Abstract
Bakgrunn
Periostin er en viktig ekstracellulær matrix protein som er involvert i celleutvikling og heft. Tidligere har vi identifisert periostin å være oppregulert i aggressiv prostatakreft (CAP) ved hjelp av kvantitative glycoproteomics og massespektrometri. Uttrykket av periostin ble videre undersøkt i primær radikal prostatektomi (RP) prostatakreft og tilstøtende ikke-tumor prostata vev ved hjelp av immunhistokjemi (IHC). Våre IHC resultatene viste en lav bakgrunn periostin nivåer i de tilstøtende ikke-tumor prostata vev, men overexpressed periostin nivåer i peritumoral stroma av primære Cap svulster.
Metoder
I denne studien, periostin uttrykk i Cap ble videre undersøkt på flere microarray (TMA), som ble utført i fire laboratorier. For å oppnå konsekvent farging, ble alle TMA farget med samme protokoll og scoret av samme bildet beregning verktøy for å bestemme de totale periostin fargeintensitet. Den TMA ble ytterligere scoret av patologer å karakterisere stromal farging og epitel farging.
Resultater
periostin farging ble observert hovedsakelig i peritumoral stromale celler og i noen tilfeller i kreft epitelceller om sterkere farging ble funnet i peritumoral stromale celler. Både periostin stromal farging og epitel flekker kan skille BPH fra Cap inkludert lav karakter CAP (Gleason score ≤6), med betydelig p-verdi på 2.2E-16 og 0,001, henholdsvis. Periostin epitel flekker differensiert PIN fra lav karakter CAP (Gleason score ≤6) (p = 0,001), mens periostin stromal farging differensiert lav karakter Cap (Gleason score ≤6) fra høygradig Cap (Gleason score ≤6) (p = 1.7e -05). I tillegg ble det en positiv korrelasjon mellom total periostin farging og Gleason score observert (r = 0,87, p = 0,002).
Konklusjoner
Resultatene viste at periostin farging ble positivt korrelert med økende Gleason score og aggressivitet av prostata sykdom
Citation. Tian Y, Choi CH, Li QK, Rahmatpanah FB, Chen X, Kim SR, et al. (2015) Overuttrykte Periostin i Stroma positivt assosiert med aggressiv prostatakreft. PLoS ONE 10 (3): e0121502. doi: 10,1371 /journal.pone.0121502
Academic Redaktør: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, Israel
mottatt: 03.10.2014; Godkjent: 01.02.2015; Publisert: 17 mars 2015
Copyright: © 2015 Tian et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Early Detection Research Network (EDRN, U01CA152813) til HZ og Early Detection Research Network NCI CA86366 til DC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i vår forrige forsøk på å identifisere proteinforandringer mellom aggressive og ikke-aggressiv prostatakreft (CAP), vår gruppe analysert glucopeptidene isolert fra aggressive og ikke-aggressive prostatakreft ved kvantitative glycoproteomics hjelp iTRAQ merking av glycosite holdig peptider og tandem massespektrometri [1]. Vi identifiserte overekspresjon av tre glykoproteiner i aggressive Cap vev sammenlignet med ikke-aggressive Cap vev. To proteiner, cathepsin L og periostin, er ekstracellulære matriks (ECM) proteiner. Cathepsin L fungerer som en endopeptidase, noe som kan forringe mange intracellulære og ekstracellulære proteiner for å endre deres funksjon. Den andre protein, periostin, ble ytterligere bekreftet ved hjelp av immunoblotting og immunhistokjemi (IHC) analyserer [1]. Derfor våre observasjoner støtter en viktig rolle for svulsten mikromiljøet i Cap progresjon.
Periostin, også kjent som osteoblastspesifikk faktor 2 (OSF-2) er en evolusjonært konservert ECM protein og et medlem av fasciclin familien [2]. Det har vist seg at periostin virker sammen med andre ECM-proteiner, slik som fibronektin, kollagen V, og tenascin-C. Periostin samhandler også med ulike celleoverflatereseptorer, særlig inte, og signaler hovedsakelig via PI3-K /Akt og andre veier for å fremme cellevekst, celleoverlevelse, epitelial-mesenchymale overgang (EMT), invasjon, tumor angiogenese og metastase [ ,,,0],2-5]. Nyere studier har avdekket at periostin er involvert i utviklingen av ulike tumorer, slik som brystkreft, tykktarm, lunge, eggstokkreft og prostatakreft [6-11].
I denne studien ønsker vi å verifisere korrelasjon av periostin uttrykk og Cap aggressivitet. IHC ved hjelp periostin spesifikt antistoff ble utført for å vurdere ni TMA fra flere laboratorier, som består av i alt 3048 radial prostatektomi (RP) kjerner. For å oppnå konsekvent farging ble protokollene og reagenser enten sendt til redigerer laboratorier eller TMA ble sendt til vårt laboratorium for TMA farging. For å eliminere scoring variasjon fra individuelle laboratorier, var farget TMA skannes med samme scanner med samme innstillinger, og de skannede bildene ble scoret av samme bilde beregning verktøy for å bestemme de totale periostin fargeintensitet. Den TMA ble ytterligere scoret av patologer å karakterisere stromal farging og epitel farging.
Materialer og metoder
Material
Kanin antihuman periostin antistoff var fra Abcam (ab14041, Cambridge, UK); LSAB + System-AP kit fra Dako (Carpinteria, CA); og alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Tissue microarray (TMA)
TMA fra University of California Los Angeles (UCLA).
Tre TMA bestå av 197 kjerner av ikke-tumor prostata (NT), 140 kjerner av benign prostatahyperplasi (BPH), 64 kjerner av prostata intraepitelial neoplasi (PIN), og 963 kjerner av prostata adenokarsinom fra 246 tilfeller (3 kjerner på gjennomsnitt for hvert tilfelle) ble rapportert tidligere [12, 13]. NT ble definert som tilstøtende ikke-cancerous prostata vev.
TMA fra University of California, Irvine (UCI).
Tissue microarray (TMA) på 480 kjerner består av 199 kreftsaker (med mer enn 10 års oppfølging), 108 sammenkoblede kjerner av prostata intraepitelial neoplasi (PIN), 7 sammenkoblede kjerner av stroma, 3 kjerner av BPH, og 86 kjerner av kalibratorer og cellelinjer som tidligere rapportert [14, 15].
TMA fra Johns Hopkins University (JHU) (Bob Veltri laboratorium).
To prostata adenokarsinom microarray (0,6 mm i diameter, 6 kjerner per sak) omtales som TMA 681-682, ble opprettet under en CEVC EDRN stipend (PI Alan W. Partin) konstruert ved Johns Hopkins University avdeling for patologi ved hjelp av kirurgiske RP resected prøver hentet fra avdeling for patologi arkiver. Hver av to TMA lysbilder representerer 40 tilfeller av lokket (4 kjerner per sak) og tumor-matchet ikke-kreft prostata vev (4 kjerner per tilfelle). De formalinfiksert og parafininnstøpte prostatakreft og tumor-matchet ikke-kreft vev for TMA 681-682 ble oppnådd på grunnlag av søknad vises til Avdeling for patologi ved Johns Hopkins Hospital gjennom prostatakreft Biorepository Network (PCBN). Bruken av TMA inkludert TMA 681-682 å studere biomarkører ble godkjent av Johns Hopkins University IRB (Institutional Review Board) for prostatakreft.
TMA fra Johns Hopkins University (JHU) (Hui Zhang lab).
CAP vevet microarray (0,6 mm i diameter, 6 kjerner per sak) ble konstruert ved Johns Hopkins University ved hjelp av kirurgiske RP resected prøver hentet fra avdeling for patologi arkivet ved Johns Hopkins Hospital. Bruk av klinisk informasjon og svulstvev ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved Johns Hopkins University. Representert på TMA var 60 tilfeller av prostata adenokarsinomer (4 kjerner per sak) og tumor-matchet ikke-kreft prostata vev (2 kjerner per tilfelle). I tillegg ble 60 tilfeller av ikke-prostata ikke-cancerkontroll vev inkludert på microarray, bestående av normal nyre, mage, tynntarm, tykktarm, lever, bukspyttkjertel, endometrium, hjerne og lymfeknute.
Immunhistokjemi (IHC)
TMA ble bakt ved 60 ° C i 1 time, deparaffinized og vannes ut. Den TMA ble inkubert med 5% BSA /PBS i romtemperatur i 45 minutter, og deretter inkubert med 3% H
2o
2 ved romtemperatur i 15 minutter før påføring av primært antistoff. Kanin antihuman periostin (Abcam, ab14041) ble brukt i en fortynning på 1:. 4000 å farge TMA og ble oppdaget ved hjelp av Dako LSAB + System AP kit i henhold til produsentens instruksjoner
For å analysere den totale periostin flekker, den positive pikselantallet (PPC, v11) algoritme (Aperio Bilde Scope) ble påført enkeltkjerner fra 9 TMA til å beregne gjennomsnittlig pikselintensitet (i en kolo kanal som tilsvarer den brune IHC bunnfall) av alle piksler innenfor hver merknad region. Kort fortalt, vi brukte PPC inngangsparametere som er misligholdt for brun farge kvantifisering og deretter kjørte algoritmen. En pseudo-color «mark-up» bildet ble generert som en algoritme resultat, bekrefter at spesifiserte innganger målt ønsket farge og intensitet varierer. Positiv flekken fargeintensitet ble klassifisert i tre fargekodede områder: 1) intensitet svak positiv (iwp) = gul, 2) intensitet positive (Ip) = orange, og 3) intensitet sterk positiv (ISP) = rødt. Andel av farging ble beregnet som totalt antall positive piksler delt på totalt antall piksler og korrelerte med Gleason score.
Farging ble også evaluert blindt av Johns Hopkins Hospital (JHH) patologer å karakter stromal og epitelial farging lokalisering. Den TMA ble scoret semi-kvantitativt ved hjelp av en fire tier system basert på intensiteten og distribusjon: 0, undetectable; 1+, svak flekker; 2+, medium flekker, 3+ sterk farging. Alle TMA ble skannet på 20X og IHC bildene ble fotografert ved hjelp av Aperio Bilde Scope (v11.2.0.780).
Statistical Analysis
Wilcoxon signert rang for testen (paret, tosidig) ble utført for periostin flekker i peritumoral stroma og ikke-tumorous stroma som ble scoret av patologer. Forskjellen på periostin flekker i enten stroma eller epitelceller blant ulike forhold av prostata sykdom ble vurdert for individuell score ved hjelp av Chi-squared test. Pearson korrelasjonskoeffisient test ble brukt til å analysere korrelasjonen av Gleason score og positivitet av total periostin flekker inkludert både stromal og epitelial cellefarging fra beregnings scoring.
P
-verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Før glycoproteomics analyse av aggressive og ikke-aggressive Cap vev viste at periostin øker betydelig hos aggressiv prostatakreft svulster [1]. Den første funnet ble bekreftet ved hjelp av IHC [1]. Denne studien tar sikte på å verifisere at periostin overekspresjon ved PCA bruker store prøvesett fra multi-laboratorier og universelle lagring metoder. Den TMA inkluderer en fra Hui Zhang lab (JHU) bestående av 360 kjerner (60 tilfeller), to fra Bob Veltri Brady Urological Institute lab (JHU) består av 640 kjerner (80 tilfeller), tre fra David Chia lab (UCLA) bestående 1364 kjerner (246 tilfeller), og tre fra Dan mercola lab (UCI) bestående 684 kjerner (199 tilfeller).
For å eliminere lese variasjon fra individuelle laboratorier, var farget TMA skannet ved Johns Hopkins University hjelp av Aperio bildebehandling system, og 20X skannede bildet ble analysert ved anvendelse av de samme beregningsverktøy for å bestemme den totale fargeintensitet for hver kjerne. Vi ytterligere validert TMA tolkning av JHH patologer for alle TMA å skille stromal farging og epitel farging. De patologenes målinger brukt en fire tier system basert på intensiteten og distribusjon: 0, undetectable; 1+, svak flekker; 2+, medium flekker, 3+ = sterk farging (fig. 1A). I samsvar med vår tidligere observasjon, ble det periostin farging observert hovedsakelig i peritumoral stromale celler og i noen tilfeller i tumor epitelceller skjønt jo sterkere farging ble funnet i peritumoral stromale celler (Fig. 1A). Den statistiske analysen ble deretter utført for å svare på følgende spørsmål: 1) om periostin uttrykk kan skille prostata vev inkludert prostatakreft, ikke-tumor områder av prostata vev, BPH og PIN; 2) om periostin uttrykk er korrelert med kliniske variabler, for eksempel Gleason score
(A) patologenes kriterier for IHC scoring (a) 0, umulig å oppdage..; (B) 1+, svak flekker; (C) 2+, medium flekker; (D) 3+ = sterk farging. Periostin ble hovedsakelig farget i peritumoral stroma. (B) Boksplott av positivitet av periostin total flekker i pasient matchet prostata adenokarsinom og ikke-tumor prostata vev. (C) Fordeling av endringene i IHC score mellom peritumoral stroma og stroma fra ikke-tumorområder (NT). På x-aksen-1: IHC score i NT er høyere enn i den sammenkoblede kreft ved 1; 0: IHC score er det samme for den parede NT og kreft; 1: IHC score i NT er lavere enn i den sammenkoblede kreft ved 1; 2: NT lavere enn kreft ved 2; 3: NT lavere enn kreft med 3. Høyden på stolpene (y-aksen) er antall pasienter. Summen høyde på røde søylene er mye større enn den grønne linjen, noe som indikerer at IHC score blant de peritumoral stromale celler er mye høyere enn de tilsvarende normale stromale celler.
For å avgjøre om uttrykket av periostin kunne skille hetten fra ikke-tumor områder av prostata vev, ble statistiske analyser utført for de tre TMA fra JHU fordi disse TMA bestå av både prostatakreft og pasient-matchet ikke-tumor prostata vev. Periostin total farging og stromal farging ble analysert henholdsvis. Den periostin totale farging ble økt i prostata svulst med Gleason score seks og opp i forhold til sammenkoblede røyktumor prostata vev (Fig. 1B). Siden periostin var hovedsakelig farget i stroma, ble histogram analyse brukes til å analysere endringer i IHC score mellom periostin peritumoral stroma og paret ikke-tumorous stroma (Fig. 1C). X-aksen er forskjellen i IHC score, som ble beregnet ved hjelp av IHC score på periostin peritumoral stroma minus score på sammenkoblede røyk tumorous stroma. De røde linjene viser antall pasienter som hadde høyere IHC score i kreft sammenlignet med ikke-tumorous stroma, mens den grønne linjen indikerer lavere IHC score i kreft. Høyden på stolpene (y-aksen) er antall pasienter. Summen høyde på røde søylene er betydelig større enn den grønne linjen, noe som indikerer at IHC score blant de peritumoral stromale celler er betydelig høyere enn de tilsvarende ikke-tumor stromale celler. Den Wilcoxon signert rang for testen (paret, tosidig) gir p-verdi for betydningen av denne forskjellen (p = 2.75e-12).
Å sammenligne periostin uttrykk i prostata svulst og andre forhold av prostata sykdommer, den TMA fra UCLA som består av 197 kjerner av ikke-tumorous prostata (NT), 140 kjerner av benign prostatahyperplasi (BPH), 64 kjerner av prostata intraepitelial neoplasi (PIN), og 963 kjerner av CAP ble analysert. Bortsett fra kjernene med vev fall-off, ble 1233 kjerner brukt i stromal-farging analyse mens 1247 Kjerner ble anvendt i epitelial cellefarging analyse. Den periostin farging ble påvist med lav bakgrunn i ikke-tumorous prostata og BPH, og med økt flekker i PIN, mens mest intensive farging ble funnet i Cap (fig. 2). Chi-squared test avslørte at både periostin stromal farging og epitel farging differensiert BPH fra Cap inkludert lav karakter CAP (Gleason score ≤6), med betydelig p-verdi på 2.2E-16 og 0,001, henholdsvis (Tabell 1 og 2, S1 Statistisk Analyse). Periostin epitel flekker differensiert PIN fra Cap inkludert lav karakter CAP (Gleason score ≤6) (p = 0,001). I tillegg periostin stromal flekker differensiert lav karakter CAP (Gleason score ≤6) fra høy klasse CAP (Gleason score ≤6) (p = 1.7e-05) (tabell 1 og 2, S1 statistisk analyse). Resultatene viser at periostin farging er positivt korrelert med aggressivitet av prostatakreft.
De representative bilder av periostin uttrykk i vev av ulike prostata sykdommer. NT: pasient paret ikke-tumorous prostata; BPH: benign prostatahyperplasi, PIN: prostata intraepitelial neoplasi; og lue. prostata adenokarsinom
For å bestemme korrelasjonen av periostin uttrykk og Gleason score, ble alle de ni TMA analysert ved hjelp av det samme bildet beregningsverktøy. Andel av farging ble beregnet som totalt antall positive piksler delt på totalt antall piksler. Økningene av periostin total fargeintensitet ble funnet i prostatakreft med økt Gleason score i tre TMA fra JHU (Fig. 1B), de tre TMA fra UCLA (Fig. 3A), og de tre TMA fra UCI (Fig. 3B ). Resultatene viser at en positiv korrelasjon mellom total periostin farging og Gleason score (r = 0,87, p = 0,002) (fig. 3C).
(A) Box plott av positivitet av periostin for tre TMA fra UCLA, (B) Box plott av positivitet av periostin for de tre TMA fra UCI, (C) positiv korrelasjon av fold endringer og Gleason ranger med alle ni TMA. Prosent av flekker (positivitet) ble beregnet som totalt antall positive piksler delt på totalt antall piksler.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi uttrykket nivået av periostin i de primære prostata kreft vev, ikke-tumor prostata vev, benign prostatahyperplasi, og prostata intraepitelial neoplasi. Dette er den første studien ved hjelp av en slik utvidet kohort å analysere periostin uttrykk i prostatakreft og prøve å finne den kliniske relevansen av periostin høyde med hetten aggressive fenotype.
Høy uttrykk for periostin lokalisert i enten svulst epitel eller peritumoral stroma ble observert konsekvent som tidligere rapporter [16-19]. Interessant, mens sterk peritumoral periostin farging ble observert i alle TMA, den periostin farging i tumor epitel ble bare detektert i TMA fra UCLA og UCI, men ikke i TMA fra JHU. Dette kan ha vært forårsaket av variasjoner i pasient kohorter og teknisk pre-prosessering som omfatter prøvetaking, patolog utvalg etc. under byggingen av JHU TMA. I henhold til den statistiske analyse, epitelisk og stromal periostin ekspresjon var i stand til å skille Cap danner ikke-tumor prostata, BPH og PIN (tabellene 1 og 2, figurene 1 og 2, og S1 Statistical Analysis). I tillegg ble total periostin farging (epitel og stromal) vist seg å være korrelert med økende Gleason stillingen (Fig. 3C). Dette indikerer peritumoral periostin farging ble sterkt knyttet til Cap aggressivitet.
Andre studier har antydet at periostin uttrykk er korrelert med kreftmetastaser og dyster prognose [9, 20, 21]. Li
et al
rapportert at over-uttrykk for periostin ble ofte observert i stroma av nasopharyngeal carcinoma og matchet lymfeknutemetastaser sammenlignet med stroma av normal nasofaryngeal slimhinne [16]. Høy ekspresjon av stromal periostin ble også observert å være assosiert med kortere overlevelse av prostatakreft [19]. Imidlertid, i særdeleshet TMA brukt i denne studien bare bestå av primære prostatakreft. Det ville være svært nyttig å analysere periostin uttrykk i Cap tilbakefall saker som kan utvikle seg til metastasering og død i fremtiden.
I konklusjonen, selv om periostin ble økt i både peritumoral stroma og epitel Cap celler, periostin hadde stor ekspresjon i førstnevnte celletype. Våre data viser at periostin uttrykket er sterkt korrelert med hetten tumor aggressivitet, som støtter vår tidligere funn. Resultatene tyder på at periostin har potensial til å bli brukt som en diagnostisk vev biomarkør.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Statistical Analysis. Den statistiske analysen av periostin farging og status for prostata sykdom
doi:. 10,1371 /journal.pone.0121502.s001 plakater (docx)
