Abstract
Det er kjent at avslørte cellelinjer
in vitro
til parabelflygninger endrer sin genuttrykk og proteinproduksjonsmønstre. Parabolske fly og romfart generelt er ledsaget av forbigående hypergravity og vibrasjon, noe som kan påvirke cellene og derfor må vurderes også. For å anslå mulige konsekvenser av forbigående hypergravity og vibrasjon, undersøkte vi effekten av disse kreftene separat ved hjelp av dedikerte bakkebaserte anlegg. Vi la follikulær skjoldbrusk ML-en og CGTH W-1 kreftceller i et bestemt sentrifuge (musikk Multi Sample Inkubator Sentrifuger; Sahc Kort Arm Menneskelig sentrifuge) simulerer de hypergravity faser som oppstår under en (P1) og 31 parabler (P31) av parabolske flyreiser, henholdsvis. På Vibraplex enheten ble de samme cellelinjer behandlet med vibrasjonsbølger som svarer til de som forekommer i løpet av en hel parabolsk uren som varer i to timer. Etter de ulike behandlingene ble cellene høstet og analysert av kvantitativ real-time PCR, med fokus på de som er involvert i forming (
ACTB
,
MYO9
,
Tubb
,
VIM
,
TLN1
, og
ITGB1
) og modulering (
Esr
,
RDX
, og
MSN
) cytoskjelettet, samt de koding vekstfaktorer (
EGF
,
CTGF
,
IL6
, og
IL8
) eller proteinkinaser (
PRKAA1 Hotell og
PRKCA
). Analysen avdekket endringer i flere gener i begge cellelinjer; ble imidlertid færre gener påvirket i ML-en enn CGTH W-1 celler. Interessant,
IL6
var den eneste gen hvis uttrykk ble endret i begge cellelinjene ved hver behandling, mens
PKCA
transkripsjon vært upåvirket i alle forsøk. Vi konkluderer med at en PKCa uavhengig mekanisme
IL6
genaktivering er svært følsom for fysiske krefter i skjoldbruskceller dyrket
in vitro
som monolag
Citation. Ma X, Wehland M, Aleshcheva G, Hauslage J, Wasser K, Hemmersbach R, et al. (2013) Interleukin-6 Expression etter Gravitasjons Stress på grunn av vibrasjoner og Hypergravity i Follikkelfasen Thyroid kreftceller. PLoS ONE 8 (7): e68140. doi: 10,1371 /journal.pone.0068140
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 25 mai 2013; Publisert: 02.07.2013
Copyright: © 2013 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den tyske romorganisasjonen DLR (BMWi gi 50WB1124), samt av den europeiske romfartsorganisasjonen (ESA tilskudd CORA-GBF-2010-203 med kontraktsnummer 4000102119) og Aarhus universitet, Danmark. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
In vivo
svulster utgjør neoplastiske celler, ikke-maligne stromale celler og trekk hematopoetiske celler [1]. Forskjellige tumorer er dominert av fenotypisk og funksjonelt heterogene kreftceller, som styrer de komplekse interaksjoner mellom celletypene og regulere tumorvekst, progresjon, metastase, og angiogenese [2]. Således, neoplastiske eller kreftceller er hovedbestanddelen av ondartede svulster. Deres analyse kan indikere mulige måter ondartet svulst utvikling og behandling.
Vi har fokusert på follikulær skjoldbruskkjertelen karsinom, som er ondartede epiteltumorer uttrykker follikulære mønstre. Normalt er de innkapslet [3] – [5].
In vivo
, de neoplastiske cellene som driver utviklingen av kreft er epitelceller på ulike stadier av dedifferentiation. Neoplastisk tyroid follikulær kreft celler er representert ved linjene ML-1, FTC-133 og CGTH-W1 for denne studien [5] – [7]. I de senere år har thyroid kreft celler blitt vist å bli påvirket inkubert på en tilfeldig posisjonering Automat (RPM) eller en clinostat, innretninger utviklet for å simulere vektløshet på jorden [8] – [12]. Vi har funnet endringer i den to- til tre-dimensjonal vekst av thyroid kreft celler dyrket med turtallet, ledsaget av en endring i konsentrasjonen av forskjellige proteiner og ekspresjonen av et betydelig antall gener [8] -. [12]
RPM er en enhet konstruert for å simulere mikrogravitasjon på jorden. For dette formål blir prøver roteres rundt alle tre romlige retninger på en tilfeldig måte. I løpet av forsøket, retningen av gravitasjonsvektoren stadig endres og dens effekter kan bli kansellert ut over tid [13]. Det endrede oppførsel av kreft celler inkubert på denne maskinen kan være på grunn av endret gravitasjonen (simulert mikrogravitasjon). For å bevise dette, utsettes vi skjoldbruskkjertelen kreftceller og endotelceller til kortsiktig ekte mikrogravitasjon generert i fly under parabelflygninger. Eksponering for ekte mikrogravitasjon førte til lignende, men ikke identiske, resultatene i forhold til RPM eksperimenter [14], [15]. Disse forskjellene kan skyldes det faktum at turtallet ikke simulere vektløshet for vårt valgte cellesystem og undersøkte parametre, eller som mikrogravitasjon er avbrutt av hypergravity faser og ledsaget av vibrasjoner. Under en parabolsk flytur, inkluderer hver av de 31 parabler normalt flydd 22 s av mikrogravitasjon og perioder med en
g Hotell og 1,8
g
, samt vibrasjon forårsaket av at motoren [14], [16].
for å undersøke de komplekse mekaniske påvirkninger som påvirker cellene i løpet av en parabolsk flytur, er det viktig å karakterisere påvirkning av kortsiktige hypergravity og vibrasjon på celler uten å utsette dem for mikrogravitasjon. Således utførte vi separate hypergravity og vibrasjon simuleringstester, ved anvendelse av metoder som simulerte akselerasjon profilen til en eller 31 parabler, så vel som de vibrasjoner som oppstår under hele uren. Videre fokuserte vi på uttrykket av cytokinene IL-6 og IL-8 samt protein kinaser.
Metoder
Cell Kultur
Den menneskelige skjoldbrusk kreft cellelinjer ML-1 [5] og CGTH-W1 [6] ble sådd ut i T75 cm
2 eller T25 cm
2 kulturflasker og matet RPMI 1640 medium (Invitrogen, Eggenstein, Tyskland) supplert med 10% føtalt bovint serum (Biochrom, Berlin, Tyskland), 100 enheter penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml, og vokst til samløpet.
Hypergravity Eksperimenter
Hypergravity ble generert ved hjelp av Multi Sample Incubator Sentrifuger ( musikk, DLR, Köln, Tyskland), som ble plassert i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Drevet av et spesielt dataprogram, ble cellene eksponert for en hypergravity profil som oppstår i løpet av en parabel (P1) og 31 parabler (P31). Denne enheten ble brukt til å behandle cellene, hvis mRNA ble bestemt senere. Confluently dyrkede celler fra cellekultur T75 kolber ble trypsinert og overført til 5 ml-rør. Rørene ble fylt med cellekulturmedium og cellene tillates å stabilisere seg før sentrifugering. Svarende til feste tider av cellene i løpet av en parabolsk uren ble cellene eksponert enten for en syklus av to 20-s-lang 1.8
g
faser avbrutt av en 22-s pause (P1) eller til to h varig 1,8
g
faser (P31). I tillegg har vi utført eksperimenter på den korte armen Humant Centrifuge (Sahc, DLR, Køln, Tyskland), med celler fra T75 cellekulturflasker på grunn av den høye mengden av materiale som er nødvendig for analysen. På denne enheten, utsettes vi cellene til en sammenhengende hypergravity fase av ca. 2 timer svarende til 31 parabler. Vi samlet n = 5 statisk en
g
kontroller og n = 5 1.8
g
hyper-
g
prøver for Western blot analyser (n = 5; P31), som samt n = 5 statisk en
g
kontroller (P1), n = 5 statisk en
g
kontroller (P31), og n = 5 1.8
g
hyper-
g plakater (P1 og P31) for real-time PCR, henholdsvis. Den en
g
kontroller ble dyrket i parallell i en nabo identisk inkubator.
Vibrasjons Eksperimenter
T25 kulturflasker som inneholder 90% konfluente monolag ble festet på Vibraplex plattformen i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2 i luft og ble behandlet i henhold til en protokoll som er publisert tidligere, [14]. I korthet, påføring Vibraplex ble cellene utsatt for vibrasjoner sammenlignbare med dem som forekommer i løpet av parabelflygninger [16]. Frekvenser fra 0,2 Hz til 14 kHz ble justert, tilsvarende de tre faser: trekke opp (1,8
g
), fritt fall (mikrogravitasjon, μ
g
), og trekk ut (1,8
g
), som er registrert og analysert av Schmidt [16] i løpet av omtrent to timer, som er hvor lenge de 31 parabler av ekte parabolske oppdrag siste. Deretter ble mediet fjernet og cellene skrapet av og samlet i 3 ml kaldt fosfatbufret saltvann (PBS). Etter en etterfølgende sentrifugering (4000 rpm), ble pelleten lagret ved -80 ° C for Western blot-analyse og PCR.
1
g
kontroller ble dyrket hver for seg i den samme inkubator. Vi samlet n = 5 statiske 1
g
kontroller og n = 5 2-timers vibrasjonsprøver for Western blot analyser (n = 5; P31) samt n = 5 prøver for real-time PCR, henholdsvis.
RNA Isolation
Cells for kvantitativ real-time PCR ble fikset med RNA
senere plakater (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) i forholdet 04:01. Deretter ble kolbene lagret ved 4 ° C. Umiddelbart før bruk ble RNAlater erstattet med PBS (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). Cellene ble skrapet av ved hjelp av celleskraper (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland), ble overført til rør og pelletert ved sentrifugering (2500 x
g
, 10 min, 4 ° C). RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner for å isolere total RNA. RNA-konsentrasjoner og kvalitet ble bestemt spektrofotometrisk ved 260 nm ved hjelp av en Nanodrop instrument (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Den isolerte RNA hadde en A260 /280-forhold på . 1.5
cDNA for kvantitativ real-time PCR ble deretter oppnådd med First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) ved hjelp 1 pg av total RNA i en 20-pl revers transkripsjon reaksjonsblandingen.
Kvantitativ real-time PCR
Kvantitativ real-time PCR ble anvendt for å bestemme uttrykket nivåer av genene av interesse. Den Primer Express ® programvare ble anvendt for å utforme passende primere med en T
m på ca. 60 ° C (tabell 1).
Primerene ble syntetisert ved TIB Molbiol (Berlin, Tyskland). Alle analyser ble kjørt på en StepOnePlus Real-Time PCR-system med strøm SYBR®Green PCR Master Mix (både Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Reaksjonsvolumet var 25 ul, herunder 1 ul av templat-cDNA og en avsluttende primer konsentrasjon på 500 nM. PCR-betingelsene var som følger: 10 min ved 95 ° C, 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C, etterfulgt av en smeltekurve analysetrinnet (temperatur-gradient fra 60 ° C til 95 ° C med + 0,3 ° C per syklus). Dersom alle amplikonene viste en enkelt T
m lik den som er forutsagt av Primer Express programvare, ble PCR-reaksjonene betraktes bestemt. Hver prøve ble målt i triplikat og vi anvendt sammenlignings C
T (ΔΔC
T) metode for kvantifisering av relative transkripsjonsnivåer. 18S rRNA ble anvendt som en husholdningsgenet for å normalisere vår ekspresjonsdata.
Western Blot analyse
Etter behandlingen prøver for Western blot-analyse ble fiksert ved tilsetning av etanol inntil en sluttkonsentrasjon på 70 %. For analysen ble SDS-PAGE, immunoblotting og densitometry utført på seks replikater følgende rutineprotokoller [17] – [19]. Antistoffer mot disse antigener ble brukt: α-tubulin, pan-aktin, β-aktin, moesin og ezrin (fortynningene var 1:1000, med unntak av pan-aktin, 1:4000). Alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology Inc. (MA, USA). For densitometrisk kvantifisering av båndene, ble farget membranene scannet og analysert ved bruk av bilde J (https://rsb.info.nih.gov/ij/) programvare [20]. Siden ingen passende protein ble funnet som kan tjene som en lasting kontroll under de undersøkte eksperimentelle betingelser, vi forsiktig lagt like mengder av protein (40 ug i 10 ul) på hver gel kjørefelt og normalisert de densitometriske data til denne verdien.
STRING 9.0 Nettverksanalyse
proteinene undersøkt ble ordnet. For hvert protein, ble UniProtKB oppføringsnummer og genet navnet kjøpt i UniProtKB og disse navnene ble brukt for nettverket generasjon med STRING 9,0 (www.string-db.org) [21]. De UniProtKB numrene ble satt inn i inntastings form som «flere proteiner» og «Homo sapiens» ble valgt som organismen. Den resulterende nettverket visningen ble lastet ned som a.jpg bilde.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 programvare (SPSSS, Inc, Chicago, IL, USA). Vi ansatt enten enveis ANOVA eller Mann-Whitney-U test der det er aktuelt. Forskjeller ble betraktet som signifikant på nivå med
p
0,05. Alle data er representert som betyr ± standardavvik.
Resultater
Valgte gener og proteiner
For å teste påvirkning av vibrasjoner og hypergravity på celle atferd, vi undersøkt to skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer. Vi vurderte cytoskeletal proteiner fordi vi tidligere hadde observert at cytoskjelettet ble påvirket under parabelflygninger [14]. Derfor fokuserte vi på gener og proteiner som er involvert i forming (aktin, myosin, tubulin, vimentin, Talin, og inte) og moduler (ezrin, radixin, og moesin) cytoskjelettet. Videre vi utforsket de kodingsvekstfaktorer (IL-6, IL-8, EGF, og CTGF) og protein kinaser (PRKCA og PRKAA1). Til tross for den funksjonelle mangfold av proteiner, danner de et nettverk av interaksjoner (fig. 1), med unntak av PRKAA1, den katalytiske subenhet av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) som spiller en nøkkelrolle i regulering av cellulær energimetabolisme.
Variasjon i mRNA uttrykk indusert av vibrasjons
Begge cellelinjer fortsatte å vokse i løpet av vibrasjon behandling som varer i to timer. Etterpå mikroskopisk observasjon viste at cellebinding fortsatt vedvarte. Imidlertid bestemmelse av mRNA konsentrasjoner av proteinene viste at ML-1 og CGTH-W1-celler ble påvirket på en annen måte ved vibrasjon. Mens bare
IL6
mRNA konsentrasjoner redusert i ML-1 celler, konsentrasjonene av de andre undersøkte transkripsjoner forble uendret (fig. 2). I CGTH W-1 celler, mRNA av
CTGF
,
IL6
,
ACTB
,
MSN, ITGB1
og
PRKAA1
ble oppregulert, mens
Tubb
mRNA ble nedregulert. Alle de andre mRNA-nivåer ble ikke påvirket av vibrasjoner (fig. 3). Derfor ML-1 celler viste seg å være mer motstandsdyktig mot vibrasjoner enn CGTH-W1 celler.
Differensial Gene Expression indusert av Kortsiktig Hypergravity
Under en parabolsk flytur , celler blir utsatt for vibrasjoner, så vel som til hypergravity. I tidligere flight forsøk [14], [15], observerte vi at store celleforandringer skjedde under den første parabel. Derfor her, eksponert vi cellene til en akselerasjonsprofil som oppstår under den første parabel. Selv under disse korte perioder (2 x 20 sekunder) med sentrifugering, signifikante endringer i transkripsjon av genene av interesse inntraff. I ML-1-celler, vi har oppdaget betydelig nedregulering av mRNA-konsentrasjoner på
IL6
og
IL8
, mens ingen signifikant endring ble observert for
tubb, MYO9, VIM, Esr; RDX; MSN, EGF, CTGF, PRKCA, etter og
PRKAA1 plakater (Fig. 4).
I CGTH W-1 celler, mRNA av
CTGF, IL6 , IL8, ITGB1, VIM, TLN1, MYO9B Hotell og
RDX
ble nedregulert, mens konsentrasjonene av de andre mRNA testet forble un-berørt (fig. 5). Igjen, ML-1 celler dukket opp mer motstandsdyktig enn CGTH W-1 celler, spesielt med hensyn til cytoskeletal proteiner.
Differensial mRNA uttrykk indusert av gjentatt eksponering for Hypergravity
Selv om de store effekten av en parabolsk flytur er sett etter første parabel, utsettes vi cellene til hypergravity som oppstår under en total av 31 parabler og undersøkte mRNA nivåer etterpå. Gjentatt eksponering for hypergravity snudd effektene av den første parabel på
IL6 Hotell og
IL8
mRNA nivåer i ML-1 celler. Nå,
IL6 Hotell og
IL8
transkripsjoner ble oppregulert, sammen med
CTGF, Esr Hotell og
RDX
mRNA (Fig. 4).
i CGTH W-en cellelinje, uttrykk for
ITGB1, VIM, MYO9, RDX, IL6, etter og
IL8
redusert etter P31, mens konsentrasjonene av syv typer av mRNA forble upåvirket (fig. 5). Resultatene viste at hypergravity som oppstår under 31 parabler i hovedsak opp-regulerer transkripsjon av våre satsings-gener i ML-1 celler, men nedregulerer dem i CGTH W-1 celler.
Endringer i intracellulær Protein konsentrasjoner indusert av vibrasjon eller Hypergravity som oppstår under 31 Parabler
Publiserte data om sammenhenger mellom intracellulære mRNA-nivåer og proteinkonsentrasjonen er inkonsistente [22] – [24]. Derfor, undersøkte vi proteinkonsentrasjonen av actin, tubulin, og moesin ezrin, i tillegg til de mRNA-konsentrasjoner. Ved hjelp av et antistoff som binder seg til alle varianter av aktin kjeder (pan-actin), observerte vi at pan-actin proteinkonsentrasjoner ble redusert i hver cellelinje etter hver type behandling sammenlignet med 1
g
kontrollceller ( fig. 6A, 7A). Protein nivåer av alfa-tubulin kjedene var annerledes i ML-en og CTGH W-1 celler. I ML-1-celler, proteinkonsentrasjonen ble redusert etter behandling vibrasjon og hypergravity eksponering, mens det motsatte ble observert i CGTH W-1-celler (Fig. 6C og 7C). I disse tilfellene er en direkte sammenligning mellom protein- og mRNA-konsentrasjoner var ikke mulig på grunn av ulike gener koder for proteiner kodet av antistoffene. Når vi brukte et antistoff rettet mot beta-aktin kjedene bare, som er kodet for av den
ACTB
genet, vi har oppdaget ingen endring i ML-1-celler etter behandling vibrasjon og økte konsentrasjoner etter eksponering for hypergravity. I CTGH W-1-celler, oppregulering av dette proteinet ble bemerket etter vibrasjon og en nedregule følgende hypergravity eksponering (fig. 6B og 7B). Således, protein og mRNA forandringer samsvarer godt i CGTH W-1 celler etter eksponering for vibrasjon (fig. 3, 7B), men ikke etter gjentatt hypergravity (fig. 5, 7B). Det var også en korrelasjon i ML-1-celler mellom protein og mRNA endringer som respons på vibrasjon (fig. 2), men ikke til hypergravity eksponering (fig. 4) [14]. I tillegg ble Western blot analyser utført for moesin og ezrin. I ML-1 celler ble bare ezrin påvirket av vibrasjoner, mens moesin og ezrin ble påvirket av hypergravity (Fig. 6D og 6E). I CGTH W-1 celler, begge typer proteiner var nedregulert ved vibrasjon, men bare moesin protein uttrykk redusert etter hypergravity (Fig. 7D og 7E). I disse tilfellene, protein og mRNA konsentrasjoner tilsvarte bare i tre av de åtte analysene (Fig. 3-7).
Diskusjoner
For å studere mulige påvirkning av vibrasjoner eller hypergravity på skjoldbruskkjertelen kreftceller, valgte vi proteiner som er involvert i å opprettholde eller modulerende cellestrukturer. Grunnen for å velge dem var på grunn av de tidligere observasjoner om at disse proteinene reagerer mest følsomt når cellene blir utsatt for mikrogravitasjons [8], [10], [12]. I tillegg har vi forsøkte å finne en direkte protein /gen målet for de mekaniske krefter som i sin tur utløste endringer i andre proteiner [25].
Proteinene som genene vi har undersøkt har ulike cellulære funksjoner. Aktin, myosin, tubulin, og vimentin er de viktigste komponenter av cytoskjelettet, støtte- og forsterkningscellestrukturen [26]. Ezrin og moesin tilhører ERM familien, som også inkluderer radixin. Disse proteinene kan interagere med både plasmamembranproteiner og trådformede aktin [27], og regulere organiseringen og dynamikken av aktin cytoskjelettet generelt [28]. Festet til aktin filamenter via Talin, integrin penetrerer cellemembranen og samvirker med den ekstracellulære matriks som omgir cellene. Denne koblingen er nødvendig for å overføre signaler fra cellemiljøet til det indre [29]. Epitelial vekstfaktor (EGF), bindevev vekstfaktor (CTGF) og interleukiner 6 og 8 er produsert av skjoldbrusk celler og handle på deres cytoskjelettet i en autokrin måte [30].
I denne studien sammenligning av protein og relaterte mRNA konsentrasjoner viste dårlig korrelasjon med hensyn til beta-aktin, ezrin og moesin. Dette kan forklares ved den nylige funn at celle overflod av proteiner blir hovedsakelig regulert på nivået av translasjon [31]. Likevel kan genuttrykk data gir viktig informasjon om cellestruktur variasjoner forårsaket av ulike stimuli.
Protein kinase C alfa tilhører protein kinase C familien og er en regulator av cytoskjelettet [32], [33]. På proteinnivået, blir den aktivert av kinase mTORC2 [34]. PKC-alfa-gen-ekspresjon kan modifiseres ved kjemikalier, vekstfaktorer og hormoner [35]. I vårt system, de fysiske krefter som påføres cellene påvirker ikke dette enzymet. I mange systemer, aktiverer PKC-alfa-genet ekspresjon av IL-6 [36], [37], som er et multifunksjonelt cytokin uttrykt ved humane thyrocytes [38], [39]. Vi observerte at
IL6
uttrykk ble endret, mens PKC-alpha genekspresjon vært upåvirket. Derfor konkluderte vi med at de observerte endringene i
IL6
mRNA-nivåer forekom uavhengig av PKC alpha. Det er kjent fra litteraturen at ulike reguleringsmekanismer er ansvarlig for
IL6
genuttrykk [40]. I FRTL-5 skjoldbrusk celler,
IL6
mRNA uttrykk forsterkes av mekanismer som involverer cAMP /PKA vei [41]. Videre, mekanisk stress eller strekk forsterker IL-6-produksjon i humane lunge epitelceller og glatte muskelceller via NFkB [42], [43]. Så langt vi kjenner til, det var ukjent inntil nå hvorvidt biomekaniske spenning indusert IL-6 produksjon i skjoldbrusk celler. Vi gjorde tidligere observerer at
IL6
genekspresjon ble forsterket i FTC-133 skjoldbruskkjertelen kreftceller, som forble tilhenger i 24 timer på RPM [12]. I endotelceller, ble det observert IL-6 følsomhet overfor simulert vektløshet.
IL6
genaktivering var høyere i tilhenger og tube dannende celler etter 5 dager på RPM enn i 1
g
kontrollceller. I løpet av de neste to dagene,
IL6
mRNA konsentrasjon redusert i heftende celler, men økte i tube dannende celler [44]. Disse endringene korrelerte godt med de i IL-6-protein nivåer, som høyere mengder av IL-6-protein ble utskilt i kultursupernatanten når endotelcellene ble inkubert på den RPM i 24 timer sammenlignet med kontrollceller. Denne effekten ble avskaffet i nærvær av bFGF [45].
Fra et vitenskapelig synspunkt, men det er enda mer interessant at mRNA konsentrasjoner av vekstfaktorer variert mer følsomt under påvirkning av de mekaniske kreftene som genereres ved hypergravity og vibrasjoner enn de mRNA-nivåer av proteiner som bygger eller modulerer cytoskjelettet direkte.
IL6
nivåer endres under hver behandling. Foruten
Esr
i ML-1 celler og
Tubb
i CGTH-W1 celler, skjedde alle transkripsjons endringer i samme retning som endring av
IL6
genet. Videre ble endringer i IL-6 protein beløp i kultursupernatantene observert tidligere, da endotelceller ble dyrket i henhold til endrede gravitasjonsforhold på en RPM [45]. Dermed konkluderer vi med at IL-6 spiller en viktig rolle når mekaniske krefter virker på menneskeskjoldbrusk celler
in vitro
. Hvis denne konklusjonen er sant, ville det forklare hvorfor så mange gen endringer er observert etter cellene er blitt utsatt for mikrogravitasjon [46], mens hele organismer påvirkes moderat i sammenlignbare perioder med eksponering. Hos mennesker
IL6
genuttrykk er nedregulert av hormoner som østrogen og testosteron [40]. Hormoner kontrollere
IL6
uttrykk er fraværende når isolerte celler dyrkes
in vitro
.
I fremtiden vil det være viktig å ta disse virkningene i betraktning når gjennomføre eksperimenter i ekte mikrogravitasjon. Spesielt de oppsett med lengre eller flere faser av hypergravity og vibrasjon, for eksempel parabolske fly, vil bli mer påvirket av dem. For lengre oppdrag i verdensrommet om bord på ISS hypergravity bør ikke være en faktor, men en viss vibrasjon som stammer fra de forskjellige maskiner så vel som fra astronautene selv (for eksempel under trening) vil også alltid være til stede og må vurderes . Ved hjelp av ulike celler, har vår gruppe har nylig forsøkt å analysere virkningen av hypergravity og vibrasjon på den samlede effekten av endret genuttrykk under parabelflygninger [47], og de første resultatene kan tyde på at mens hypergravity og vibrasjon indusere motsatte effekter fra de av mikrogravitasjon i cellene, er vektløshet den generelle sterkere stimulus. Men flere forsøk må gjennomføres for å avgrense disse resultatene, og de må også suppleres med langtidsstudier. Disse dataene vil være av stor betydning for vår fremtid romfart eksperiment (skjoldbruskkjertelen kreftceller i Space) på ISS i november i år.
Tatt sammen, observerte vi en påvirkning av vibrasjoner og hypergravity på genuttrykket av skjoldbruskkjertelen kreftceller. Bemerkelsesverdig er de to typer celler reagerte på en annen måte. ML-1 celler dukket opp mer motstandsdyktig mot vibrasjoner enn CGTH-W1 celler. Derfor kontroll eksperimenter på egnede sentrifuger og vibrasjon enheter er nødvendig for å tolke data innhentet fra mikrogravitasjon eksperimenter.
Takk
Vi vil gjerne takke fru Heidi Schou Knudsen for henne utmerket teknisk assistanse.
