Abstract
Prostatakreft (PCA) er en ledende dødsårsaken blant menn. Det er foreløpig anslått at inflammatoriske responser er knyttet til 15-20% av alle dødsfall av kreft på verdensbasis. PCa domineres av komplikasjoner som følge av metastaser til benet hvor tumorcellene interagere med benet mikromiljøet nedsetter balanse mellom bendannelse og nedbrytning. Imidlertid er den molekylære natur av denne interaksjonen ikke er helt forstått. Heme oksygenase-1 (HO-1) motvirker oksidativ skade og inflammasjon. Tidligere studier fra vårt laboratorium viste at HO-1 er innblandet i PCA viser at endogen HO-1 hemmer bein avledet-prostatakreftceller spredning, invasjon og migrasjon og reduserer tumorvekst og angiogenese
in vivo
. Målet med dette arbeidet var å analysere effekten av HO-1 modulert PCA celler på osteoblasts spredning
in vitro Hotell og på beinremodeling
in vivo
. Ved hjelp av en co-kultur system av PC3 celler med primær mus osteoblaster (PMOS), viste vi at HO-1 farmakologisk induksjon (hemin behandling) avskaffet reduksjon av PMOs spredning indusert av PCA celler og redusert uttrykk for osteoklastmediert modulerende faktorer i osteoblasts . Ingen endringer ble funnet i uttrykket av gener som er involvert i osteoblaster differensiering. Men co-kultur av hemin forbehandlede PC3 celler (PC3 Hem) med PMOs provosert en oksidativ status og aktivert FoxO signalering i osteoblaster. Prosentandelen av aktive osteoblaster positive for HO-1 økt i calvarias explants co-dyrket med PC3 Hem celler. Nuclear HO-1-ekspresjon ble påvist i tumorer generert ved in vivo ben injeksjon av HO-en stabil transfektert PC3 (PC3HO-1) -celler i femur av
SCID-mus
. Disse resultater antyder at HO-1 har potensial til å endre benet mikromiljøet innvirkning på PCa benmetastase
relasjon:. Ferrando M, Wan X, Meiss R, Yang J, De Siervi A, Navone N, m.fl. . (2013) Heme oxygenase-1 (HO-1) Expression i prostata kreft celler modulerer Oksidativt Response i beinceller. PLoS ONE 8 (11): e80315. doi: 10,1371 /journal.pone.0080315
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 29 august 2013; Godkjent: 06.10.2013; Publisert: 04.11.2013
Copyright: © 2013 Ferrando et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Universitetet i Buenos Aires, Argentina, UBACyT (20020100100179) og ANPCYT (PICT Raices 2010-0431). M. F. holdt stipend fra CONICET og UICC International Cancer Technology Transfer Fellowship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
benmetastaser dominere det kliniske bildet av avansert prostatakreft (PCA) og er ansvarlig for det meste av dødelighet og sykelighet av sykdommen. Metastaser ben kan ha enten en osteolytisk (ben-resorberende) eller et osteoblastisk (ben produserende) fenotype. PCa produserer karakteristisk osteoblastiske lesjoner i ben, selv om en osteolytisk komponent er alltid til stede.
Det er blitt foreslått at inflammasjon øker prostata tumorigenesis [1]. Cytokiner, kjemokiner og matriksmetalloproteinaser er en del av et proinflammatorisk nettverk som bidrar til ondartet progresjon [2]. Faktisk proinflammatoriske faktorer som utskilles av PCa og benceller og den påfølgende frigjøres faktorer fra den organiske matriksen i benet, formidler en parakrin /autokrin interaksjonen mellom PCA-celler, osteoblaster og osteoklaster, som til slutt bestemmer benet fenotype og progresjon av PCa [3- , 4].
oksidativt stress er en naturlig konsekvens av inflammatoriske prosesser og virker som en modulator av funksjon av mineralisert vev [5]. Det påvirker bendannelse ved inhibering av differensiering av osteoblaster og fremme apoptose [6]. Disse effektene formidles delvis av reaktive oksygenarter (ROS) som genereres i forbindelse med oksidativt stress. Celler motvirke de negative virkningene av ROS ved å aktivere ulike forsvarsmekanismer, inkludert induksjon av frie radikaler scavenging enzymer som mangan superoksid dismutase (MnSOD), katalase, og også DNA reparasjonsgener. Dette svaret krever aktivering av en familie av allestedsnærværende kjente faktorer som gaffelhode transkripsjon boksen O (FoxO) [7], som gjennom samhandling med β-catenin reduserer oksidativt stress og fremmer osteoblasts overlevelse [6].
Heme oxygenase 1 (HO-1), det hastighetsbegrensende enzym i heme degradering, ble vist å gi cytobeskyttelse mot oksidativt stress og inflammasjon i flere dyremodeller [8]. Tidligere rapporter fra vårt laboratorium dokumentert for første gang den kjernefysiske ekspresjon av HO-1 i humane primære prostata karsinomer [9]. Vi dokumenterte også at HO-1 hemmer celledeling, migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og svekker PCa tumorvekst
in vivo product: [10]. I tillegg har vi tidligere har etablert en viktig rolle for HO-en som en modulator av den angiogene bryter i prostata karsinogenese [11]. Videre viste vi bevis på at den anti-angiogene funksjon av HO-1 er mediert ved undertrykkelse av nukleær faktor kappa-lettkjede-enhancer av aktiverte B-celler (NF-kB) signaleringsreaksjonsveien [11]. Nylig rapporterte vi en ny funksjon for HO-1 ved PCA. Vi viste at HO-en down-modulerer AR transkripsjonen aktivitet ved å forstyrre STAT3 signalering og gitt bevis for sin rolle utover heme degradering [12].
De som presenteres her ble utført ved hjelp av et bein avledet osteolytic PCa cellelinje studier (PC3) som har blitt vist å inhibere osteoblast proliferasjon
in vitro
i en ko-kultursystem med primærmuse osteoblaster (PMOs) [13]. I denne artikkelen rapporterer vi data som støtter en ny funksjon for HO-1 i samspillet mellom PCA celler og bein. Vi fant ut at HO-en induksjon i PC3 cellene restaurert spredning av osteoblaster, som ble hemmet ved samtidig kultur med foreldre PC3 celler. Våre studier tyder på at disse effektene medieres ved aktivering av FoxO signalering i osteoblaster. PC3 celler som overuttrykker HO-1 (PC3HO-1) vokser i beinet av mus, produsert svulster med kjernefysiske lokalisering av HO-1 som oppdages ved immunhistokjemi. Disse data indikerer at HO-1 spiller en rolle i progresjon av PCa i ben. En bedre forståelse av de molekylære mekanismene bak samspillet mellom PCA celler og bein mikromiljøet kan bidra til å identifisere nye mål for farmakologisk intervensjon i denne sykdommen.
Materialer og Metoder
cellekulturer og Antistoffer
prostatacancer-cellelinjen PC3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og rutinemessig dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). PC3 stabile transfekterte celler (PC3HO-1 og PC3βgal) ble samlet som tidligere beskrevet [10]. Musen myoblast cellelinje C2C12 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og ble dyrket i DMEM lav-glukose (Invitrogen, CA, USA) med 10% FBS. Primære kulturer av muse osteoblaster (PMOS) ble etablert ved en fremgangsmåte publisert tidligere [13] og ble oppnådd fra calvaria av nyfødte CD1 mus avlivet 4 dager etter fødselen. Isolerte celler ble sådd ut i α-MEM (Invitrogen, CA, USA) pluss 10% FBS i 48 timer. De PMOs ble deretter senere trypsinert og replated i kultur retter til å utføre eksperimenter. Antistoffer: anti-HO-en var fra Stressgen Bioteknologi, Corp. (San Diego, California, USA), anti-β-catenin var fra BD Transduksjon Laboratories ™ (CA, USA), anti-β-aktin var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), anti-cyklin B1, anti-cyklin A, anti-cyklin D1, anti-p21, anti-β-tubulin, anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. ( CA, USA) og Alexa Fluor® 594-konjugert sekundært antistoff fra Invitrogen (CA, USA).
Hemin forbehandling av PCA celler og co-kultur system
En
i vitro
bicompartment kultursystem ble anvendt som en modell av skjelettmetastaser fra PCa som tidligere beskrevet noe modifisert [13]. I korte trekk, ble på dag 0 PC3 celler sådd (10500 celle /cm
2) i celle-kultur innsatser (0,4 mm pore, Falcon /Becton Dickinson Laboratorium, Franklin Lakes, NJ, USA) og på dag 1 var de behandlet med hemin (80 mikrometer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), en potent induser av HO-1 (PC3 Hem). Styrer fikk frisk medium. PMOS ble også utsådd på dag 1 i vevskulturplater (7300 celle /cm
2). På dag 2, ble innsatsene som inneholder PC3-celler (forhåndsbehandlet eller ikke med hemin) grundig vasket med PBS. Deretter ble de innsatser anbrakt i vev-kultur plater inneholdende de PMOs slik at de to forskjellige celletyper delt i kulturmediet, men var ikke i fysisk kontakt. Ko-dyrking av PC3-celler med PMOs ble utført med α-MEM pluss 2% FBS i 24 timer. På dag 3 ble cellene oppsamlet og ulike parametere ble analysert. Som kontroll, hver celletype (PC3-celler forhåndsbehandlet eller ikke med hemin og PMOs) ble dyrket alene. Co-kulturer av C2C12 celler og PC3 ble gjort i de samme forhold som PMOs og PC3 celler. Kulturer ble gjort i tre eksemplarer og hvert forsøk ble analysert tre ganger.
mitogen analysen
spredning og DNA-syntese ble vurdert ved å legge til [
3H] -tymidin (Amersham Biosciencies) under slutt 3 timer med ko-kultur, og inkorporering ble målt som beskrevet andre steder [14].
RNA isolering og RT-qPCR (revers transkripsjon kvantitativ PCR)
Total RNA ble isolert med RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA ble syntetisert med RevertAid RT (Fermentas) og forsterkes av real-time PCR forsterkning med Taq DNA Polimerase (Fermentas). Primere ble utformet ved hjelp av Beacon Designer 5 og testet med UCSC Genome Browser hjemmeside URL. PCR ble utført i et DNA-motor Opticon (MJ Research). Humane primersekvenser ble gitt som følger: ACTB 5′-AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 «og 5′-CATACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′; HO-1 5′-GAGTGTAAGGACCCATCGGA-3’og 5′-GCCAGCAACAAAGTGCAAG-3′; PTHrP 5′-GTCTCAGCCGCCGCCTCAA-3’og 5′-GGAAGAATCGTCGCCGTAAA-3′; uPA 5′-GAGATCACTGGCTTTGGAAAA-3’og 5′-CCAGCTCACAATTCCAGTCA-3′; TGF-β1 5»-TACCTGAACCCGTGTTGCTC-3 «og 5′-GCGAAAGCCCTCAATTTCCC-3». Muse primersekvenser ble gitt som følger: ACTB 5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3 «og 5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3′; Runx-2 5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3’og 5′-AGGCATTTCGGAGCTCGGCG-3′; ALP 5′-AACCCAGACACAAGCATTCC-3’og 5′-GAGACATTTTCCCGTTCACC-3′; Col1a1 5′-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3’og 5′-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3′; Col1a2 5′-GCAGGTTCACCTACTCTGTCCT-3’og 5′-CTTGCCCCATTCATTTGTCT-3′; OCN 5′-GCAGCTTGGTGCACACCTAG-3’og 5′-GGAGCTGCTGTGACATCCATAC-3′; RANKL 5′-TGATTCATGTAGGAGAATTAAACAGG-3’og 5′-GATGTGCTGTGATCCAACGA-3′; OPG 5»-GAAGGGCGCTACCTTGAGAT-3 «og 5′-GCAAACTGTATTTCGCTCTGG-3′; CSF-en 5′-CAACAGCTTTGCTAAGTGCTCTA-3’og 5′-CACTGCTAGGGGTGGCTTTA-3′; OPN 5′-CTTTCACTCCAATCGTCCCTA-3’og 5′-GCTCTCTTTGGAATGCTCAAGT-3′; CCL2 5′-TGCTACTCATTAACCAGCAAGAT-3’og 5′-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3′; IL-6 5»-CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-3 «og 5′-GAAGTAGGGAAGGCCGTGG-3′; MnSOD 5′-CCACACATTAACGCGCAGATC-3’og 5′-TAACATCTCCCTT GGCCAGAGC-3′; katalase 5′-TTGCTGAAGTTGAACAGATGG-3’og 5′-ATCACGCTGGTAGTTGGC-3».
Western blot analyse
For western blotting, 50 mikrogram av protein ble separert på 12% Tris-glysin polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (BIORAD POWERPAC Basic). De spesifikke proteiner ble påvist ved kjemiluminescens (Amersham) som tidligere beskrevet [10].
Plasmider, transfeksjoner og luciferase reporter assay
A TOP-flash-reportergen-konstruksjonen som inneholder fire konsensus TCF-bindingsseter, en minimal Fos bindingssete og et luciferase reporter ble brukt [15]. En FOP-flash konstruere med en mutert TCF bindingssete ble brukt som en negativ kontroll. En reporter plasmid som inneholder 6 kopier av daf-16 familien proteinbinding element (FoxO-Luc) i pGL3-grunn ildflue luciferase vektor med en minimal TATA boks [16] ble vennlig levert av B. Burgering, University Medical Center, Utrecht, Nederland . Luciferaserapportørplasmid konstruksjoner ble innført i C2C12-celler ved transient transfeksjon anvendelse av 8 ug av PEI og 4 ug av plasmidet. Etter 6 timer ble mediet fjernet og C2C12 ble ko-dyrket med PC3-celler forbehandlet eller ikke med hemin eller dyrket alene i 24 timer. C2C12 Cellene ble deretter høstet og lysert med 40 ul Steady Glo Luciferase System (Promega, Madison, WI, USA). Luciferase-aktivitet ble målt i et luminometer (Glomax Multi Detection System, Promega). Som positiv kontroll av TCF bindingsseter aktivering, PMOs ble behandlet med 10 mM LiCl i 24 timer og av FoxO-luc-aktivering, ble cellene eksponert for H
2o
2 100 uM i 24 timer. Hver transfeksjon ble utført i triplikat, og hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Data ble normalisert til total-protein bestemt ved Bradford-analysen.
Vurdering av reaktive oksygenforbindelser ved flowcytometri
Etter ko-kulturen, PMOS ble vasket med PBS og inkubert med 10 pM 2- «, 7»- Dichlorofluorescein diacetat (CM2-DCFHDA; Invitrogen-Molecular Probes
TM) i 1 time ved 37 ° C. Cellene ble tripsined og resuspendert med PBS. Nivåene av H
2DCFDA ble målt ved strømnings citometry i FITC-kanalen.
Cell syklus
Etter ko-kulturen, ble PMOs fiksert og farget med propidiumjodid (PI), og analysert ved fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) som tidligere beskrevet [17].
immunfluorescens
PMOs samtidig var dyrket som beskrevet tidligere, men seedet på dekkglass. De immunfluorescens Analysene ble utført som tidligere beskrevet [12]. Bredt felt mikroskopi ble utført med et Olympus IX71 mikroskop med en nedsenking i vann objektiv (UPLSAPO 60XW 1,2 AN, Olympus). Bilder ble tatt med kameraet Hamammatsu Orca-ER du bruker programvaren Andor IQ og ble behandlet for presentasjon med ImageJ (https://rsb.info.nih.gov, National Institutes of Health).
Immunhistokjemisk analyser
immunohistokjemisk teknikk ble utført som tidligere beskrevet [9,10]. For kvantitativ analyse, ble det totale antall av osteoblaster i minst 6 felt telles og prosentandelen av osteoblaster med positiv immunoreaktivitet for det studerte genet ble beregnet.
Organ kultur
calvaria fra fire dager gamle CD1 museunger var avgiftsdirektoratet, halvert og plassert i BGJ medium (Sigma Aldrich) som inneholder 0,1% bovint serum albumin på en cellekultur innsats som suspenderer bein organ mellom atmosfære og medium for optimal CO
2 utveksling. Halvparten av hver calvaria var co-dyrket med PC3 celler forbehandlet med hemin og den andre halvparten med PC3 ubehandlede celler. Andre calvarias ble plassert i BGJ medium inneholdende 0,1% bovint serumalbumin og anvendt som kontroller. Andre halvdeler behandlet med insulin 20 ug /ml ble anvendt som positive kontroller av bendannelse. Det tilsvarende PC3 kulturen og mediet ble skiftet hver 2. dag, og eksperimentet ble avsluttet ved slutten av 7 dager. På den tiden ble calvaria halvdeler fast, decalcified, parafin-embedded, seksjonert, farget med hematoxylin og eosin eller immunhistokjemisk stainned og analysert som tidligere beskrevet [13].
In vivo
prostata kreft intrabone modell
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med aksepterte standarder for dyr omsorg og ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk
Utvalget ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. PC3HO-1 eller PC3βgal-celler ble injisert inn i lårben til mannlig SCID-mus (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) som tidligere beskrevet [13]. 3 x 10
5 PCA celler per mus ble injisert med en 28-gauge nål inn i de distale endene av høyre femur i 6- til 8-uker gamle hann intakt SCID-mus (n = 7 pr gruppe) i henhold til fremgangsmåter beskrevet andre steder. Bendannelse ble bestemt ved røntgenanalyse. Ved slutten av eksperimentet ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon etter anestesi med isofluran, (levert av åpne- * dråpemetode *), hvoretter bakbeina ble fjernet, og muskelvev ble dissekert fra bein av både den injiserte og styre baklemmene av mus med de femoral xenografter. De dissekert bein ble deretter behandlet for histologisk.
Statistisk analyse
Alle resultater er gitt som gjennomsnitt ± SD av 3 separate uavhengige eksperimenter med mindre annet er oppgitt. Student t test ble brukt for å fastslå statistisk signifikans med en terskel på
P
0,05 (*),
P
0,01 (**) og
P
0,05, henholdsvis) (figur 1 A B ). Merkbart, co-kulturen i PMOs med PC3 Hem restaurert osteoblasts spredning på nivåer som finnes i PMOs voksende alene (Figur 1 A B), som også markerer det pro-homeostatic rollen HO-1. Induksjon av HO-1 uttrykk i PC3 cellene ble bekreftet ved mRNA og proteinnivåer (figur 1).
Forsøk ble gjort i PMOs dyrket alene (PMO), co-kultivert med PC3 (PMO PC3) eller med PC3 forbehandlet med hemin (PMO PC3 Hem). A: Celleproliferering ble målt ved
3H-tymidin inkorporering i PMOs etter 24 timer kultur. Resultater er uttrykt som en prosent av den monokultur PMOs satt til 100%. B: PMOs celle nummer. C: Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av anti-cyklin B1, A, og D1 og anti-p21
WAF1 /CIP1 antistoffer. Tallene under band indikerer kvantifisering normalisert p-Tubulin og PMOs alene. En representant fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist (Signifikant forskjell, *
P
0,05; Ingen signifikant forskjell, NS)
Analysene av proteiner involvert i cellesyklus. regulering av immunblotting i PMOs etter ko-kultur med PC3 Hem viste en økning i nivåene av cyklin A, cyclin B og cyklin D1, med en samtidig reduksjon i p21
WAF1 /CIP1 ekspresjon sammenlignet med PMOs dyrket i ko-kulturen med PC3 kontrollceller (figur 1C). Videre flowcytometrisk analyse av PMOs etter ko-kultur med PC3 Hem demonstrert betydelig øket på G2 /M akkumulering sammenlignet med PMOs ko-kultur med PC3 kontrollceller (
P
0,05) (data ikke vist) . Alle disse data tyder på at HO-1 uttrykk i PCA celler induserer cellesyklusprogresjon i PMOs, gjenopprette veksten av PMOs alene. Det er verdt å bemerke at antall PC3 cellene ikke ble endret i de forskjellige co-kultur forhold analysert (data ikke vist).
HO-1 uttrykk i PC3 cellene endrer ikke effekten av kreftceller på osteoblaster differensiering
Transcript nivåer av ulike osteoblasts spesifikke gener ble vurdert av RT-qPCR. Ekspresjonen av osteoblaster spesifikke transkripsjonsfaktor Runx-2, av en tidlig differensieringsmarkør (alkalisk fosfatase, ALP), sene differensieringsmarkører som er involvert i kollagene matriks nedfall (kollagen type I og kollagen type II) og ikke-kollagene matriks nedfall (osteocalcin , OCN) ble analysert. Vi fant at Runx-2-ekspresjon ble øket i PMOs ko-dyrket med PC3 Hem (130%,
P
0,05) (figur 2 A), men ingen forskjeller ble funnet i nivåene av ALP, kollagen type i og II i PMOs økende alene eller i ko-kultur med PC3 Hem eller PC3 kontrollceller (figur 2 BD). OCN nivåene ble betydelig redusert i PMOs co-dyrket med PC3 Hem eller PC3 kontroller (81% og 68%,
P
0,01; henholdsvis) (figur 2 E). I overensstemmelse med tidligere rapporter [13,19,20], PMOs ko-dyrket med PC3-celler viste en nedgang i forkalket matrisedannelse, som bedømt ved von Kossa-farging sammenlignet med PMOs voksende alene (figur 2). Ingen endring ble oppdaget på forkalket matrix når PMOs samtidig var dyrket med PC3 Hem (figur 2). Disse resultater viser at PC3-utskilte faktorer som er rapportert å være ansvarlig for inhibering av osteoblaster differensiering [13], endres ikke ved HO-1-ekspresjon induseres i tumorceller.
Forsøk ble utført i PMOs dyrket alene (PMO), co-kultivert med PC3 (PMO PC3) eller med PC3 forbehandles med hemin (PMO PC3 Hem). Totalt RNA ble ekstrahert og Runx-2 (A), ALP (B), kollagen type I (C), kollagen type II (D) og OCN (E) mRNA-nivåene ble analysert ved hjelp av RT-qPCR. Data ble normalisert til p-aktin og ble uttrykt som ganger induksjon i forhold til PMOs. En representant fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist (Signifikant forskjell, *
P
0,05; **
P
0,01).
HO -1 uttrykk i PC3 cellene redusert nivåene av osteoklastmediert modulerende faktorer i osteoblaster
Receptor Activator av nukleær faktor kappa-B ligand (RANKL) og osteoprotegerin (OPG) er produsert av osteoblastiske /stromale celler. RANKL har vist seg å aktivere modne osteoklaster og megle osteoclastogenesis. OPG fungerer som en lokkedue reseptor for RANKL [21]. Den co-kulturen i PMOs og PC3 Hem celler produsert en økning i RANKL og en nedgang i OPG transkripsjonsnivåer i osteoblasts; det samme resultatet ble observert etter samtidig kultur PMOs med PC3 kontrollceller (figur 3 A B).
Forsøk ble gjort i PMOs dyrket alene (PMO), co-kultivert med PC3 (PMO PC3) eller med PC3 forbehandles med hemin (PMO PC3 Hem). Totalt RNA ble ekstrahert og RANKL (A), OPG (B), CSF-1 (C), OPN (D), CCL2 (E) og IL-6 (F) mRNA-nivåene ble analysert ved hjelp av RT-qPCR. Data ble normalisert til p-aktin og ble uttrykt som ganger induksjon i forhold til PMOs. En representant fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist (Signifikant forskjell, *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
. 0,001)
Osteoblaster også produsere cytokiner og andre vekstfaktorer som fremmer utvikling osteoklaster og aktivering, så som kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1), osteopontin (OPN), chemokine (CC motiv ) ligand 2 (CCL2) og interleukin-6 (IL-6). Vi fant ut at PMOs co-dyrket med PC3 Hem uttrykt betydelig lavere transkripsjonsnivåer av Csf-1, OPN og CCL2 i forhold til PMOs dyrket alene (52%,
P
0,01; 53%,
P
0,001 og 52%,
P
0,05, henholdsvis). Ingen forskjeller ble påvist i IL-6 nivåer (figur 3 C-F).
PCA celler uttrykker også gener indirekte involvert i osteoklaster modulering. Derfor bestemte vi oss for å undersøke ekspresjon i PC3 celler av parathyroid-hormon-relatert peptid (PTHrP), urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) og transformerende vekstfaktor beta 1 (TGF-β1) ved RT-qPCR og aktiviteten av matriks-metallproteaseaktivitet 9 (MMP9) ved zymografi. Ingen forskjeller ble observert i de transkripsjonene nivåer av utvalgte gener eller i aktiviteten av MMP9 (figur 4), noe som indikerer at disse genene innblandet i osteoklaster modulering ikke blir endret i PC3-celler under de eksperimentelle betingelser, enten forbehandlet eller ikke med hemin dyrking alene eller i ko-kulturen.
PC3-celler ble forbehandlet med hemin (80 uM, i 24 timer, sorte kolonner) eller ikke (kontroll, hvite kolonner) og ko-dyrket med eller uten PMOs. Totalt RNA ble ekstrahert og PTHrP (A), ble uPA (B) og TGF-β1 (C) mRNA-nivåer analysert ved RT-qPCR. Data ble normalisert til p-aktin og ble uttrykt som ganger induksjon i forhold til PC3. Gelatin zymografi ble gjort for å vurdere MMP9 aktivitet på aircondition media fra PC3 dyrket alene (PC3), forbehandlet med hemin (PC3 Hem) og fra PMOs dyrket alene (PMO) og co-kultivert med PC3 forbehandlet eller ikke med hemin ( PMO PC3 Hem og PMO PC3, henholdsvis). Klare band ble kvantifisert ved hjelp ImageJ 1.37.v programvare (NIH) og normalisert til total protein. En representant fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist (NS: Ingen signifikant forskjell, RV: relative verdier).
Begynnende osteoblaster oksidativ status ved co-kultur med hemin pre-behandlede PC3 celler
Tidligere rapporter tyder på at oksidativt stress fører til redusert osteoblasts nummer og beindannelse rente [22]. For å undersøke om PCA-celler induserer oksidativt stress i osteoblaster, brukte vi vår ko-kultursystem for å analysere ekspresjon av antioksydant responsgener (MnSOD, katalase og HO-1). Den co-kulturen i PMOs med PC3 Hem eller PC3 kontroller økte transkripsjonsnivåer av MnSOD (134% og 206%,
P
0,05, henholdsvis) og katalase (95% og 35%,
P
0,05, henholdsvis) i PMOs (figur 5 A og B). Interessant, HO-1 protein uttrykk i osteoblaster co-dyrket med PC3 Hem eller PC3 kontrollene var sterkt induserte forhold til PMOs voksende alene (Figur 5 C). For å bestemme oksidativt stress, ble produksjonen av ROS målt ved flowcytometri overvåking H
2DCFDA oksidasjon. Betydelige økte nivåer av ROS ble funnet i PMOs co-dyrket med PC3 Hem sammenlignet PMOs voksende alene (15%,
P
0,01) (figur 5 D). Sammen disse funnene tyder på at indusert HO-1 uttrykk i PC3 celler utgivelser løselige faktorer som fører til oksidativt stress i PMOs. Dette i sin tur induserer en antioksidant respons trolig favorisere osteoblasts spredning [6].
Forsøk ble gjort i PMOs dyrket alene (PMO), co-kultivert med PC3 (PMO PC3) eller med PC3 forbehandlet med hemin ( PMO PC3 Hem). Totalt RNA ble ekstrahert og MnSOD (A) og katalase (B) mRNA-nivåene ble analysert ved hjelp av RT-qPCR. Data ble normalisert til p-aktin og ble uttrykt som ganger induksjon i forhold til PMOs. HO-1 proteinnivåer (C) ble bestemt ved Western blot-analyse. Tallene under band indikerer kvantifisering normalisert p-aktin og PMOs alene. ROS nivåer (D) ble bestemt i PMOs inkubert med CM2-DCFHDA og målt ved flow citometry i FITC kanal (Signifikant forskjell, *
P
0,05; **
P
0,01).
HO-1 uttrykk i PC3 cellene aktiveres FoxO signalisering i C2C12 celler
For å identifisere signalveier aktivert av oksidativt stress i osteoblaster, analyserte vi β-catenin /Foxo aksen. Selv om kanonisk Wnt /β-catenin pathway spiller en sentral rolle i å regulere osteoblastdifferensiering og beindannelse, er det velkjent at løselig β-catenin samhandler med FoxO transkripsjonsfaktorer som svar på oksidativt stress [6]. For å studere dette signalveien vi brukte en reporter konstruksjon med seks FoxO responselementer. På grunn av vanskeligheten med å transfektere PMOs, benyttet en ukommitert mesenchymale cellelinje C2C12, i stand til å differensiere til den osteoblastiske avstamning [23]. Den ko-kultur av C2C12-celler med PC3 Hem stimulerte sterkt aktiviteten av reportergenet (figur 6 A). Som positiv kontroll C2C12 kulturer ble utsatt for H
2o
2 (100 mm) (figur 6 A). Resultatene er skissert her tyder på at løselige faktorer produsert av PC3 Hem indusere FoxO signalering i osteoblaster.
Øvre panel. Forsøkene ble gjort i C2C12 dyrket alene (C2C12), co-kultivert med PC3 (C2C12 PC3) eller med PC3 forbehandlet med hemin (C2C12 PC3 Hem). A: Cellene ble transfektert med en FoxO reportergen-konstruksjonen (FoxO-luc). H
2o
2 ble anvendt som en positiv kontroll. B: Cellene ble transfektert med en TCF reporter gen konstruksjon (TOP-flash) eller dens negativ kontroll (FOP-flash). LiCl var en positiv kontroll. Seks timer etter transfeksjon, at C2C12-celler ble ko-dyrket og 24 timer etter ko-dyrking av C2C12-celler ble lysert og luciferase aktivitetsanalyse ble utført. Data ble normalisert til proteinverdier. En representant fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist (Signifikant forskjell, *
P
0,05). Nedre panel. C: p-catenin cellulær fordeling ble visualisert ved hjelp av immunofluorescens-farging (rød) av PMOs dyrket alene (PMO), ko-dyrket med PC3 (PMO PC3) eller med PC3 forbehandlet med hemin (PMO PC3 Hem). Kjernen ble merket ved hjelp Hoescht flekk (grønn). Slå sammen representerer de overlappende bilder. En representant bilde for hver gruppe vises. Skala: 30 mikrometer.
I Wnt kanoniske vei, β-catenin aktivering resulterer i stabilisering av protein translokasjon inn i kjernen, hvor den kommuniserer med TCF (T-celle faktor, HMG boks) og aktiverer transkripsjon av målgener [24]. Det har blitt foreslått at Foxo avlede β-catenin fra Wnt kanoniske veien [6]. For å vurdere om Wnt kanoniske sti i PMOs er endret etter at co-kultur med PCA celler, undersøkte vi β-catenin subcellulære lokalisering og TCF aktivering i PMOs vokser alene eller i co-kultur med PC3 Hem og PC3 kontrollceller. Bildene viste i figur 6 C viser at β-catenin finnes både i kjernen og i cytoplasma i alle de analyserte forhold. For å evaluere aktivering av β-catenin /TCF vei vi brukt et reportergen. Vi co-kultivert PC3 celler forbehandlet eller ikke med hemin med C2C12 celler som hadde blitt transfektert med en TCF reporter gen konstruksjon (TOP-flash) [15]. C2C12-celler behandlet med LiCl (20 mM) ble anvendt som en positiv kontroll og FOP-flash-reporter-aktivitet som en negativ kontroll. Ingen forskjeller i TCF reporter aktivitet ble registrert da C2C12 cellene ble dyrket alene eller co-kultivert med PC3 Hem eller PC3 kontrollceller (figur 6 B).
Bone explant co-dyrking med PC3 celler induserer HO-1 uttrykk
For å utvide disse resultatene, vi brukte et bein organ kultur analysen. PC3 Hem eller PC3 kontrollceller samtidig var dyrket med musen calvaria explants. Histologisk analyse viste ingen forskjeller i bendannelse når calvarias ble dyrket alene (kontroll) eller i ko-kultur (figur 7 A-C). Bruke immunhistokjemi teknikken vi neste utforsket uttrykk for HO-1.
