbedring i løpet av de mest aktive enkelte monomer. Vi observerer tilsvarende effekter for det dimere inhibitoren E08 + N11 (tabell 1)
kontroll Kombinasjonen av C12 med E07 klart å vise aktivitet i Myc.: Max ELISA utover aktiviteten til E07 alene (Fig. 3B) , noe som tyder på at evnen til E07 + N12 for å dimerisere kjørte forbedret inhiberende effekt. Begrensede effekter ble observert med det ytterligere ikke-dimeriserbare kontroll kombinasjon E08 + C11 (tabell 1)
selvsammen dimerer selektivt hemme Myc.: Max binding til DNA
Når det er bekreftet at dimerene binder til myc og blokkere dets binding til Max vi neste ønsket å bekrefte at disse inhibitorer selektivt blokkert den biologiske aktiviteten til myc i et cellefritt assay. Dannelsen av Myc: Max heterodimer er nødvendig for dens evne til å binde til DNA-sekvensene og utløse transkripsjonen aktivering av Myc-avhengige gener. Max har den ytterligere evne til å danne homodimerer som kan binde til de samme DNA-sekvensene, men generelt undertrykke genekspresjon [9, 10]. Vi utførte derfor en elektroforesegel mobilitet skift analyse for å bestemme om våre inhibitorer hadde selektivitet for inhibering av bindingen av Myc: Max heterodimerer til DNA i løpet av maks.: Max homodimerer
Inkubering av Max protein med E-box oligonukleotid resulterte i et DNA bandet skiftet indikerer Max: Maks homodimerer (fig. 4A). Tilsetning av Myc resulterte i en reduksjon i mengden av Max: Max homodimerer og utseendet av Myc: Max heterodimerer i kompleks med DNA. Ingen av de to monomerer, E07 eller N12, hadde noen merkbar effekt på Myc: Max eller Max: Max-komplekser, men E07 + N12 forårsaket en reduksjon doseavhengig i nivåene av de Myc: Max kompleks. Særlig reduksjon i Myc: Max komplekset er inverst korrelert med en økning i nivåene av Max: Max kompleks, noe som tyder dimeren er spesifikt blokkerer Myc: Max interaksjon, frigjør Max til homodimerize og binder seg til DNA
Gel mobilitetsskift-analyse som viser virkningene på Myc: Max DNA-kompleks-dannelse av det dimere inhibitor E07 + N12 (A) og den ikke-dimeriserbare kontroll kombinasjon E07 + C12 (B). Bandene som representerer protein-DNA kompleks eller nakent DNA vises på høyre side av hvert panel. Konsentrasjonene er angitt er i uM.
Som ytterligere bevis på at dannelsen av dimerisk inhibitor var kritisk for den inhiberende aktivitet, utførte vi lignende eksperimenter med det ikke-dimeriserbare kontroll monomer C12 (fig. 4B) . I motsetning til E07 + N12, kombinasjonen av E07 + C12 hadde ingen virkning på bindingen av Myc: Max eller Max: Max-komplekser til DNA. Disse dataene er konsistente med effekten av disse forbindelsene i SPR analysen og ELISA.
Sammen disse cellefrie analysedata viser at selv-montering dimere hemmere identifisert i celleanalyser kan direkte binde seg til Myc og hemme dets interaksjon med Max, som støtter en on-target virkningsmekanisme for disse hemmere. Videre, bruk av ikke-dimeriserbare kontroll monomerer bekrefter at evnen til å danne en stor molekylvekt dimerisk inhibitor er nøkkelen til evnen til å målrette Myc-proteinet.
Selv montering av dimer er kritisk for cellulær aktivitet MYC hemmere
Våre cellefrie eksperimenter hadde klart vist at muligheten for selv-montering av dimer var viktig i å drive den forbedrede hemmende effekt kontra Myc protein. For å teste dette i et mobiltelefon sammenheng vi sammenlignet effekten på cellelevedyktigheten til E08 + N11 dimer versus sine ikke-dimeriserbare kontroll kombinasjon E08 + C11. Behandling av Daudi-celler med E08 + N11 forårsaket en signifikant reduksjon i cellelevedyktigheten etter 72 timers behandling, mens E08 + C11 kombinasjonen hadde ingen virkning på cellelevedyktighet (Fig. 5A, venstre panel). Tidligere rapporter har antydet at behandling av celler med relativt høye konsentrasjoner ( 50 mikrometer) av lite molekyl Myc hemmere 10058-F4 og 10078-G5 føre til en reduksjon i MYC protein nivåer [31, 35] og så vi brukte dette som en mål av virkningen av dimerene på Myc pathway.
