Abstract
Overuttrykte eller aktivering av syklisk AMP-respons element-bindende protein (CREB ) har vært kjent for å være involvert i flere humane maligniteter, inkludert lungekreft. Gener som reguleres av CREB har blitt rapportert å undertrykke apoptose, indusere celleproliferasjon, betennelse, og tumormetastase. Men de kritiske målgener av CREB i lungekreft er ikke godt forstått. Her har vi identifisert GSK-3α som en av de CREB målgener som er avgjørende for levedyktigheten av lungekreftceller. Den CREB knockdown betydelig redusert uttrykk for GSK-3α og den direkte binding av CREB på arrangøren av
GSK3A
ble identifisert. Kaplan-Meier analyse med en offentlig database viste en prognostisk betydning av avvikende GSK-3α uttrykk i lungekreft. Hemming av GSK-3α trykkes celleviabilitet, kolonidannelsen, og tumorvekst. For første gang, demonstrerte vi at GSK-3α reguleres av CREB i lungekreft og er nødvendig for cellenes levedyktighet. Disse funnene impliserer CREB-GSK-3a aksen som en roman terapeutisk mål for lungekreft behandling
Citation. Park SA, Lee JW, Herbst RS, Koo JS (2016) GSK-3α er en roman Target av CREB og CREB-GSK-3α signale Deltar i celleviabilitet i lungekreft. PLoS ONE 11 (4): e0153075. doi: 10,1371 /journal.pone.0153075
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 6 februar 2015; Godkjent: 23 mars 2016; Publisert: 06.04.2016
Copyright: © 2016 Park et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute stipend R01-CA126801 (til Ja Seok Koo) og Cancer Center Support Grant CA-16359 (til Yale Cancer Senter). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
transkripsjonsfaktor syklisk AMP-respons element-bindende protein (CREB) regulerer ulike cellulære prosesser som omfatter celledifferensiering, spredning, overlevelse, glukose metabolisme, immunregulering, og synaptisk plastisitet assosiert med minne [1-7] . Tidligere viste vi at CREB er kritisk for regulering av slim differensiering av normale humane tracheobronchial epitelial (NHTBE) celler [8]. I tillegg ble den reduserte overlevelsesvarighet signifikant assosiert med overekspresjon av CREB eller aktivert CREB (p-CREB) hos ikke røykere med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [9] og knockdown av CREB undertrykker levedyktigheten til lungekreftceller [10]. Flere serin-treoninkinaser kan aktivere CREB og p-CREB induserer ekspresjon av flere cAMP-responselementet inneholdende gener, de av som spiller en viktig rolle i funksjonen av CREB. Flere tilnærminger for å identifisere CREB målgener har blitt rapportert [11-14], men distinkte målgener av CREB i lungekreft fortsatt i stor grad ukjent.
GSK-3, som har to isoformer av GSK-3α og GSK- 3β, er en serin /treonin proteinkinase som er involvert i cellesyklusprogresjon, differensiering og apoptose. GSK-3 er konstitutivt aktiv i hvilende celler, og det fosforylerer og hemmer onkogene signalisering, for eksempel β-catenin /WNT sti [15-21]. Selv om GSK-3 har blitt studert som en tumor suppressor [22-24], det er økende bevis for at GSK-3 spiller en onkogen rolle i ulike kreft hos mennesker. De fleste studier har fokusert på rollen av total GSK-3 eller GSK-3β [25-27], men nyere studier impliserte onkogene rollen GSK-3α i akutt myelogen leukemi (AML) [28], prostata kreft [29], og kreft i bukspyttkjertelen [30]. Interessant nok har CREB overekspresjon eller dens økte aktivitet er knyttet til utviklingen av disse humane cancere [31-36]. Spesielt CREB fungerer som et proto-onkogen i AML [31, 37] og GSK-3α er også et viktig mål for AML terapi [28]. Nylig, GSK-3α og GSK-3β har blitt rapportert å være nye kinase mål for tivantinib, som er en potent selektiv inhibitor av reseptor-tyrosin-kinase c-MET, i lungekreftceller. Tivantinib viste høyere potens for GSK-3α mer enn for GSK-3β og hemming av GSK-3α eller GSK-3β uttrykk forårsaket apoptose i lungekreftceller [38].
Her vi først identifisert som GSK- 3α, ikke GSK-3β, er regulert av CREB i lungekreftceller. Videre undersøkte vi at det er en positiv sammenheng mellom høy GSK-3α uttrykk og kortere overlevelse av lungekreftpasienter. Knockdown av GSK-3α demper celleviabilitet, kolonidannelsen, og tumorvekst. Sammen utgjør disse funnene impliserer at GSK-3α er en kritisk mål gen av CREB og CREB-GSK-3α signalering er en potensiell terapeutisk mål for lungekreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
humane lungekreftcellelinjer (H1993, H1437, H1734, og A549) ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Lungecancerceller ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen), supplert med 10% (volum /volum) varmeinaktivert føtalt bovint /serum (FBS, Sigma Aldrich), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin G natrium og 100 ug /ml streptomycin sulfat (Invitrogen). Normale humane tracheobronchial epitelceller (NHTBE) ble oppnådd fra Lonza Walkersville, Inc. og dyrket i BEGM
™ med flere kosttilskudd. Alle celler har blitt dyrket direkte fra originale lav-passasje aksjer og ble brukt før passering 30. Cellene ble også testet i løpet av de siste tre månedene for korrekt morfologi av mikroskop og å oppdage mycoplasma forurensning ved hjelp av en MycoAlert mycoplasma deteksjon kit (Lonza Walkers, Inc .). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2.
Antistoffer /Kjemikalier
Monoklonale anti-β-aktin-antistoff (A2228) var kjøpt fra Sigma Aldrich. Kanin polyklonale antistoff mot GSK-3α (ab28833) ble kjøpt fra Abcam. Forskolin (3828), anti-CREB (9197), anti-p-CREB (9198), anti-cyclin A2 (4656), anti-cyklin B1 (4138), anti-cyclin E2 (4132), og GSK-3β ( 12456) ble innhentet fra Cell Signaling Technology. Rabbit monoklonalt cyclin D1 antistoff (2261-1) ble kjøpt fra Epitomics
knockdown /Overuttrykte av gener
Silencer CREB siRNA og GSK-3a sirnas ble kjøpt fra Thermo vitenskapelig eller Invitrogen.; CREB siRNA (109994, Invitrogen), GSK-3α siRNA-1 (L-003009-00-0005, ON-TARGETplus SMARTpool, ThermoScientific), og GSK-3α siRNA-2 (145 366, Invitrogen). BLOCK-det Fluorescent Oligo (Invitrogen) ble anvendt som en kontroll. Hver siRNA ble transfektert hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Cellene ble infisert med lentiviral shScrambled eller shRNAs målretting CREB eller GSK-3α med 8 ug /ml polybren og de infiserte celler ble selektert med puromycin. Sekvensene av shRNAs er oppført i S1 Table (tilgjengelig på nettet). For CREB overekspresjon, ble H1437 og A549 celler transfektert med plasmid DNA fra pCMV-tomt eller pCMV-CREB (Clontech Laboratories, Inc.) bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
celleviabilitet
Cell levedyktigheten ble bedømt ved MTT-assay. Etter at cellene ble transfektert med sirnas i 72 timer, ble cellene inkubert med MTT (sluttkonsentrasjon 0,5 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° C inkubator. Etter MTT inkubering ble 150 ul av 100% DMSO tilsatt for å oppløse krystallene. Levedyktige celler ble talt ved å lese absorbansen ved 570 nm ved hjelp av en mikroplateleser SpectraMax (Molecular Devices).
Colony Forming analyse
På 24 timer etter transfeksjon av de angitte sirnas, 2 x 10
3-celler ble overført i 6-brønners plater og fikk vokse i 7-14 dager. Mediet ble fjernet, fiksert med 10% formalin i 15 minutter og etterfulgt av farging med krystallfiolett for å visual koloniene.
Kvantitativ real-time PCR
Totalt RNA ble renset fra celler ved hjelp en RNeasy Mini Kit (Qiagen). Revers transkripsjon av totalt RNA ble utført ved anvendelse av M-MLV-revers transkriptase (Promega). Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av
SYBR
Grønne PCR kjerne Reagenser (Applied Biosystems) og iCycler termosykler (Bio-Rad Laboratories). Primer sekvenser er oppført i S1 Table (tilgjengelig på nettet).
Western Blot analyse
Standard SDS-PAGE og western blotting prosedyrer ble brukt til å analysere uttrykket av ulike proteiner. Helcellelysater fra hver av lungecancercellelinjene som ble testet ble fremstilt ved anvendelse av SDS-lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glyserol og 0,02% bromfenolblått) inneholdende proteaseinhibitorer og fosfatase. Alle proteiner ble visualisert ved hjelp av en pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff og Amersham ECL
™ Western blotting Detection Reagenser (GE Healthcare og biovitenskap). Intensitet av individuelle bånd ble kvantifisert ved hjelp ImageJ densitometry programvare og uttrykt i forhold til aktin signal, som et mål på protein relative overflod i de ulike prøvene.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
SimpleChIP Enzymatisk kit (Cell Signaling) ble anvendt som beskrevet av produsenten. PCR ble utført med primere som er spesifikke for de angitte promotorområdene, og reaksjonene ble utført i triplikat og 1% av det totale inngangs prøven ble anvendt som en kontroll. Primer sekvenser er oppført i S1 Table (tilgjengelig på nettet).
Farging
For immunfluorescens, påvisning av primære antistoffer ble gjort ved hjelp av fluorescerende konjugater av Alexa Fluor
® 488 antistoff (Invitrogen) sammen med forlenge
® Gold Antifade Reagens med DAPI (Invitrogen). Før farging av faste parafininnstøpte vev, vi fulgte standard protokoll som inkluderte skritt som deparaffinization, antigen henting, og permeabilization.
flowcytometrisystemer
For cellesyklus flowcytometri, ble cellene fiksert i 70% etanol og farget med propidium jod-farging (BD Pharmingen) for DNA-innhold. Apoptose ble målt ved hjelp av FITC Annexin V apoptose Detection Kit (BD Pharmingen) etter produsentens anvisninger.
In Vivo
Studier
Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Yale University og dannet de juridiske mandater og føderale retningslinjer for stell og vedlikehold av forsøksdyr (protokoll #: 2012-11464). Kvinnelig J: nu nakne mus ble oppnådd fra Jackson Laboratory og brukes ved 6-7 uker gamle. H1993 cellene ble forbehandlet med 20 nM av kontroll siRNA eller GSK-3α siRNA i 24 timer, etterfulgt av transplantasjon (2 x 10
6 celler /flanke, xenograft n = 7 /gruppe) i flanken av mus. Dessuten ble H1993-shScrambled, H1993-shGSK3A # 2, eller H1993-shGSK3A # 4 celler podet på rygg flankene (6 x 10
5 celler /flanke, shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, og shGSK3A # 4 n = 5). Alle xenografter ble transplantert i både høyre og venstre rygg flankene av mus. Tumorvolumet ble målt med digital målepunkter, og beregnes ved hjelp av formelen 0,52 x lengde x bredde
2. Musene ble avlivet ved slutten av studien ved å være plassert i en karbondioksyd kammer.
statistiske metoder
kvantifisering Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Den statistiske signifikans av forskjeller mellom gruppene ble bestemt av Student
t
-test, med en
P
verdi under 0,01 ansett for å være statistisk signifikant. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å analysere univariat overlevelse, og sammenligninger av overlevelse distribusjoner blant grupper ble utført ved hjelp av log-rank test.
Resultater
GSK-3α er regulert av CREB i lunge kreftceller
for å undersøke kritiske CREB målgener i lungekreft, utførte vi qPCR analyse ved hjelp av spesifikke primere mot en undergruppe av gener relatert til celle overlevelse, spredning, og levedyktighet i CREB knockdown celler. Vi fant at mRNA nivået av GSK-3α, ikke nivået av GSK-3β, var signifikant nedregulert ved CREB siRNA i alle lungecancer cellelinjer som ble testet vi (H1993, H1437, H1734, og A549) (figur 1A). I tillegg ble det protein ekspresjon av GSK-3α dramatisk undertrykkes ved CREB knockdown i alle kreftcelle fire lunge linjer som ble undersøkt (fig 1B), men proteinnivået av GSK-3β ble ikke endret ved CREB knockdown (figur 1C).
(A) Effekt av CREB knockdown på mRNA nivå av
GSK3A
,
GSK3B
, og
CREB
. Hver av de angitte celler ble transfektert med kontroll siRNA eller CREB siRNA (40 nM, hver) i 48 timer, etterfulgt av qPCR-analyse. Alle verdier i grafene representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Tosidig
t-
test. *,
P
0,01. (B-C) Virkning av CREB knockdown på protein nivåene av GSK-3α (B) og GSK-3β (C). Hver av de indikerte cellene ble transfektert med kontroll siRNA eller CREB siRNA (40 nM, hver) i 72 timer, etterfulgt av western blot analyse.
Vi har merket at
GSK3A
promoter inneholdt flere antatte CREB bindingssteder som bestemmes av TFSEARCH (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (figur 2A). For å undersøke hvorvidt CREB bindes til humant
GSK3A
promoter, utførte vi ChIP analyse ved hjelp av immunoutfelling av CREB-antistoff IgG og som en negativ kontroll. Ikke bare primersett A som dekker CREB konsensus-bindingssetet (-39 til -53), men også tre andre primersett (B: -459 til -476, C: -545 til -557, og D: -603 til – 616) viste binding av CREB på
GSK3A
promoter. Imidlertid hadde ikke-spesifikke regioner (NS-1, NS-2, og NS-3) fra promoteren ikke viser noen binding av CREB (figur 2B). I tillegg knockdown av CREB markert trykkes foreningen av CREB med
GSK3A
promoter (figur 2C). I samsvar med tidligere data som viste CREB knockdown trykkes uttrykk for GSK-3α, overekspresjon av CREB sterkt indusert GSK-3α uttrykk på proteinnivå etter forbigående eller stabil overekspresjon av CREB (Fig 2D). Faktisk ble uttrykk for p-CREB og GSK-3α økt med forskolin, som aktiverer enzymet adenylyl cyclase og øker intracellulære nivåer av cyklisk AMP (figur 2E). Tatt sammen, foreslår vi at CREB er en potensiell oppstrøms regulator av GSK-3α i lungekreftceller.
(A) Skjematisk diagram som viser posisjonene til CREB bindende elementer som ligger i genet formidler av menneskelige
GSK3A product: (TFSEARCH). AD: de spesifikke regioner for primere som dekker CREB bindende elementer, A: -39 til -53, B: -459 til -476 C: -545 til -557, D: -603 til -616, NS-1, – 2 og -3: regionene for primere som inkluderer ikke-spesifikke bindingselementer NS-1: -126 til -230, NS-2: -183 til -378, og NS-3: -1214 til -1356. Primer sekvenser er i S1 Table (tilgjengelig på nettet). (B) Direkte binding av CREB på
GSK3A
promoter. En brikke analysen ble gjort med Kromatin fremstilt fra H1993 og H1734 celler. Bindingen av CREB til
GSK3A
promoteren ble påvist ved visualisering av PCR-produktet. De enkle bånd detektert i inngangs prøvene indikerer spesifisiteten av PCR-primere. (C) Direkte binding av CREB på
GSK3A
promoter i CREB-knockdown celler. Proteininnholdet av CREB i hver stabil cellelinje ble bekreftet ved western blot-analyse. (D) Virkning av CREB overekspresjon på ekspresjon av GSK-3α. H1437-celler ble transfektert med den samme mengde av pCMV-tom eller pCMV-CREB ekspresjonsvektor og ekspresjon av CREB, p-CREB, og GSK-3α ble undersøkt ved western blot analyse (til venstre). A549-kontroll (A549-ctrl) eller A549-CREB-celler ble transfektert med pCMV-vektorer og valgt av puromycin (1 pg /ml). Effekten av CREB på ekspresjonen av GSK-3α ble også bekreftet (til høyre). (E) Effekt av forskolin på induksjon av nivået av p-CREB og GSK-3α. A549 og H1437 celler ble behandlet med forskolin (10 mm, 30 min) og uttrykk for hvert protein ble undersøkt av western blot analyse.
GSK-3α er en dårlig prognose faktor i lungekreft
Det er dokumentert at GSK-3β er overexpressed i lungekreft. Overekspresjon av GSK-3β tjener som en markør uavhengig av dårlig prognose for NSCLC og dens inhibering undertrykker celleproliferasjon i NSCLC-celler [39]. Men rollen som GSK-3α i lungekreft fortsatt trenger mer etterforskning. Her fant vi at GSK-3α er overexpressed i flere lungekreftcellelinjer sammenlignet med NHTBE celler (figur 3A).
(A) Protein nivåer av GSK-3α, p-CREB, og CREB i flere lunge kreft cellelinjer sammenlignet med NHTBE celler. (BD) Kaplan-Meier analyse av total overlevelse ved lav eller høy
GSK3A product: (
GSK3A
probe sett 202210_x_at) uttrykk i (B) 1760 lungekreftpasienter, (C) 487 lunge adenokarsinom pasienter og (D) 422 lunge plateepitelkarsinom med adjuvant behandling. Total overlevelse analyse av pasientene ble utført ved hjelp av Cox proporsjonal fare modeller og oppfølgingsdata for den angitte perioden.
For ytterligere å vurdere om våre funn av
GSK3A
overekspresjon er relevant til human lungekreft, brukte vi offentlig tilgjengelig Kaplan-Meier-plotter (https://kmplot.com/analysis), som er består av 1760 lungekreftpasienter som får kjemoterapi /strålebehandling basert på databasene (CARRAY: n = 504; GSE14814 : n = 90, GSE19188: n = 156, GSE29013: n = 55, GSE31210: n = 246, GSE3141: n = 111; GSE37745: n = 196, GSE4573: n = 131, GSE8894: n = 138, og TCGA: n = 133). For å avgjøre om
GSK3A
mRNA (202210_x_at) overflod i svulster var assosiert med total overlevelse, utførte vi på total overlevelse analyse av pasienter som bruker Cox proporsjonal fare modeller og oppfølgingsdata for 200 måneder etter operasjonen. Overekspresjon av
GSK3A
mRNA nivåer var assosiert med dårlig total overlevelse av lungekreftpasienter (harzard ratio (HR) = 1,42, logrank P = 4.9e-06) (figur 3B). Interessant,
GSK3A
mRNA nivåer ble sterkere assosiert med dårlig total overlevelse av lungekreft pasienter med adenokarsinom (HR = 1,99, logrank P = 2.4E-06) (figur 3C). Men positive
GSK3A
uttrykk var ikke signifikant korrelert med kortere overlevelse av pasienter med plateepitelkarsinom histologi type (Fig 3D). Vi har også funnet ut at overekspresjon av
CREB
mRNA nivået ble assosiert med dårlig total overlevelse av lungekreft pasienter med svært lignende mønster for
GSK3A
mRNA (S2 fig). Våre resultater på kliniske kreftprøver viser at avvikende aktivering av GSK-3α er forbundet med menneskelig dødelighet av lungekreft pasienter, spesielt med lunge adenokarsinom.
Hemming av GSK-3α undertrykker levedyktigheten til lungekreft celler
for å bestemme virkningen av GSK-3α, som er en CREB målgen, bekreftet vi effekten av CREB knockdown på cellelevedyktigheten i multiple lungecancercellelinjer. I samsvar med våre tidligere rapporter [10], CREB hemming trykt levedyktighet lungekreftceller (fig 4a). Deretter knockdown av GSK-3α med dens spesifikke siRNA resulterte i en reduksjon i levedyktigheten av alle lungecancer cellelinjer som ble undersøkt (fig 4B). I tillegg knockdown av GSK-3α førte til redusert kolonidannelse av cellene (figur 4C). Derfor GSK-3α knockdown undertrykte betydelig cellen levedyktighet av KRAS-WT lungekreftcellelinjer (H1993 og H1437), sammenlignet med KRAS-mutant lungekreftcellelinjer (H1734 og A549). Vi undersøkte videre effekten av GSK-3α knockdown på celledød ved hjelp av FACS-analyse. Som vist i figur 4D, cellene som uttrykker ble shGSK3A viste den økte celledød sammenlignet med hver styrecellelinje. Valideringen av siRNAs eller shRNAs på uttrykk for GSK-3α ble utført av qPCR eller western blot analyse i flere lungekreft cellelinjer (S1 fig). Disse resultater antyder at GSK-3α positivt regulerer levedyktigheten av lungecancerceller.
(A) Virkning av CREB knockdown på cellelevedyktigheten. Lungecancercellelinjer (H1993, H1437, H1734, og A549) ble transient transfektert med kontroll siRNA (50 nM), eller CREB siRNA (10, 50 nM) i 72 timer, etterfulgt av MTT-analyse. Alle verdier i grafene representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Tosidig
t
-test. *,
P
0,01. (B) Virkning av GSK-3α knockdown på cellelevedyktigheten. Cellene ble transient transfektert med kontroll siRNA eller GSK-3α siRNA (40 nM, hver) i 72 timer og den kvantitative data ble etterfulgt av MTT-analyse. Alle verdier i grafene representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Tosidig
t-
test. *,
P
0,01. (C) Virkning av GSK-3α knockdown på kolonidannelse. En dag etter transfeksjon av kontroll siRNA (40 nM), eller GSK-3α siRNA (10, 40 nM) ble cellene sådd ut på nytt i 6-brønner med lav tetthet (2 x 10
3 /brønn) og inkubert i 7-14 dager. Middelverdi ± SD i tre uavhengige forsøk. Tosidig
t-
test. *,
P
0,01. (D) Virkning av GSK-3α knockdown på celledød. H1734 og H1993 celler ble infisert med lentiviral uttrykker shRNA targeting GSK-3α (to sekvenser, shGSK3A # 2 og shGSK3A # 4) med 8 mikrogram /ml polybrene. Etter 48 timers infeksjon, ble cellene valgt med 0,5 ug /ml puromycin i 3 dager. De valgte celler ble utført ved farging av annexin V og PI til analyse apoptotisk celledød ved LSRII.
CREB-GSK-3α signalering er avgjørende for reguleringen av cykliner
For å få innsikt i rollen som GSK-3α i lungekreft celle levedyktighet, vi først undersøkt om GSK-3α regulerer cellesyklus ved hjelp av FACS analyse. Interessant, GSK-3α knockdown trykkes S-fasen av cellesyklusen, noe som kan bidra til redusert cellelevedyktighet lungekreftceller (figur 5A). Som vist i figur 5B, ble protein ekspresjon av flere cykliner, inkludert cyclin A2, cyklin B1, cyklin D1, og cyklin E2 markert trykkes av GSK-3α knockdown i lungecancercellelinjer. I tillegg er disse resultatene var i samsvar med tidligere rapporter om at CREB kan regulere ekspresjonen av cykliner [12, 31, 40, 41]. Tatt sammen, disse resultatene antydet at GSK-3α kan virke positivt på levedyktigheten til lungekreftceller ved å regulere ekspresjonen av sykliner.
(A) Virkning av GSK-3α knockdown på cellesyklusen. Indikerte Cellene ble sultet i serumfritt RPMI-medium i 24 timer og etterfylt med RPMI supplert med 10% FBS i ytterligere 24 timer. Høstet celler ble farget med PI analyse cellesyklus ved LSRII. (B) Virkning av GSK-3α knockdown på genekspresjon i forbindelse med cellenes levedyktighet eller cellesyklus inkludert cyclin A2, cyklin B1, cyklin D1, og cyklin E2. De lungekreft celler ble transient transfektert med kontroll siRNA eller GSK-3α siRNA (40 nM, hver) for 48 timer og ble etterfulgt av western blot analyse.
GSK-3α er kritisk for tumorvekst
neste adressert rollen GSK-3α i tumorvekst
in vivo
hjelp subkutane injeksjoner av kontroll eller GSK-3α-utarmet celler. Veksten av tumorer ble overvåket i løpet av fem uker etter at cellene ble eksplantert i nakne mus. Representative fotografier av mus ved slutten av fem uker viste at utviklingen av tumorer avledet fra GSK-3α-uttømte celler ble markert undertrykt sammenlignet med tumorer avledet fra kontrollceller (figur 6A). I samsvar med vår hypotese og data, GSK-3α knockdown resulterte i en signifikant hemming i tumorvekst og tumorvolum (figur 6B). Vi har bekreftet virkningen av GSK-3α uttømming på ekspresjon av GSK-3α eller cyclin B1 i vev avledet fra xenotransplantater (S5 Fig). Gjentatte ganger har vi lagt merke til at den fullstendig sletting av
GSK3A
i cellene kan ikke utvikle svulster i nakne mus (Fig 6C og 6D). Samlet er disse dataene viser tydelig at redusert nivå av GSK-3α forringe lungekreft tumorvekst
in vivo
.
(A) Representative bilder av xenografter avledet fra kontroll siRNA eller GSK-3α siRNA -behandlet H1993 celler. Etter 24 timers siRNA transfeksjon (20 nM, hver), ble cellene inokulert subkutant i høyre og venstre side rygg flankene av kvinnelige hårløse mus (xenograft n = 7 /gruppe). (B) Tumor volum av xenotransplantater avledet fra kontroll eller GSK-3α-manglende H1993-celler ble evaluert ved hvert tidspunkt som angitt. Tumorvolumet ble målt med digital målepunkter, og beregnes ved hjelp av formelen 0,52 x lengde x bredde
2. Tosidig
t
-test. *,
P
0,01. (C) Representative bilder av xenografter avledet fra H1993-shScrambled, shGSK3A # 2, eller shGSK3A # 4 celler. Cellene ble inokulert subkutant i rygg flankene av hårløse mus (venstre: shScrambled celler, høyre: shGSK3A celler) og tumor volum ble målt over de angitte tidspunkter (shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, og shGSK3A # 4 n = 5). Tosidig
t
-test. *,
P
0,05
Diskusjoner
I denne studien, vi først identifisert GSK-3α som en roman mål av CREB i lungekreftceller.. Vår studie viser onkogene roller GSK-3α som CREB målet genet og som en roman prognostisk biomarkør i lungekreft. GSK-3α har vist seg å være et terapeutisk mål på flere humane kreftformer, inkludert AML, kreft i bukspyttkjertelen, og prostatakreft. Imidlertid fremdeles i stor grad forblir rollen som GSK-3α i lungekreft ukjent. Her er våre resultater viser at redusert nivå av GSK-3α forringe levedyktigheten av lungekreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
. GSK-3α er overexpressed i flere lungekreftcellelinjer og lunge tumorvev. Dessuten ble det avvikende overekspresjon av GSK-3α forbundet med en kortere overlevelsestid særlig hos pasienter med lunge adenokarsinom. Enda viktigere, regulerer CREB ekspresjon av GSK-3α men ikke GSK-3β, noe som tyder på at det er en spesifikk arm av CREB-GSK-3α signalisering i lungekreft.
Aktiviteten av CREB reguleres av multippel fosforylering mekanismer og fosforylering av CREB ved serin-133 er nødvendig for rekruttering av den ko-aktivator CREB-bindende protein (CBP) /P300 og dens transkripsjonelle aktivitet. Faktisk har GSK-3 er kjent som en repressor av CREB aktivitet. CREB DNA-bindende aktivitet hemmes av GSK-3β overekspresjon og økes med litium eller natriumvalproat som er GSK-3-inhibitorer i humane neuroblastom-celler [42]. Dessuten har GSK-3β blitt rapportert å undertrykke multiple CREB-målgener [43, 44]. Motsatt har nylig studie blitt rapportert at GSK-3 fremmer foreningen av CREB og dens co-aktivatorer med MEIS1, en homeobox (HOX) DNA-bindende kofaktor, å indusere HOX-mediert transkripsjon og transformasjon i MLL leukemi [45]. Selv om den funksjonelle konsekvens av CREB aktivitet av GSK-3 er ikke ennå klart, antyder vårt studium sterkt at CREB positivt regulerer GSK-3α, ikke GSK-3β, i lungekreftceller, og dermed gi et nytt konsept for CREB-GSK-3α signale .
Selv overekspresjon av GSK-3β og dens funksjon som en svulst promoter i lungekreft har blitt vist [39], rollen til GSK-3α i lungekreft fortsatt ukjent. I vår nåværende studie fant vi at GSK-3α er overexpressed i lungekreftcellelinjer i forhold til normal bronkial epitelceller. Knockdown av GSK-3α i lungekreftceller fører til suppresjon av celleproliferasjon og også en induksjon av apoptose betydelig. Disse resultatene indikerer at GSK-3α spiller også en viktig rolle i veksten av lungekreftceller.
Mekanismen for GSK-3α som en svulst promoter i lungekreft er praktisk talt ukjent. Det er blitt vist at GSK-3α fremmer onkogen KRAS funksjon via IKK-NF-kB aktivitet i bukspyttkjertelkreft. Forfatterne foreslo GSK-3α som en viktig nedstrøms effektor av muterte KRAS å regulere NF-kB signalveier [30]. Interessant, vår studie viste at GSK-3α knockdown sterkt undertrykt cellen levedyktighet av KRAS-WT lungekreftcellelinjer, H1993 og H1437 celler, sammenlignet med KRAS-mutant lungekreft cellelinjer, H1734 (G13C) og A549 (G12S) celler . Selv om det fortsatt uklart om KRAS-status er direkte knyttet til rollen som GSK-3α i lungekreftceller, foreslår vi at funksjonen av GSK-3α i KRAS signalering kan være regulert i en celle-type spesifikk måte.
for å bedre forstå rollen av GSK-3α og undersøke kritiske gener påvirkes av GSK-3α i lungekreft, vi først vist en undergruppe av NF-kB målgener som
MYC
,
WT1
,
BIRC2
,
IL-9
,
HMOX1
, og
TERT
, som ble regulert av en pan-GSK-3 hemmer AR -014418 i bukspyttkjertelkreft [30]. Våre data var ikke helt i tråd med den forrige undersøkelsen, men vi har observert en betydelig reduksjon i mRNA nivå av TERT av GSK-3α knockdown og liten forskjell i den andre NF-kB er rettet mot analysert (EDN1, CYP19A1, HMOX1, WT1, og BIRC2) (S3 fig). I tillegg fant vi at uttrykket av flere cykliner som er kjent som CREB målet gens ble markert nedregulert av GSK-3α knockdown i flere lungekreftcellelinjer. Selv om studien ikke direkte identifisere hvordan cykliner er regulert av GSK-3α disse resultatene støtter sterkt romanen rollen GSK-3α som en aktiv regulator i levedyktigheten til lungekreft celler.
Teoretisk hemming av GSK-3 kan føre til β-catenin stabilisering og hyperaktiveringen av Wnt /β-catenin signal [46-49]. Imidlertid Doble et al. viste at begge isoformer av GSK-3 må inhiberes for β-catenin stabilisering. GSK-3α /β dobbel-knockout mus embryonale stamceller (ESC) vises hyperactivated Wnt /β-catenin signal [50]. I samsvar med denne rapporten er det økende bevis for at den eneste tap av enten GSK-3α eller GSK-3β isoform ikke fører til β-catenin stabilisering [28, 39]. Våre data viser også at hemming av GSK-3α ikke induserer nivået av β-catenin og AXIN2, en Axin-relatert protein som spiller en viktig rolle i Wnt /β-catenin signalveien (S4 Fig). Disse resultatene støtter at GSK-3α kan fungere uavhengig av β-catenin stabilisering i lungekreft, men ytterligere analyse må være ferdig å fullt ut forstå rollene til GSK-3α og GSK-3β i β -catenin stabilisering i lungekreft.
De observasjoner som GSK-3α uttrykk spiller en kausal rolle i overlevelse av lungekreftpasienter, foreslår GSK-3α kan være nyttig som en prognostisk biomarkør i lungekreft, spesielt lunge adenokarsinom. Videre studier som undersøker mekanismer for målretting CREB-GSK-3α veien i lungekreft vil være avgjørende for å bestemme og utvikle GSK-3a spesifikke hemmere. I konklusjonen, foreslår vi at GSK-3α er et lovende terapeutisk mål som en roman target gen av CREB å diagnostisere svulst og utvikle terapi, med relevans for lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
