Abstract
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra alle gynekologisk kreft og konvensjonelle behandlinger som kirurgi, cellegift, og strålebehandling vanligvis ikke klarer å kontrollere fremskredne stadier av sykdommen. Det er derfor et stort behov for alternative og innovative behandlingsalternativer. Vi grunn at kreft genterapi ved å bruke en vektor som er i stand til spesifikt å levere et enzym-kodende genet til eggstokkreft celler vil tillate kreftcelle for å forbrenne en uskadelig prodroge inn i en potent cytotoksinet, som vil føre til terapeutiske effekter. I denne studien undersøker vi bruken av et humant papillomavirus (HPV) pseudovirionbasert for å levere et herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-tk) genet til ovarietumorceller. Vi fant at HPV-16 pseudovirionbasert var i stand til fortrinnsvis å infisere murine og humane ovarie tumorceller når de administreres intraperitonealt. Videre intraperitoneal injeksjon av HPV-16 pseudovirions bærer HSV-tk-genet, etterfulgt av behandling med ganciclovir ført til betydelige terapeutiske anti-tumoreffekter i muse-ovarie cancer-bærende mus. Våre data antyder at HPV pseudovirionbasert kan tjene som en potensiell levering kjøretøy for ovarian cancer genterapi
relasjon:. Hung C-F, Chiang AJ, Tsai H-H, Pomper MG, Kang TH, Roden RR, et al. (2012) Ovarian Cancer Gene Therapy Ved hjelp av HPV-16 pseudovirionbasert Bæring av HSV-tk Gene. PLoS ONE syv (7): e40983. doi: 10,1371 /journal.pone.0040983
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 15 mars 2012; Godkjent: 15 juni 2012; Publisert: 17.07.2012
Copyright: © 2012 Hung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute spesialiserte programmer for fremragende forskning (https://trp.cancer.gov/) i livmorhalskreft P50 CA098252, CA118790 (Roden), og CA122581 (Roden). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Eggstokkreft er den ledende årsak til død av alle gynekologiske kreftformer og den sjette vanligste kreftformen for kvinner i USA [1], [2]. Selv om betydelige fremskritt har skjedd i både kirurgiske og kjemoterapeutiske teknikker, den samlede 5-års overlevelse for alle stadier av eggstokkreft forbli 50% [2], [3]. Nåværende behandlingsformer (kirurgi, cellegift og strålebehandling) vanligvis ikke klarer å kontrollere avanserte stadier av sykdommen. Derfor kan alternative terapeutiske tilnærminger tjene som viktige metoder for å kontrollere disse avansert stadium ovarietumorer.
En mulig tilnærming er bruk av selvmord genterapi (SGT). Med SGT, er genet for en fremmed enzym (dvs. en fra et virus, bakterier eller gjær) spesifikt levert til kreftceller. Gene levering følges av systemisk administrasjon av en giftfri prodrug. De infiserte kreftceller er i stand til å uttrykke fremmede enzym for å omdanne prodrug til en aktiv cytotoksinet, som er i stand til å drepe infiserte celler. Én fordel SGT har fremfor konvensjonelle genterapi er dens evne til å drepe nabocellene gjennom bystander virkning. Det aktive stoffet kan unnslippe transduced celler og diffus i nabo ikke-infiserte celler, til slutt fører til deres død også. De døende celler er også i stand til å indusere naturlig dreper (NK) celler og T-celler for å indusere en fjern bystander effekt. Den håp for denne tilnærming er å ha stor spesifisitet for tumorceller, særlig kreft stamceller. Denne tilnærmingen bør også redusere de toksiske bivirkningene forbundet med konvensjonelle kreft terapi på grunn av økt spesifisitet av både levering og aktivering av cytotoksinet [4].
Den mest studerte selvmordsgen /prodrug system er en kombinasjon av herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-tk) med ganciclovir (GCV) [5]. HSV-tk, som har høy affinitet for ganciclovir, katalyserer den første fosforyleringen av GCV det kan da være di- og tri-fosforyleres av cellulære kinaser. Triphosphorylated GCV kan bli innarbeidet i replikerende DNA, noe som fører til hemming polymerase og til slutt apoptose [4] – [6]. Dette systemet har vist en viss suksess i klinikken, men dens nytte er begrenset av sin avhengighet av celle-til-celle kontakt og gap veikryss for Tilskuereffekten [4].
5-8 uker gamle C57BL /6 mus ble utfordret med MOSEC tumorceller (1 × 10
6 celler /mus). En uke senere, tumor-bærende mus ble injisert intraperitonealt med eller uten HPV-16 /luc pseudovirions (20 ug HPV-16 L1 protein /mus, tilsvarende 120 ng DNA /mus). Naive mus infisert med eller uten HPV-16 /LUC pseudovirions tjente som en kontroll. Mus ble fotografert av ikke-invasiv luminescens bildebehandlings en dag etter smitte. Viste data er representative for 2 eksperimenter utført.
For denne studien bruker vi replikering-defekt humant papillomavirus (HPV) pseudovirions å levere HSV-tk genet til ovarietumorceller. Nyere studier viser DNA-plasmider som kan pakkes inn i papillomavirus L1 og L2-kapsidproteiner å generere den «pseudovirionbasert» som kan effektivt levere DNA i flere cellelinjer [7] – [9]. Den innkapsling beskytter også DNA fra nukleaser og gir en målrettet levering med stor stabilitet. Mange av de sikkerhetsproblemer som er knyttet til bruken av levende virale vektorer avhjelpes som HPV pseudovirions inneholde en DNA-konstruksjon er forskjellig fra den naturlige HPV virusgenomet. Det er også over 100 typer papillomavirus pseudovirions, som gjør det mulig for gjentatte øke bruk av ulike typer siden de nøytraliserende antistoffer mot én type er vanligvis ikke kryssreagerer med andre typer.
Her utforsker vi bruk av HPV pseudovirions til levere markørgener og selvmordsgener til både murine og humane ovarietumorceller. Vi fant at intraperitoneal injeksjon av HPV-16 pseudovirions ført til fortrinnsrett infeksjon av ektopisk og spontant forekommende murine eggstokkreft hos mus. Fortrinnsrett smitte også forekommet i menneskelige eggstokkene tumorxenotransplantater av tumorbærende mus. Intraperitoneal injeksjon av HPV-16 pseudovirions bærer HSV-tk-genet, etterfulgt av administrasjon av ganciclovir ført til betydelige terapeutiske anti-tumoreffekter i muse-ovarie cancer-bærende mus. Våre data viser proof-of-prinsippet om at HPV pseudovirions kan være nyttige vektorer for å levere terapeutiske gener til eggstokkreft.
5-8 uker gamle nakne mus ble injisert intraperitonealt med ES2 menneskelige ovarietumorceller (1 × 10
6 celler /mus). En uke senere, tumor-bærende mus ble injisert intraperitonealt med villtype (wt) HPV-16 /Luc PSV eller mutant L2 (mtL2) HPV-16L1mtL2-Luc pseudovirions (20 ug HPV-16 L1 protein /mus, tilsvarende 120 ng DNA /mus). Naive mus infisert med wt eller mt HPV-16 /LUC pseudovirions fungerte som kontroller. Mus ble fotografert av ikke-invasiv luminescens bildebehandlings en dag etter smitte. Viste data er representative for 2 eksperimenter utført.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene fra Guide for Stell og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle prosedyrer ble utført med forhåndsgodkjenning av Johns Hopkins Animal Care og bruk Committee (protokoll MO08M446).
Mus
C57BL /6 og naken (BALB /c nu /nu) mus var ervervet fra National Cancer Institute.
MISIIR-TAG
transgene mus [10] ble vennlig levert av Dr. Denise Connolly på Fox Chase Cancer Center. Alle dyrene ble opprettholdt under spesifikke patogen-frie forhold, og alle prosedyrer ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller og i samsvar med anbefalinger for riktig bruk og stell av forsøksdyr.
C57BL /6 mus og
MISIIR -TAG
transgene mus ble injisert med 20 mikrogram av HPV-16 /Luc PSV ved intraperitoneal injeksjon 10 uker etter fødselen. Luminescens bildene ble tatt en dag etter at HPV-16 /luv PSV injeksjon.
Top,
Representative luminescens bilder av PSV-infiserte C57BL /6 mus eller
MISIIR-TAG
transgene mus (til venstre) og deres høstet organer (til høyre). Merk: Hvit pil viser bare eggstokkreft fra MISRII transgene mus kan bli smittet av HPV-16 /Luc PSV.
Bottom,
Representative søylediagrammer av luminescens bildebehandling i MISIIR-Tags transgene mus eller C57BL /6 mus. Data som representerer 2 eksperimenter utført.
Cellelinjer
293TT celler ble vennlig levert av J Schiller (National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH)) [11 ]. Den MOSEC cellelinje (en mus eggstokkreft-cellelinje) ble fremstilt som tidligere beskrevet [12]. Den ES2 cellelinje (en human ovarian cancer-cellelinje) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. MOSEC /luciferase (MOSEC-luc) celler ble samlet som tidligere beskrevet [13].
MOSEC-Luc-celler ble infisert HPV16-GFP PSV, eller HPV16 /HSV-tk PSV ved en konsentrasjon på 1 ug L1 protein /ml i 48 timer. De infiserte celler ble sådd i 96-brønners plater og deretter behandlet med 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml eller 10 pg /ml av Ganciclovir i 72 timer. Luciferaseekspresjon ble undersøkt av IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Viste data er representative for 2 eksperimenter utført.
Plasmider
De plasmider som koder HPV16 L1 L2 (pShell16) ble vennlig levert av Dr. J Schiller (NCI). Punktmutasjonen HPV16L1 mtL2 konstruksjon er beskrevet i vårt tidligere studium [14]. Genereringen av luciferase-uttrykkende plasmid (pcDNA3-luciferase) og GFP-uttrykkende plasmid (pcDNA3-GFP) er blitt beskrevet tidligere [15], [16]. Den pORF-HSVtk plasmid ble kjøpt fra InvivoGen.
HPV pseudovirionbasert Produksjons
HPV16-GFP, HPV16-Luc (luciferase), HPV16-tk (HSVtk Herpes simplex virus-tymidinkinase) pseudovirions var gjøres ved hjelp av de fremgangsmåter som tidligere beskrevet [11]. Kort fortalt ble 293TT celler transfektert med HPV ekspresjonsplasmider pShell16 og plasmidene valg (som GFP, luciferase eller HSVtk) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Etter 48 timer ble cellene høstet og vasket med Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (PBS) (Invitrogen) supplert med 9,5 mM MgCl
2 og antibiotika-antimykotisk blanding (DPBS-Mg) (Invitrogen). De ble suspendert i DPBS-Mg celler supplert med 0,5% Brij58, 0,2% Benzonase (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA), og 0,2% Plasmid Safe (Epicentre Bioteknologi, Madison, WI, USA) ved 100 × 10
6 celler /ml og inkubert ved 37 C i 24 timer for kapsid modning. Etter modning ble cellelysatet avkjølt på is i 10 min. Saltkonsentrasjonen av cellelysatet ble justert til 850 mM og inkubert på is i 10 min. Lysatet ble deretter klaret ved sentrifugering, og supernatanten ble lagt på en Optiprep gradient. Gradienten ble sentrifugert i 4,5 timer ved 16 C ved 40 000 r.p.m. i en SW40 rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Renheten av HPV pseudovirions ble evaluert ved å kjøre fraksjoner på 4-15% gradient natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese. Den innkapslede DNA plasmid ble kvantifisert ved å trekke innkapslet DNA fra Optiprep fraksjoner fulgt av kvantitativ real-time PCR sammenligninger med serielle fortynninger av nakent DNA. Konsentrasjonene av plasmider (GFP, luciferase, eller HSVtk) i pseudovirions ble bestemt til å være ca. 6,2 ng DNA pr 1 ug av L1-protein.
In vitro
Infeksjon av tumorceller etter HPV16 Pseudovirions
MOSEC eller ES2-celler ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 5000 celler /brønn og dyrket over natten. Cellene ble infisert med HPV-16 /Luc PSV (1 pg L1 protein /ml) i 72 timer. Luciferin (15 ug /ml) ble tilsatt og inkubert i 10 min. En integrering tid på 10 sek ble brukt for luminescens bilde oppkjøpet av IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA).
Karakterisering av Tumor Infeksjon med HPV16 Pseudovirions i Mus
C57BL /6 mus (5 per gruppe) ble injisert intraperitonealt med 1 × 10
6 MOSEC celler /mus. En uke senere, tumor-bærende mus ble injisert intraperitonealt med HPV-16 /Luc PSV i en dose på 20 ug HPV-16 L1 protein /mus (tilsvarende 120 ng DNA /mus). Luminescens bildene ble tatt opp dagen etter HPV-16 /Luc PSV injeksjon. En integrasjonstid på 2 minutter ble anvendt for luminescens bildeopptak.
For karakteriseringen av infeksjon av humane eggstokkreft celler av HPV-16 /Luc PSV, ble nakne mus utfordret med ES2 humane ovarietumorceller ved en dose på 1 x 10
6 celler /mus. En uke senere, tumor-bærende mus ble injisert intraperitonealt med villtype (wt) HPV-16 /Luc PSV eller mutant (mt) HPV-16L1mtL2-Luc PSV i en dose på 20 ug HPV-16 L1 protein /mus (tilsvar til 120 ng DNA /mus). Naive mus uten svulster infisert med wt eller mt HPV-16 /Luc PSV fungerte som kontroller. Luminescens bildene ble tatt dagen etter at HPV-16 /Luc PSV injeksjon. Musene ble injisert med 0,2 ml av 15 mg /ml bille luciferin (kaliumsalt; Promega). Etter 10 minutter ble musene avbildes ved hjelp av IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). En integrering tid på 30 sek ble brukt for luminescens image oppkjøpet.
In vitro
Cytotoksisitet mediert av HPV16-TK Pseudovirions og ganciklovir
MOSEC-Luc celler ble infisert HPV16- GFP PSV eller HPV16-TK PSV (1 pg L1 protein /ml) i 48 timer. De infiserte celler ble sådd i 96-brønners plater. De infiserte celler ble behandlet med 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml eller 10 pg /ml av ganciclovir i 72 timer og luciferase-ekspresjon ble undersøkt ved IVIS 200 system (Xenogen Corp, Alameda, CA, USA ).
In vivo
Cytotoksisitet formidlet av HPV16-TK Pseudovirions og ganciklovir
mus ble injisert intraperitonealt med 1 × 10
6 MOSEC-Luc celler /mus på dag 1. Luciferase-aktivitet ble undersøkt på dag 2 som en indikasjon på antall tumorer i mus. Musene ble injisert med 0,2 ml av 15 mg /ml bille luciferin (kaliumsalt; Promega). Etter ti minutter ble musene avbildes ved hjelp av IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). En integrasjonstid på 2 minutter ble anvendt for luminescens bildeopptak. Mus ble injisert med HPV16-GFP PSV (20 ug L1-protein), eller HPV16-TK PSV (20 ug L1-protein) på dag 3. Mus ble daglig behandlet med ganciclovir (50 mg /kg) eller PBS fra dag 5 til dag 18. mus ble fotografert igjen av ikke-invasiv luminescens bildebehandling på dag 20.
Resultater
intraperitoneal injeksjon av HPV-16 Pseudovirions fører til Fortrinnsrett Infeksjon i Murine eggstokkreft celler i tumor-bærende mus
Vi først undersøkt om HPV-16 pseudovirionbasert bærer luciferase genet (HPV-16 /Luc PSV) var i stand til å infisere murine eggstokkreft cellelinje, MOSEC,
in vitro
. Som vist i fig S1, HPV-16 /Luc PSV var i stand til å infisere MOSEC tumorceller
in vitro
. For å påvise om HPV-16 /Luc PSV kan også infisere den murine ovarian cancer cellelinje i tumorbærende mus, vi først injisert intraperitonealt mus med MOSEC tumorceller. De tumor-bærende mus ble injisert intraperitonealt med HPV-16 /Luc PSV en uke senere. Som vist i Figur 1, mens musene uten tumorer ikke viste noen luciferase-aktivitet, tumor-bærende mus som injisert intraperitonealt med HPV-16 /Luc PSV demonstrerte betydelig luciferase-aktivitet. Disse dataene antyder at HPV pseudovirionbasert fortrinnsvis infiserer tumorceller i tumorbærende mus.
intraperitoneal injeksjon av HPV-16 Pseudovirions fører til Fortrinnsrett smitte av humant eggstokkreft celler i tumorbærende nakne mus
Vi videre undersøkt om HPV-16 /Luc PSV var i stand til å infisere menneske eggstokkreft cellelinje ES2. Som vist i fig S2, ES2 celler infisert med HPV-16 /Luc PSV viste luciferase-aktivitet, noe som antyder at HPV-16 /Luc PSV var i stand til å infisere humane eggstokkreft celler
in vitro
. Vi kjennetegnes også
in vivo
smittsomhet av HPV-16 /Luc PSV i nakne mus med ES2 menneskelige ovarietumorer å avgjøre om smittsomhet av HPV pseudovirions er avgjørende for effektiv genet levering til ovarietumorceller av HPV pseudovirions. Det er nå klart at HPV-L2 mindre kapsidprotein er essensielt for effektiv infeksjon av celler ved HPV pseudovirions [14], [17]. Derfor har vi ansatt HPV-16 /Luc PSV med en enkelt aminosyre mutasjon i HPV L2 (HPV16L1mtL2-Luc PSV) som opphever smittsomhet av pseudovirions [14]. Som vist i figur 2, bare nakne mus som bærer humane ovarietumorer vist stort luminescens sammenlignet med den ikke-tumorbærende nakne mus. Videre er bare tumor-bærende mus infisert med HPV-16 /luc PSV men ikke mutant HPV-16 /L1mtL2- luc PSV vist stort luminescens (fig. 2). Dermed våre data viser at HPV-16 pseudovirions kan også fortrinnsvis infisere humane ovarietumorceller
in vivo
. Videre våre data indikerer at intakt HPV L2 er avgjørende for effektiv levering av innkapslet gener til ovarietumorceller av HPV pseudovirions.
HPV-16 /Luc PSV fortrinnsvis infiserer ovarietumorer i
MISIIR-tag
transgen mus
Vi videre undersøkt fortrinnsrett infeksjon av ovarietumorceller av HPV pseudovirions i
MISIIR-TAG
transgene mus, en spontant forekommende murine ovarial tumor modell. Denne transgene mus som uttrykker trans området av SV40 under kontroll av den Mullerian inhiberende substans type II reseptor-gen-promoteren, har vist seg å utvikle bilaterale ovarietumorer. Dermed blir spontan eggstokkreft modell i
MISIIR-TAG
transgene mus mer ligner menneskelig eggstokkreft enn en transplantasjon modell som MOSEC tumor modell.
MISIIR-TAG
transgene mus har blitt rapportert spontant utvikle ovarialcancer innen 6-13 uker etter fødsel [10]. I vår lab, alt av
MISIIR-TAG
transgene mus (fra en ny linje ervervet fra Dr. Connolly) utviklet ovarietumorer innen 4 måneder etter fødselen. Vi injisert HPV-16 /Luc PSV 10 uker etter fødselen, og vi fant at HPV-16 /Luc PSV kan også fortrinnsvis infisere spontant forekommende eggstokkreft i
MISIIR-TAG
transgene mus (Fig. 3). Videre observerte vi at de vitale organer, inkludert lunger, hjerte, mage, milt og nyre ikke var infisert. I tillegg ble ingen luciferase-aktivitet observert i de normale eggstokkene til C57BL /6 mus injisert med HPV-16 /luc PSV. Således våre data indikerer at HPV-16 pseudovirions selektivt kan infisere ovarietumorceller i et spontant forekommende murine eggstokktumormodell.
Infeksjon av HPV-16 Pseudovirions Bære HSV-tk-genet, etterfulgt av behandling med Ganciclovir fører til
in vitro
Cytotoksisitet av infiserte celler
den preferanse smitte av HPV-16 pseudovirions i ovarietumorceller åpner for muligheten til å spesifikt bære terapeutisk DNA til ovarietumorceller for kontroll av ovarietumorer. Fordi den begynnende behandling med HPV pseudovirions vil kanskje ikke være i stand til å infisere alle de ovarietumorceller, er det viktig å vurdere en strategi som tillater at ovarietumorceller ikke direkte infisert å også bli utsatt. Derfor, valgte vi HSV-tk /ganciclovir system, fordi det er den mest studerte selvmord genterapi system og over to tiår med forsøk på å bruke systemet som et anticancerterapi har vist varierende suksess. For å påvise om HPV-16 /HSV-tk PSV kan infisere ovarietumorceller og gjøre dem mottagelige for å drepe ved behandling med ganciclovir, infiserte vi MOSEC-Luc-celler med HPV16-GFP PSV, eller HPV16 /HSV-tk PSV i 48 timer. De infiserte celler ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ganciclovir og luciferase-ekspresjon i de infiserte cellene ble målt ved anvendelse av IVIS 200-systemet. Som vist i figur 4, MOSEC-Luc tumorceller infisert med HPV-16 /HSV-tk PSV etterfulgt av behandling med ganciclovir resulterte i celledød av de infiserte cellene
in vitro.
Dette ble ikke observert i celler som var infisert med HPV-16 /GFP. Vi observerte også at høyere konsentrasjoner av ganciclovir førte til mer celledød. Lignende effekter ble sett når tilsvarende analyser ble utført med human ovarian cancer cellelinje ES2 (se fig S3).
intraperitoneal injeksjon av HPV-16 Pseudovirions Bære HSV-tk-genet, etterfulgt av behandling med Ganciclovir som fører til betydelige antitumor effekter i Murine Ovarian Cancer-bærende mus
Vi videre bestemt om MOSEC tumorbærende mus infisert med HPV-16 /HSV-tk PSV etterfulgt av behandling med ganciklovir kunne utvise terapeutiske antitumor effekt. Musene ble injisert med MOSEC-Luc tumorceller og deretter behandlet med HPV-16 /HSV-tk PSV eller HPV-16 /GFP PSV ved hjelp regime som beskrevet i figur 5. Musene ble deretter behandlet med ganciclovir og tumorvekst ble overvåket ved hjelp et luminescens bildebehandlingssystem. Som vist i figur 5, tumorbærende mus behandlet med HPV-16 /HSV-tk PSV etterfulgt av behandling med ganciclovir viste signifikant bedre terapeutiske antitumoreffekter enn mus behandlet med HPV-16 /GFP PSV etterfulgt av behandling med ganciclovir. Disse data tyder på HPV-16 pseudovirionbasert kan benyttes til effektivt å levere HSV-tk-genet for å ovarietumorceller for å gjengi ovarietumorceller mer mottakelige for behandling med ganciclovir.
C57BL /6 mus (5 pr gruppe) ble injisert intraperitonealt med 1 x 10
6 MOSEC-Luc celler per mus på dag 1. Luciferase-aktivitet ble undersøkt på dag 2 som indikasjon på antall tumorer i mus. Mus ble injisert HPV16-GFP PSV (L1-protein 20 ug), eller HPV16 /HSV-tk PSV i en dose på L1 protein (20 ug /mus) på dag 3. Mus ble daglig behandlet med ganciclovir i en dose på 50 mg /kg eller PBS fra dag 5 til dag 18. Mus ble fotografert av ikke-invasive luminescens avbildningsteknikker på dag 20. Viste data er representative for 2 eksperimenter utført.
Diskusjoner
Den vellykkede anvendelse av HSV-tk-genet for ovarian cancer genterapi ved bruk av HPV pseudovirions antyder at andre egnede kandidatgener kan også bli levert av HPV pseudovirionbasert til ovarietumorer for eggstokkreft genterapi. Flere kandidatgener for enzym prodrug kombinasjoner for selvmord genterapi har blitt rapportert inkludert cytosin deaminase [18], [19], nitroreductase [20], karboksylesterase [21], cytokrom P450 [22] og purinnukleosidfosforylase [23]. Som HSV-tk kan enzymene som kodes for av disse genene omdanne de ikke-toksiske prolegemidler til medikamenter som er i stand til å blokkere DNA-syntese, resulterer i eventuell celledød, så vel som bystander effekter for å drepe flere nabotumorceller.
For fremtidig klinisk oversettelse, vil det være viktig å vurdere sikkerhetsmessige hensyn til både HSV-tk /GCV system og leveringsmiddelet. Imidlertid har kreft genterapi ved hjelp av HSV-tk blitt mye brukt. Mange kliniske forsøk med denne tilnærmingen er utført hos pasienter med hjernesvulst og ingen alvorlige bivirkninger ble rapportert (for oversikt se [24], [25]). På den annen side er fremstillingen av HPV DNA pseudovirionbasert som avleveringsbærere vil trolig kreve ytterligere utvikling for å forbedre dens sikkerhetsprofil. Den nåværende cellelinje som brukes for å generere pseudovirions inneholder SV40 stort T-antigen, som er et oncoprotein, og dermed hever noen mulige sikkerhetsproblemer. En alternativ tilnærming ved hjelp av gjær for å fremstille pseudovirions har blitt beskrevet [26]. Masseproduksjon av HPV pseudovirions vil også trolig kreve effektive standardiserte protokoller for å generere store titere av smittsomme HPV pseudovirions for klinisk oversettelse.
I denne studien har vi demonstrert fortrinnsrett infeksjon av murine og humane ovarietumorer av HPV-16 pseudovirionbasert. Våre funn er i samsvar med tidligere studier av Roberts et al. ved hjelp av en naken mus modell for peritoneal formidling av human ovarian cancer cellelinje, Shin3 [27]. De fant også at HPV pseudovirionbasert administrert intraperitonealt infiserte eggstokkene tumor vev med høy spesifisitet mens hoppe normale peritoneal vev overflater. Imidlertid kan forskjellige typer av HPV pseudovirionbasert viser forskjellige tumor- og /eller vev tropisms. For eksempel, Cerio et al, har vist at en HPV-16, men ikke HPV-45, pseudovirus kunne infisere SWA-G humane ovarietumorceller
in vitro product: [28]. Deres data tyder på at pseudovirus infeksjon av humane tumorer kan være HPV-type og tumor-spesifikke. Derfor er det viktig å ytterligere identifisere de riktige typer HPV pseudovirionbasert for fremtidig kreft genterapi.
mekanismer for preferanse infeksjon av ovarietumorceller av HPV pseudovirions uklare. I vår studie, viste vi at en intakt L2 er avgjørende for smittsomhet av HPV-16 pseudovirionbasert i ovarietumorer (se figur 2). HPV adgang til målceller har vist seg å være initiert ved først å binde seg til heparin sulfonerte proteoglykan (HSPG) celleoverflatefestefaktorer. HPV-virale partikler deretter gjennomgå en konformasjonsendring som eksponerer den N-terminale ende av L2 mindre kapsidprotein til furin spalting [29], [30]. Den proteolyse av L2 eksponerer en tidligere okkludert flate av L1 som binder seg til en foreløpig ubestemt celleoverflatereseptor på celler, som antas å være ansvarlig for partikkelinternalisering (for oversikt se [31]). Det har også vist seg at de fleste ovarie cancer-cellelinjer oppregulere ekspresjonen furin [32]. Således er det tenkelig at oppregulering av furin uttrykk kan bidra til den preferensielle smitte av ovarial tumor ved HPV pseudovirions. Vi kan også utelukke at fortrinnsrett infeksjon er en gjenstand av aging svulst cellene
in vitro
siden fortrinnsrett infeksjon ble observert i spontant forekommende eggstokktumor modell (se figur 3). Det vil være viktig å viderekarakterisere mekanismer for fortrinnsrett infeksjon av ovarietumorceller av HPV pseudovirions. Slik informasjon vil være nyttig for å forbedre den spesifikke levering av genet av interesse for ovarietumorceller bruker HPV pseudovirions.
I sammendraget, fant vi at intraperitoneal injeksjon av HPV-16 pseudovirions fører til fortrinnsrett infeksjon av mus og menneskelig eggstokkreft kreftceller i tumorbærende mus. Videre kreft genterapi ved hjelp av HPV pseudovirions bærer HSV-tk var i stand til å spesifikt rettet mot ovarietumorer, noe som resulterer potente terapeutiske antitumor effekt mot ovarietumorer. Det vil være viktig å videre identifisere de mest egnede genterapi kandidater og terapeutiske regimer for fremtidige studier mot klinisk oversettelse.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Karakterisering av infeksjon av MOSEC kreftceller ved HPV-16 pseudovirions
in vitro
. MOSEC celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 5000 celle /brønn natten før infeksjon. Seeded MOSEC Cellene ble så infisert med HPV-16 /Luc PSV (1 pg L1 protein /ml) i 72 timer og luciferase-ekspresjon ble undersøkt ved den IVIS 200 system (Xenogen Corp, Alameda, CA, USA). Luminescens bilder av MOSEC eggstokkreft cellelinje (øverst). Søylediagram som viser den totale fotontellinger for hver brønn (nederst). Merk: HPV-16 pseudovirions effektivt kan infisere MOSEC mus eggstokkreft
in vitro
. Viste data er representative for 2 eksperimenter utført
doi:. 10,1371 /journal.pone.0040983.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Karakterisering av infeksjon av ES2 menneskelige eggstokkreft celler av HPV-16 pseudovirions
in vitro
. ES2 humane ovarietumorceller ble sådd på 96-brønners plater i en tetthet på 5000 celler /brønn natten før infeksjon. Seeded ES2 Cellene ble så infisert med HPV-16 /Luc PSV (1 pg L1 protein /ml) i 72 timer og luciferase-ekspresjon ble undersøkt ved IVIS 200 system (Xenogen Corp, Alameda, CA, USA). Luminescens bilder av ES2 ovarian cancer-cellelinje (øverst). Søylediagram som viser den totale fotontellinger for hver brønn (nederst). Merk: HPV-16 pseudovirions effektivt kan infisere ES2 menneskelig eggstokkreft in vitro. Viste data er representative for 2 eksperimenter utført
doi:. 10,1371 /journal.pone.0040983.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
In vitro
cytotoksisitet mediert av HPV16-tk pseudovirions og ganciklovir. ES2-Luc-celler ble infisert HPV16-GFP PSV, eller HPV16 /HSV-tk PSV ved en konsentrasjon på 1 ug L1 protein /ml i 48 timer. De infiserte celler ble sådd i 96-brønners plater og deretter behandlet med 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml eller 10 pg /ml av Ganciclovir i 72 timer. Luciferaseekspresjon ble undersøkt av IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Viste data er representative for 2 eksperimenter utført
doi:. 10,1371 /journal.pone.0040983.s003 plakater (TIF)
Takk
Vi vil gjerne takke Katherine Liu ( JHMI) for utarbeidelse av manuskriptet.
