Abstract
Bakgrunn
Menneske sulfatase 1 (hSulf-1) er et heparin-nedverdigende endosulfatase at desulfates celleoverflate heparinsulfat-proteoglykaner (HSPGs) i ekstracellulær matriks og negativt modulerer heparin-bindende vekstfaktor og cytokin signalering i celleproliferasjon. Men hSulf-1-funksjonen er mer komplisert, og det molekylære mekanismen er ikke kjent.
hovedfunnene
For ytterligere å undersøke funksjonene hSulf-1 genet i regulering av vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) signalering, en serie av vektorer som uttrykker hSulf-1, ble hSulf-en liten hårnål RNA (shRNA) og VEGFR-2 shRNA generert. hSulf-en re-uttrykk kan downregualte den VEGFR-2 fosforylering og hemme kreftcelle spredning både i eggstokkene og hepatocellulære kreftcellelinjer. Knockdown av hSulf-1-ekspresjon ved hSulf-1 shRNA forbedret utvinning av høye nivåer av fosforylert VEGFR-2, og knockdown av VEGFR-2 ekspresjon av VEGFR-2 shRNA inhiberte proliferasjonen aktiviteten av kreftceller
in vitro
til en viss grad. I humane kreft xenotransplantater i nakne mus, ble tumorvekst hemmet markert etter injeksjon av adenovirus som uttrykker hSulf-1, med de tumorinhibering priser på 46,19% og 49,56% i ovarier og hepatocellulære tumormodeller, respektivt. hSulf-1 uttrykk betydelig redusert svulst microvessel tetthet.
Konklusjoner
Resultatene viste at hSulf-en re-uttrykk både i eggstokkene og hepatocellulære kreftceller induserer antitumor effekt ved å dempe fosforylering av VEGFR- 2 og undertrykke angiogenese. Derfor hSulf-1-mediert antiproliferation og antiangiogenesis kan være en rimelig tilnærming for kreftbehandling
Citation. Ji W, Yang J, Wang D, Cao L, Tan W, Qian H, et al. (2011) hSulf-1 Gene utstillinger Anticancer Effekt gjennom Negativt Regulering VEGFR-2 Signa i Human kreft. PLoS ONE 6 (8): e23274. doi: 10,1371 /journal.pone.0023274
Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 13 april 2011; Godkjent: 11 juli 2011; Publisert: 10 august 2011
Copyright: © 2011 Ji et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Natural vitenskapelige grunnlag Kina (81071866, 30872998). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
heparinsulfat-proteoglykaner (HSPGs) i ekstracellulær matriks er viktige bestanddeler for regulering av heparin-bindende vekstfaktor signalering, for eksempel fibroblast vekstfaktor (FGF), epidermal vekstfaktor (EGF) og hepatocytt-vekstfaktor (HGF) [1], [2]. Sulfate av
N
-acetylglucosamine rester av HSPGs er avgjørende for samspillet mellom disse faktor ligander og deres reseptor tyrosin kinaser på celleoverflaten [3]. Humant sulfatase 1 (hSulf-1) ble karakterisert til å være en heparin-nedbrytende endosulfatase som fungerer for å desulfate celleoverflate HSPGs og negativt modulerer vekstfaktor og cytokin signale [4]. hSulf-1 protein er mye uttrykt i normalt vev, men inaktivert i flertallet av ulike menneskelige kreftformer, for eksempel på eggstokkene, bryst, bukspyttkjertel, nyre, lever, hode og nakke plateepitelkarsinom [5] – [7]. Tap av heterozygositet, metylering av DNA CpG øyer og histonmodifikasjonene muligens er de viktigste årsakene til hSulf-en inaktivering i humane kreftformer [8], [9]. Varianten hepatisk nukleær faktor 1 (vHNF1), som kodes for av transkripsjonsfaktor 2-genet (TCF2, HNF1beta), ble også rapportert å ha en negativ regulere hSulf-1-ekspresjon i eggstokk-kreft [10]. Re-ekspresjon av hSulf-1 i kreftceller effektivt resulterer i en reduksjon av celleproliferasjon, så vel som en økning av sensitivitet overfor kjemoterapi-indusert apoptose [11]. Derfor de rapporterte data antydet at hSulf-en normalt fungerer som en negativ regulator i celleproliferasjon, det kan spille en viktig rolle i kreftbehandling.
For å undersøke regulerende rolle hSulf-1 i heparin-bindende vekst faktor signalering i humane kreftformer, de tidligere studier avdekket at hSulf-1-ekspresjonen kan redusere kaskade fosforylering av en rekke kinaser, inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), mitogen-aktivert protein kinase kinase ( MEK), serin /treonin kinase (AKT) etter behandling med eksogent tilsatte vekstfaktorer, og etterfulgt av inaktivering av nedstrøms signalveier [6], [11], [12]. hSulf-1 er også involvert i inhiberingen av autocrine-mediert fosforylering av EGFR-ERK i brystkreft celler indusert av serum sult, og inhibering av autocrine EGFR-ERK-signalering ved hSulf-1 resulterer i en redusert ekspresjon av Cyclin D1, en redusert S-fasen fraksjon og en øket G2-M-fraksjon, og til slutt fører til hemming av celleoverlevelse i brystkreftceller [7]. Derfor er tap av hSulf-1 i kreft og kreft-cellelinjer forbundet med oppregulering av vekstfaktor signalering ved forbedret kinase fosforylering, og fosforylering og aktivering av reseptor-tyrosin-kinaser har vært implisert i å fremme carcinogenese og utvikling av kreft.
Videre er vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og VEGF-reseptor (VEGFR) er involvert i hSulf-1-mediert suppresjon av cancerceller [6]. Vi vil derfor anta at hSulf-en kan presentere kreft potens ved å hemme angiogenese i de fleste humane kreftformer. Den VEGFR familien inneholder tre medlemmer, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR /Flk-1) og VEGFR-3 (Flt-4), som er transmembrane tyrosinkinase-reseptorer som regulerer dannelsen av blod og lymfe fartøy. Blant disse tre reseptorene er VEGFR-2 generelt anerkjent for å ha en rektor rolle som formidler VEGF-indusert svar som direkte regulerer tumor angiogenese [13]. I denne studien, ved å konstruere ulike vektorer som bærer hSulf-1 genet, hSulf-en liten hårnål RNA (shRNA) eller VEGFR-2 shRNA, vi gitt bevis for å vise at hSulf-en re-uttrykk viste en negativ effekt på cellevekst av downregulating VEGFR-2 signaliserer både i eggstokkreft og leverkreft cellelinjer. Den antitumor effekt av hSulf-en ble også validert i eggstokkene og leverkreft transplantater i nakne mus.
Resultater
Inaktivering av hSulf-en er en vanlig molekylær hendelse i flertallet av kreft hos mennesker og innebærer i VEGFR-2 signale
hSulf-1 protein er mye uttrykt i normalt vev og funksjoner til negativt modulere vekstfaktor signalering. For å demonstrere dets inaktivering i mesteparten av forskjellige humane kreftformer, undersøkte vi hSulf-1-ekspresjon i mange typer av humane kreftprøvene ved immunohistokjemi. I epitelceller normale vev, hSulf-en var positiv med en positiv hastighet på 100,0%. Men i deres tilsvarende kreft, ble hSulf-1expression trykt åpenbart. De positive tallene for hSulf-1 var 23,1% (6/26), 16,7% (2/12), 31,8% (7/22), 11,1% (1/9), 44,4% (8/18) i hepatocellulær, bryst, mage, nyre og tykktarm kreft, henholdsvis (fig. 1A).
(A) Prøvestykkene, inkludert ulike kreftformer og deres tilstøtende normale vev, ble fiksert i 10% nøytralt formaldehyd i 6 timer, parafin- innebygd, og skiver i 5 mikrometer tykke seksjoner for hSulf-en immunhistokjemi. De leverkreft (HCC) celler var negative for hSulf-1 uttrykk, som var omgitt av hSulf-1-positive leverceller. Brystkreft, magekreft og nyre klare celle carcinoma celler var alle negative, og tykktarm kreft celler var positive for hSulf-1 uttrykk; opprinnelige forstørrelse × 200 (øvre panel). De hSulf-1-positive celle prosenter i alle prøvene ble talt opp innen 5 høy effekt felt (opprinnelig forstørrelse × 400) under mikroskop, og viste i histogrammer (nedre panel); * P 0,05; ** P 0,01. (B) Uttrykk for VEGFR-2, inkludert t-VEGFR2 og p-VEGFR2, i 26 tilfeller av HCC ble oppdaget av immunhistokjemi; opprinnelige forstørrelse × 400 (venstre panel). De positive celle prosenter i seks hSulf-1-positive og 20 hSulf-en-negative HCC ble talt opp innen 5 høy effekt felt (opprinnelig forstørrelse × 400) under mikroskop, og viste i histogrammer (høyre panel); * P. 0,05
tydelig effekten av hSulf-en er å minske kaskade fosforylering av en serie av reseptor-tyrosin-kinaser, som ble demonstrert i VEGF og VEGFR signale [6]. Vi har utforsket derfor ekspresjon av total VEGFR-2 (t-VEGFR2) og fosforylert VEGFR-2 på Tyr1175 (p-VEGFR2
Tyr1175) i tumorprøver (fig. 1B). Blant de 26 tilfeller av leverkreft, er det en åpenbar reduksjon av p-VEGFR2
Tyr1175 nivået i hSulf-1-positive leverkreft enn i hSulf-1-negative hepatocellulært karsinom (P 0,05), men ingen forskjell t-VEGFR2 uttrykk mellom dem (P 0,05).
Adenovirus-mediert hSulf-en re-uttrykk nedregulerer fosforylering av VEGFR-2 i kreftceller
for å teste infeksjon effektiviteten av adenovirus, BEL-7404 kreftceller ble infisert med kontroll adenovirus Ad5-EGFP bærer en reporter gen av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) og observerte førtiåtte timer etter infeksjon under et fluorescerende mikroskop. Prosentandelene av EGFP-positive celler var 42,67 ± 12,25% og 86,33 ± 26,48% ved multiplisiteter av infeksjon (MOI) på 5 og 10 pfu /celle, henholdsvis (fig. 2A).
(A) BEL- 7404 celler ble infisert med kontroll adenovirus Ad5-EGFP på mois på 5 og 10 pfu /celle, og prosenter av EGFP-positive celler ble observert under et fluorescerende mikroskop, opprinnelig forstørrelse × 400. (B) RT-PCR ble anvendt for å identifisere hSulf-1-ekspresjonen mediert av adenovirus Ad5-hSulf1. 1, Celler infisert med Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle; 2, Celler infisert med Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle og deretter transfektert med hSulf-1 shRNA-vektoren ved en konsentrasjon på 20 ug /10
5-celler; 3, Foreldre celler. (C) Uttrykk for hSulf-1, t-VEGFR2 og p-VEGFR2
Tyr1175 ble identifisert av western blotting. Glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en kontroll lasting. Densitometrisk analyse ble utført for å vise uttrykket nivåer av p-VEGFR2
Tyr1175 i kreftceller, normalisert til GAPDH-tetthet. Kolonner er gjennomsnittet av tre separate analyser; barer = SD; ** P. 0,01
De foreldre kreft cellelinjer, SKOV3 og BEL-7404, var negative for hSulf-1 uttrykk. Etter 48 timer etter infeksjon av Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle, kreftcellene var positive for hSulf-1, og den hSulf-1 shRNA kunne nedregulere den hSulf-1-ekspresjonen nivå (Fig. 2B). Siden hSulf-1 genet kan redusere fosforylering av kinaser involvert i mange vekstfaktor signalveier, undersøkte vi uttrykket nivåer av t-VEGFR2 og p-VEGFR2
Tyr1175. Sammenlignet med de paren kreft celler, nivået av t-VEGFR2 forble ingen endring i Ad5-hSulf1 infiserte celler. Nivået av p-VEGFR2
Tyr1175 hadde en åpenbar reduksjon etter infisering av Ad5-hSulf1. Når hSulf-1 shRNA ble transfektert inn i den Ad5-hSulf1 infisert kreftceller, hSulf-1-ekspresjonen ble re-hemmet, og innholdet av p-VEGFR2
Tyr1175 gjenvinnes nesten til normale nivåer (fig. 2C).
adenovirus-mediert hSulf-en reaktive hemmer kreftcelle spredning
Fordi tap av hSulf-en er en vanlig molekylær hendelse i flertallet av kreft hos mennesker, reaktivert vi hSulf-1 uttrykk ved infeksjon av adenovirus bærer hSulf-1-genet i forskjellige cancercellelinjer og undersøkt celleproliferasjon. Sammenlignet med kontrollgruppen adenovirus Ad5-EGFP, som utøves Ad5-hSulf1 en tydelig hemming virkning på kreftcelleformering med MOI-avhengig måte. Når MOI var mer enn 20 pfu /celle, ble cellelevedyktigheten ble redusert til mindre enn 50% i den Ad5-hSulf1 infisert kreftceller, mens cellelevedyktigheten var mer enn 80% i den Ad5-EGFP infisert kreftceller (fig. 3A).
(A) SKOV3 og BEL-7404 kreftceller ble infisert med Ad5-hSulf1 på ulike mois. Ad5-EGFP ble anvendt som en kontroll adenovirus. (B) SKOV3 og BEL-7404 kreftceller ble transfektert med VEGFR-2 shRNA vektor i en konsentrasjon på 20 ug /brønn. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble VEGFR-2-ekspresjon detektert ved Western-blotting og cellelevedyktigheten ble detektert ved MTT-analyse. Den negative kontroll shRNA (Ctrl-shRNA) ble anvendt som en negativ kontroll; * P 0,05; ** P 0,01. (C) BEL-7404 kreftceller ble infisert med Ad5-hSulf1 ved MOI på 10 pfu /ml og deretter transfektert med VEGFR-2 shRNA vektor i en konsentrasjon på 20 ug /10
5-celler, deretter VEGFR-2-ekspresjon og celle levedyktighet ble oppdaget. BEL-7404 parentale celler ble anvendt for å representere den maksimale mengden av cellevekst for å fremstille den prosentvise levedyktighet; * P 0,05; ** P . 0,01
Kreftceller dyrket i 96-brønners plater ble transfektert med vektorene inneholdende den VEGFR-2 shRNA og negativ kontroll shRNA ved konsentrasjon på 20 ug /brønn. Ekspresjonen av VEGFR-2, ble undersøkt ved Western blotting, og cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Sammenlignet med den negative kontrollen shRNA, den VEGFR-2 shRNA inhibert VEGFR-2-ekspresjon og nedsatt cellelevedyktigheten til (fig. 3B) i noen grad. For å påvise om VEGFR-2 knockdown under betingelser for hSulf-1 overekspresjon har den samme virkning på cellenes levedyktighet, BEL-7404 kreftceller, som ble infisert med Ad5-hSulf1 ved en MOI på 10 pfu /celle, ble transfektert med VEGFR-2 shRNA vektoren ved en konsentrasjon på 20 ug /10
5-celler til knockdown ekspresjon av VEGFR-2 (fig. S1), viste resultatene at BEL-7404 cellelevedyktigheten etter transfeksjon av VEGFR-2 shRNA ble ytterligere redusert i sammenheng med hSulf-en effekt (fig. 3C).
Adenovirus-mediert hSulf-en genterapi viser en potent antitumor effekt av antiangiogenesis i humane kreft xenotransplantater i nakne mus
reaktive av hSulf- en funksjon i kreftceller kan inaktivere den nedstrøms vekstfaktor signalveier, er derfor hSulf-en et nytt mål for kreft genterapi. Herved konstruerte vi en adenovirusvektor som uttrykker villtype hSulf-1-genet, Ad5-hSulf1. Dens antitumor effekt ble validert både i eggstokkene og hepatocellulære kreft xenotransplantater i hårløse mus (fig. 4A). Etter intratumorale injeksjoner av virus ved en total dose på 10
9 pfu per mus, undertrykkelse av tumorvekst i den Ad5-hSulf1 behandlede gruppen var mer effektive, med de tumor inhiberingsgraden av 46,19% og 49,56% i SKOV3 og BEL- 7404 modeller, sammenlignet med den blanke kontrollgruppen (P 0,01). Det var ingen forskjell mellom den negative virus kontrollgruppen og den blanke kontrollgruppen (P 0,05).
(A) SKOV3 og BEL-7404 modeller, 5 mus pr gruppe, undertrykkelse virkning av Ad5-hSulf1 på tumor veksten ble analysert, sammenlignet med kontrollgruppen, eller den negative adenovirus Ad5-EGFP-gruppe; Svarte flekker på X-aksen presenterte tidspunkter av adenovirus injeksjoner; ** P 0,01. (B) Patologisk undersøkelse av SKOV3 xenografttumorer. Sammenligning av tumorvekt i SKOV3 modeller (venstre panel); Bar = 1 cm; ** P 0,01 versus kontroll eller Ad5-EGFP-grupper. Ved hematoxylin og eosin farging (HE) og immunhistokjemiske undersøkelser, de positive celle prosenter for hSulf-en, den microvessel tetthet (MVD) teller merket med CD31 antistoff, ble kvantifisert innen 5 høy effekt felt (opprinnelig forstørrelse × 400) under mikroskop. Etter injeksjoner av Ad5-hSulf1, tumorceller var positive for hSulf-1 uttrykk i cytoplasma. Følgelig ble det telling av MVD betydelig redusert, sammenlignet med den i kontrollgruppen. (C, D) Det samlede VEGFR-2 og fosforylert VEGFR-2 (C), og total AKT og fosforylert AKT (D) ble påvist ved western blotting (venstre panel) og immunhistokjemi (høyre panel) i Ad5-hSulf1 behandlet SKOV3 xenograft tumorer, sammenlignet med kontrollen og Ad5-EGFP-grupper.
Ved slutten av observasjonsperioden, mus som bærer SKOV3 xenotransplantater ble avlivet og tumorene ble fjernet og veiet. Tumorvekter av Ad5-hSulf1 gruppen var lavere enn for de to andre gruppene (fig. 4B, venstre panel). De parafininnstøpte tumorsnitt ble undersøkt immunohistochemically. I det tomme kontrollgruppen, kreftceller var negative for hSulf-1-ekspresjon. Men i den Ad5-hSulf1 gruppe, kreftceller re-uttrykkes hSulf-1-proteinet. En kvantitativ analyse av microvessel tetthet (MVD) ble utført ved CD31 immunhistokjemi. De MVDS i tumorvev var 24,67 ± 6,51 og 52,33 ± 12,34 i Ad5-hSulf1 og kontrollgruppene, henholdsvis (fig. 4B, panel høyre). Det var en signifikant forskjell mellom dem (P 0,05).
Som hSulf-1-genet utøver en bred rolle i regulering av flere baner ved å hemme fosforylering av intracellulære tyrosinkinaser som kan være avgjørende i tumorcelleformering og tumor angiogenese, undersøkte vi derfor ekspresjon av nedstrøms proteiner, inkludert VEGFR-2 og serin /treonin kinase (AKT) i xenograft tumorer. Resultatene viste at ekspresjon av p-VEGFR2
Tyr1175 og fosforylert AKT på Thr308 (p-AKT
Thr308) ble nedregulert i den Ad5-hSulf1 gruppe undersøkt ved Western blotting og immunhistokjemi (Fig. 4C, D).
diskusjon
sulfatering av celleoverflate HSPGs antas å spille en viktig rolle i regulering av heparin-bindende vekstfaktor signalering i ekstracellulær matriks [14], [15]. Den hSulf-1 protein er en arylsulfatase aktivitet enzym som kan negativt regulere sulfate staten HSPGs [16]. Sterke bevis viste at hSulf-1 normalt funksjoner for å desulfate celleoverflate HSPGs og nedregulere reseptor-tyrosin-kinase signalering for effektivt å oppheve cellevekst og overlevelse [4], [17]. Denne prosessen spiller en tydelig del ved inhibering av ondartet transformasjon, og kreftcellevekst [18], [19]. Derfor er hSulf-1 betraktes som et tumorsuppressorgen. Tidligere studier viste at hSulf-1 er inaktivert i flertallet av humane cancere gjennom enten genetiske mekanismer, for eksempel delesjon og mutasjon, eller gjennom epigenetiske mekanismer, slik som DNA-metylering og histon deacetylering [12], [20], [21]. Vi har også demonstrert immunohistochemically at hSulf-1 uttrykk ble nedregulert i 87 tilfeller av kliniske prøver inkludert hepatocellulær, bryst, mage, nyre og tykktarm kreft, sammenlignet med sine tilstøtende normalt vev. På grunn av årsakene til at hSulf-en har kompliserte funksjoner, og dets molekylære mekanismen har ikke blitt godt kjent ennå, i disse studiene testet vi om hSulf-1-mediert hemming av VEGFR signalering er assosiert med antiproliferation og antiangiogenesis i kreft.
Både primære lesjoner og metastatiske svulster må utvikle en ny vaskulær forsyning for å støtte kreftcelle utvidelse og formidling. De fleste kreftceller kan uttrykke både VEGF ligand og VEGFR som fungerer i en autokrin loop for å direkte stimulere tumor angiogenese [22]. Angiogenese er en hastighetsbegrensende trinn i kreft vekst, progresjon og metastasering. VEGF er en viktig formidler av angiogenese, som er godt balancedly uttrykkes i de fleste vev og celletyper, men sterkt oppregulert i tumorer [23]. Binding av VEGF til dets reseptor resulterer i reseptor-autofosforylering og påfølgende aktivering av en serie av tyrosinkinaser, aktiverer deretter flere nedstrøms-proteiner som spiller funksjonelle roller i celleoverlevelse, celleproliferasjon, vaskulær permeabilitet og stabilisering av nye blodkar [24] – [ ,,,0],26]. Derfor fosforyleringen-mediert aktivering av VEGFR er en viktig prosess for regulering av kreft vekst. Fordi hSulf-en katalyserer desulfatering av HSPGs, derfor påvirker det bindende evne heparin-bindende faktorer til sine reseptorer i EGFR, ERK1 /2, MEK, PI3K /AKT signalveier, og presser den fosforylering og aktivering av reseptor tyrosin kinaser . Disse signalveier var alle involvert i angiogene prosess [27] – [29]. Meget sulfat HSPGs forsterke samspillet mellom VEGF og VEGFR-2, deretter fosforylere og aktivere VEGFR-2. I denne prosessen, kan ekspresjonen av VEGF og VEGFR-2 ikke bli påvirket av sulfatering eller desulfatering av HSPGs [30]. Det ble funnet at forbedringen av VEGFR-2 fosforylering på Tyr1175 var kjent for å være essensiell for VEGF-avhengig aktivering av MAPK signalering og angiogenese [31]. Hvis du vil kontrollere den negative effekten av hSulf-en på kreft angiogenese, genererte vi adenovirus uttrykker hSulf-en. Adenovirus-mediert hSulf-1 uttrykk ikke bare downregualted nivåene av fosforylert VEGFR-2, men også hemmet spredning av kreftceller både i eggstokkene og hepatocellulære kreftcellelinjer. Knockdown av hSulf-1-ekspresjon ved hSulf-1 shRNA vektor forbedret utvinning av høye nivåer av fosforylert VEGFR-2, noe som indikerer at hSulf-1 regulerer fosforylering og aktivering av VEGFR-2. Imidlertid kan hemming av kreftcelle spredning
in vitro
av hSulf-en re-uttrykk være hovedsakelig på grunn av desulfatering av HSPGs og inactivition av mange vekstfaktor signalveier. Imidlertid, når vi brukte VEGFR-2 shRNA å slå av ekspresjon av VEGFR-2 i ovarier og hepatocellulære kreftcellene ble cellelevedyktigheten ble redusert til en viss grad, noe som viser at den VEGFR-2 signale deltar i reguleringen av cancer celleproliferasjon, og den antiproliferation virkningen av hSulf-1 på kreftceller er delvis på grunn av hemming av VEGFR-2-signalering. Når BEL-7404 kreftceller ble infisert med Ad5-hSulf1 å re-uttrykke hSulf-1 og deretter transfektert med VEGFR-2 shRNA å dempe VEGFR-2-ekspresjon, ble cellelevedyktigheten ytterligere redusert, nettopp som viser at det er en annen mekanisme som er involvert i VEGFR-2-aktivering og cancer celleproliferasjon i sammenheng med hSulf-1-virkning.
for å evaluere effekten av hSulf-1 på tumorvekst, behandlet vi humane kreft xenografter i nakne mus med adenovirus som uttrykker hSulf-1. De resultater som ble funnet at tumorveksten ble hemmet etter behandling. Tumor hemming priser var 46,19% og 49,56% i eggstokkene og hepatocellulære tumormodeller, henholdsvis. Re-ekspresjon av hSulf-1 resulterte i nedregulering av fosforylert VEGFR-2 og fosforylert AKT, da betydelig redusert tumormicrovessel tetthet, noe som indikerer at hSulf-1-ekspresjonen var forbundet med antiangiogenesis.
Avgjørende, hSulf-1 er et sulfatase som fungerer for å desulfate celleoverflate HSPGs. Det kan hemme den nedstrøms kinase fosforylering med et bredt spektrum og negativt regulerer reseptor-tyrosin-kinase signalering. Denne studien ga en overbevisende bevis for å vise at hSulf-en re-uttrykk både i eggstokkene og hepatocellulære kreftceller demper fosforylering av VEGFR-2, deretter undertrykker kreft celleproliferasjon og angiogenese, endelig induserer antitumor effekt. Derfor våre data antydet at hSulf-1-mediert antiproliferation og antiangiogenesis kan være en rimelig tilnærming for kreftbehandling.
Materialer og Metoder
Undersøkelser av hSulf-en og VEGFR-2 uttrykk i klinisk kreftprøver
uttrykk for hSulf-en ble oppdaget av immunhistokjemi i 87 tilfeller av kliniske kreftprøver, inkludert 26 hepatocellulært karsinom, 12 bryst kreft, 22 mage kreft, 9 nyrekreft, 18 tykktarm kreft, og deres tilstøtende normalt vev. VEGFR-2, inkludert t-VEGFR2 og p-VEGFR2
Tyr1175, ble også påvist i 26 levercellekarsinom av immunhistokjemi. Prøvene ble fiksert i 10% nøytralt formaldehyd i 6 timer, parafin-innleiret, og skiver i 5 um tykke seksjoner for immunhistokjemi med et kanin anti-hSulf-1-antistoff (Abcam inc., Cambridge, MA), et kanin anti- VEGFR-2 antistoff og en kanin anti-Phospho-VEGFR2
Tyr1175 antistoff (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). Godkjenning for bruk av kliniske prøver ble gitt av etikkomiteen, The Second Military Medical University Research, og vi har fått skriftlig informert samtykke fra alle deltakerne i studien.
Utarbeidelse av vektorer og adenoviruses
plasmid pcDNA3.1-hSulf1 inneholder hele lengde hSulf-en cDNA og vektor pSUPER.retro.puro inneholder hSulf-en shRNA (19 oligonukleotid parene rettet mot hSulf-en cDNA posisjonerer 294-312: GTATGTGCACAATCACAAT) var velvillig begavet fra Viji Shridhar (Department of Experimental patologi, Mayo Clinic Cancer Center, Rochester, MN). Vektoren pGenesil-1.1 inneholder VEGFR-2 shRNA (19 oligonukleotid parene rettet mot VEGFR-2 cDNA posisjonerer 525-543: CAGAATTTCCTGGGACAGC) eller negativ kontroll shRNA (19 oligonukleotid par: gacttcataaggcgcatgc) ble kjøpt fra Wuhan Genesil Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, Kina).
Sette sammen adenovirus vektor, ble pcDNA3.1-hSulf1 brukes til å forsterke hSulf-en cDNA med primere P1 (5′-cgggatccaccatgaagtattcttgc-3 «) og P2 (5» gcgtcgacttaaccttcccatccatcccataac-3 «). PCR-produktet ble spaltet med BamHI og Sall, og deretter ført inn i adenovirus plasmid pDC315 (Microbix Biosystems, Ontario, Canada) for å generere pDC315-hSulf1. Plasmidene pDC315-hSulf1 og pDC315-EGFP ble transfektert, henholdsvis i HEK293 celler (Microbix Biosystems, Ontario, Canada) bruker PolyFect Transfeksjon Reagens (Qiagen Inc., Valencia, CA) sammen med adenovirus emballasje plasmid pBHGloxdelE13cre (Microbix Biosystems, Ontario, Canada). Etter en homolog rekombinasjon i HEK293 celler, fikk vi adenoviruses heter Ad5-hSulf1 og Ad5-EGFP. Ad5-EGFP ble anvendt som viruskontroll. Alle adenovirus ble forsterket i HEK293 celler og renset ved ultrasentrifugering på cesium klorid (CsCI) gradienter. De virale titere ble detektert med den Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50) metoden [32] etablert av Qbigene Inc. (IIIkich, Frankrike), og viste da pestdannende enheter per milliliter (pfu /ml).
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og transfektanter
eggstokkreft cellelinje SKOV3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), den leverkreft cellelinje BEL-7404 (Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina ) ble dyrket i media i henhold til tilbydernes anbefalinger. Når cellene var i logaritmisk fase, ble de infisert med adenovirus Ad5 (-hSulf1 eller Ad5-EGFP) ved mois på 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 pfu /celle, og høstet 48 timer etter infeksjon. Virus-infiserte celler og deres parentale celler ble transfektert med hSulf-1 shRNA og VEGFR-2 shRNA vektorer ved å bruke PolyFect Transfection Reagent (Qiagen Inc., Valencia, CA) i henhold til leverandørens protokoll. Tjuefire timer senere, puromycin (3 pg /ml) eller G418 (400 ug /ml) ble tilsatt for å velge hSulf-1 shRNA transfektanter eller VEGFR-2 shRNA transfektanter, respektivt. Etter kontinuerlig dyrket i 24 timer ble cellene høstet og stillheten av målet genuttrykk ble testet.
In vitro
undersøkelse av samsvarende faktor uttrykk
Kreftceller, inkludert foreldre, virus-infiserte og shRNA transfekterte cellene ble høstet 48 timer etter infeksjon eller transfeksjon. Total RNA ble ekstrahert fra 10
5 celler med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og anvendt for å forsterke hSulf-1-ekspresjonen ved revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR), med primere P3 (5′- ccaccttcatcaatgcctt -3 «) og P4 (5′-ccttgaccagtccaaactgc-3′). De forsterkede fragmenter var 762 bp. Glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble amplifisert med primerne P5 (5»-accacagtccatgccatcac-3 «) og P6 (5′-tccaccaccctgttgcttgta-3») som en indre kontroll. Totalt protein ble ekstrahert fra 10
5 celler ved hjelp av M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL) og undersøkt ved hjelp av Western-blotting som beskrevet tidligere [33], med de angitte primære antistoffer, inkludert kanin anti-VEGFR -2 og kanin anti-Phospho-VEGFR-2
Tyr1175 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA).
Celleviabilitet av MTT-analyse
foreldre~~POS=TRUNC, virus- infiserte og shRNA transfekterte celler ble fortynnet i en konsentrasjon på 10
5 celler /ml og sådd ut i tetthet på 100 ul /brønn i 96-brønners plater. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse ved bruk av celleproliferasjon Kit I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) som ovenfor beskrevet [34]. Gjennomsnittlig absorbans for hver prøve ble undersøkt med en mikroplateavleser (modell 550, Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan) ved en bølgelengde på 570 nm med en referansebølgelengde på 655 nm.
Dyremodeller og
in vivo
eksperimenter
SKOV3 og BEL-7404 celler ble subkutant injisert i de riktige flankene av BALB /c (nu /nu) mus (Shanghai Experimental Animal Center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) , 10
7 celler per mus, for å etablere xenografter. Tre uker senere ble musene delt tilfeldig inn i 3 grupper: Ad5-hSulf1, Ad5-EGFP og kontrollgrupper, 5 mus pr gruppe. Mus i Ad5-hSulf1 og Ad5-EGFP grupper ble gitt 5 intratumorale injeksjoner, en injeksjon annenhver dag, med en totaldose på 10
9 pfu virus per mus. Mus i kontrollgruppen ble gitt det samme volum av viral bevaring oppløsning (10 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 2 mmol /l MgCl
2, 4% sukrose). Tumorstørrelse ble målt regelmessig, og tumor volum ble beregnet med formelen «
en
×
b
2 × 0,5″, der
en
og
b
representerer maksimal og minimal diameter. Mus ble avlivet ved slutten av observasjonsperioden, og tumorene ble fjernet, veiet og fiksert i 10% nøytralt formaldehyd i 6 timer. De parafininnstøpte påfølgende seksjoner ble kuttet for å undersøke uttrykket av hSulf-1, t-VEGFR2 p-VEGFR2
Tyr1175 og t-AKT, p-AKT
Thr308 av immunhistokjemi og western blotting. Kaninen anti-Phospho-AKT
Thr308 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California). MVD verdi i tumorvev ble utført ved CD31 immunhistokjemi hjelp av en rotte-anti-muse-CD31-monoklonalt antistoff (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). De positive celle prosenter og MVD verdi i svulster ble talt opp innen 5 tilfeldige høy effekt felt (opprinnelig forstørrelse × 400) under mikroskop, og vist som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) [35].
