Abstract
mikrotubuli er en svært validert mål i kreftbehandling. Imidlertid har den kliniske utviklingen av tubulin bindemidler (TBA) blitt hemmet av toksisitet og chemoresistance problemer og har gjort det nødvendig å lete etter nye låns-TBAer. Her rapporterer vi identifikasjon av en ny cellepermeable, tubulin-destabiliserende molekyl – 4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indazol-3-karboksylsyre [1 p-tolyl-met (E) yliden] -hydrazide (betegnet som Suprafenacine, SRF). SRF, identifisert av
i silico
screening av kommenterte kjemiske biblioteker, ble vist å binde mikrotubuli på kolkisin-bindingssetet og hemme polymerisasjon. Dette førte til G
2 /M cellesyklus arrest og celledød via en mitokondriene-mediert apoptotiske sti. Celledød ble innledet av tap av mitokondriemembranen potensial, JNK – mediert fosforylering av Bcl-2 og Bad, og aktivering av caspase-3. Intriguingly, SRF ble funnet å selektivt hemme kreftcelleformering og var effektiv mot legemiddelresistente cancerceller i kraft av sin evne til å omgå den multimedikamentresistens transportøren P-glykoprotein. Til sammen tyder våre resultater at SRF har potensiale som et kjemoterapeutisk middel for behandling av kreft og gir en alternativ stillas for utvikling av forbedrede anti-kreftmidler
relasjon:. Choi BH, Chattopadhaya S, Thanh LN, Feng L, Nguyen QT, Lim CB, et al. (2014) Suprafenacine, en Indazol-hydrazide Agent, Targets kreftceller Gjennom microtubule destabilisering. PLoS ONE 9 (10): e110955. doi: 10,1371 /journal.pone.0110955
Redaktør: Ben CB. Ko, The Hong Kong Polytechnic University, Hong Kong
mottatt: 10. oktober 2012; Godkjent: 26 september 2014; Publisert: 29 oktober 2014
Copyright: © 2014 Choi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Helsedepartementet Singapore Grant NMRC1177 /2008. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
– mikrotubuler lange, trådformede, slangeformede polymerer – medierer en viktig rolle i cellulær signalisering, transport av last, etablering av celle polaritet, vedlikehold av celleform, cellulær migrasjon og celledeling [1], [2]. Består av a- og p-tubulin heterodimerer bundet i en head-to-tail måte, mikrotubuli er ikke enkle likevekts polymerer; i stedet de er svært dynamiske strukturer og de raske monterings- og demonterings dynamikk er avgjørende, i stor grad for sine cellulære funksjoner. Ikke overraskende er mikrotubuli-polymerisering gjenstand for tett romlig og tidsmessig regulering og dette oppnås på flere nivåer, inkludert (1) transkripsjon av forskjellige isotyper tubulin som har forskjellige funksjoner; (2) ved å regulere α /β – tubulin-forhold og heterodimer folding (3) gjennom en rekke post-translasjonelle modifikasjoner av tubulin, som i sin tur endrer mikrotubulus lokalisering og /eller dets interaksjon med signalveier, og (4) via interaksjon med microtubule- tilhørende proteiner (Maps) som dynein og kinesin motor proteiner, stathmin, TOG, EB1, dynactin 1, Rac1 etc [3] – [5]. Paradoksalt nok, den samme dynamikken i mikrotubuli også gjør dem utsøkt sensitive til hemmere. Ved å forstyrre den fint avstemt oppførsel av mikrotubuli, tubulin-bindende stoffer forstyrre prosessen med celledeling og har vist seg å være svært effektiv i kreftpasienter [6].
De fleste av de mikrotubul-bindende midler er identifisert så langt har vært isolert fra enten planter eller marine organismer under store skjermer av naturprodukter. Mikrotubulidynamikk målrettede anti-mitotiske narkotika er vanligvis klassifisert i to grupper – mikrotubulidynamikk destabiliserende agenter som vinkaalkaloider, kolkisin og mikrotubulidynamikk stabiliserende midler som paclitaxel og docetaxel. Selv om taxaner og vinca-alkaloider fortsatt administrert for et bredt spekter av kreft og er ofte integrert i kombinasjon kjemoterapiregimer [7], [8], har den nåværende pakke med tubulin-bindende midler flere ulemper. Sammenlignet med andre anticancer medikamenter, mikrotubul-binding legemidler er strukturelt komplekse, kjemisk forskjellige og har lav oppløselighet. Videre de aktive stoffene forekommer i bare små mengder i naturen og knapphet på sine naturlige kilder har sterkt hemmet deres kliniske utvikling. Selv om dette problemet ble løst ved utvikling av delvis eller totalt syntesemetoder [9] og via metabolsk ingeniør av hovedbane mellom [10], vedvarer problemet fortsatt der utvikling av nye mikrotubulidynamikk bindende forbindelser er bekymret. En annen ulempe er legemiddelresistens forårsakes av mutasjoner og /eller ekspresjon av forskjellige isotyper tubulin som SIII-tubulin. Legemiddelresistens kan også stamme fra overekspresjon av legemiddel effluks pumper, inkludert den multimedikamentresistens transportøren P-glykoprotein (P-gp) eller multilegemiddelresistens assosiert protein (MRP) [11]. Pasienter som blir administrert sammen med mikrotubul-bindemidler har en tendens til å lide av perifer nevropati aksonal som begrenser de tolerable dose [12]. Til tross for disse begrensningene, flere anti-mitotiske legemidler med ulike bindingssteder på tubulin er i forskjellige stadier av klinisk utvikling. Den armamentarium av mikrotubulidynamikk målrettede midler med forbedret farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler, minimal nevrologisk toksisitet og bredspektret effekt, fortsetter å vokse [13] – [15]. Ideelt sett bør slike fører også være fritt for P-gp-mediert legemiddelutstrømningen og være mottakelig for lettvinte kjemiske syntesefremgangsmåter.
I dette arbeidet rapporterer vi en ny forbindelse, basert på indazol stillaset, 4,5,6 , 7-tetrahydro-1 H-indazol-3-karboksylsyre [1 p-tolyl-met (E) yliden] -hydrazide (Suprafenacine eller SRF), som viser potent anticancer-egenskaper. Vi diskuterer identifisering av SRF å bruke
i silico
high-throughput screening tilnærming, dens kjemiske optimalisering og klarlegging av sin microtubule bindende modus. SRF destabiliserer mikrotubuli som fører til cellesyklusarrest i G2 /M fase og celledød ved apoptose. Videre viser vi at SRF kan omgå P-glykoprotein-transportøren, særlig rettet mot kreftceller og er effektiv mot flere forskjellige krefttyper.
Materialer og metoder
Kjemi og Antistoffer
nocodazol, paclitaxel (Taxol), vinblastin, og kolkisin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SRF ble kjøpt fra ChemDiv mens SB203580, PD98059 og SP600125 var fra Calbiochem (San Diego, California). Antistoffer ble hentet fra følgende bedrifter: vimentin, α- og β-tubulin, JNK-en, MDR-1, Bcl-2, pBcl-2 (T56), pBcl-2 (S70), pBcl-2 (S87) ( Santa Cruz Bioteknologi, Inc., Santa Cruz, CA); pp38, pErk1 /2, pJNK (Cell Signaling Technology, Denver, MA); monoklonale anti P-glykoprotein (MDR) (Sigma, USA) og monoklonale antistoffer actin var fra BD Pharmingen (San Diego, CA). [
3H] vinblastin (spesifikk aktivitet, 11,6 Ci /mmol) og streptavidin-belagt yttriumsilikat scintillasjonsproksimitetsanalyse (SPA) perler ble kjøpt fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). [
3H] kolkisin (spesifikk aktivitet, 80,4 Ci /mmol) ble oppnådd fra PerkinElmer (Boston, MA, USA).
Cell Culture
Menneskelige kreftcellelinjer (HeLa, MDA -MB-231, A549, ble HCT15, Jurkat, PC12 og SH-SY5Y) og humane fibroblast-cellelinjer (CCL-116 og WI-38) erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). SNU16, human magekreft cellelinje, ble innhentet fra koreanske cellelinje Bank (KCLB, Seoul, Korea). Den menneskelige epitelial primære cellelinje F10, og foreldrenes cellelinje for de resistente mutanter, KB-3-1, og multiresistent linje, KB-V1 var en generøs gave fra Dr. Peter Droge (NTU, Singapore) og Dr. M. Gottesman (NCI, Bethesda, MD), henholdsvis [16]. Cellelinjer ble dyrket i enten Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) eller RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin og holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
to kammer. For KB-3-1 KB-1V og ble mediet supplert med ytterligere 1 mM natriumpyruvat og 10 pg /ml vinblastin, respektivt. Alle resistente linjer ble inkubert i stoff-fri media før celleproliferasjon analyser.
Cell Cycle Analysis
cellecyklusprogresjonen ble overvåket ved hjelp av DNA flowcytometri. Celler ble sådd ut ved en tetthet på omtrent 2 x 10
5-celler /brønn i en 24-brønns plate. Da monosjikt var 50-70% sammenflytende, ble cellene behandlet med medikamenter som angitt. Etter 24 timers behandling, ble cellene trypsinert, vasket med PBS og fiksert i 80% etanol i 1 time ved -20 ° C. De fikserte celler ble resuspendert i propidiumjodid (PI) farging buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 50 mikrogram /ml PI, 10 ug /l RNase A, 0,1% NP-40) i 30 minutter ved 4 ° C i mørket. DNA-innhold ble bestemt på et FACSCalibur System (BD Biosciences, San Jose, California). For hver analyse ble 10,000 celler tellet, og prosentandelen av celler i hver fase ble beregnet ved bruk av ModFit LT programvare.
apoptose Assays
Apoptose ble overvåket ved bruk av annexin V-propidiumjodid (PI) dobbel fargemetoden. Cellene ble farget med Annexin V-FLOUS flekker kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble analysert ved en BD LSR II strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) ved anvendelse av 488 nm blå laser for eksitasjon og en 505LP speil 530/30 BP filter og 550LP speil-575/26 BP filterkombinasjoner for å detektere fluorescens og PI fluorescens, respektivt. For hver prøve ble 10.000 hendelser samlet.
Mitokondriell membranpotensialet Målinger
Endringer i mitokondrienes membranpotensiale ble oppdaget ved hjelp av mitokondriemembranen potensial Detection Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX) og baserte på bruk av den kationiske fargestoff, 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (vanligvis kjent som JC-1). JC-1 danner fluorescerende røde aggregater i mitokondriene i intakte celler, mens i apoptotiske celler, kollaps av mitokondriell potensial bevirker JC-1 til å forbli i cytoplasma i sin monomere grønne form. I korthet ble cellene behandlet med SRF, i nærvær eller fravær av JNK-inhibitor SP600125, og inkubert over natten. Cellene ble så trypsinert, vasket med PBS og pelletert (400
g
, 5 min, RT). Deretter pellets (1 x 10
6 celler /prøve) ble resuspendert i 500 ul av en X JC-1-fargeløsning og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktig atmosfære. Etter 2X vasker med analysebuffer, ble cellene resuspendert i sluttvolum på 500 pl analysebuffer. Fluorescensintensiteter ble målt på en BD FACSCalibur System (BD Biosciences, San Jose, CA) og den Cellquest-programvare ble anvendt for dataanalyse. Tap av mitokondriell potensial ble målt som forholdet for den rød-til-grønn fluorescens; sammenlignet med ubehandlede celler, blir dette forholdet reduseres i apoptotiske celler.
caspaseaktivering Assay
Caspase-3-aktivitet ble målt ved å bruke CaspACE Assay System (Promega, Madison, WI) ifølge leverandørens protokoll. I korthet, 2 x 10
5-celler /brønn ble sådd ut i en 6-brønns plate. Da monosjikt var 50-60% sammenflytende, ble cellene behandlet med SRF i nærvær eller fravær av JNK-inhibitor, SP600125 og inkubert over natten ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktig atmosfære. Etter at cellene ble høstet, ble pelletene vasket med iskald PBS og resuspendert i Cell Lysis Buffer. Fryse-tine-metoden ble anvendt for å lysere cellene, og lysatene ble holdt på is i 15 min. Etter klaring av lysatene ved sentrifugering (15, 000
g
, 20 min, 4 ° C), den overliggende væsken ble benyttet for å bestemme Caspase-3-aktivitet. I en 96-brønners plate, ble 2 ul (10 mM stamløsning) av Ac-DEVD-pNA-substrat tilsatt til reaksjonsblandingen inneholdende cellulært lysat, DTT, Caspase målingsbuffer, og avionisert vann i et sluttvolum på 100 ul. Platene ble inkubert over natten ved 20-22 ° C i 4 timer, og absorbansen ble målt ved 405 nm ved anvendelse av en referanse Plus-mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules). Ubehandlede celleekstrakter ble anvendt som kontroll for eksperimentene.
Immunofluorescence Mikros
For immunhistokjemi, ble cellene fiksert med 3,7% PFA, etterfulgt av inkubering i en blokkeringsløsning (5% BSA i PBS) i 30 min ved 4 ° C. Etter 3X PBS-vaskinger ble cellene permeabilisert med 0,2% Triton X-100, vasket 3 x med PBS og deretter inkubert over natten med a- eller P-tubulin-antistoffer ved 4 ° C. Etter vasking, ble prøvene inkubert med AlexaFluor 488-konjugert sekundært antistoff (Molecular Probes, Eugene, Oregon) i 1 time ved romtemperatur. Lysbilder ble montert ved hjelp forlenge Gold anti-fade-løsning (Molecular Probes, Eugene, Oregon) som inneholder DAPI og visualisert ved 60x forstørrelse på en Zeiss LSM META510 konfokal laser scanning mikroskopi. Alle innlegg oppkjøpet bildebehandling og analyse ble gjort ved hjelp av MetaMorph programvare (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA).
In Vitro
tubulinpolymerisering analysen
tubulinpolymerisering ble målt
in vitro
bruker tubulinpolymerisering analysen kit (Cytoskjelett, Denver, CO). Tubulin ble oppløst i Buffer 1 (80 mM PIPES, 2 mM MgCl
2, 0.5 mM EGTA pH 6,9, 10 uM fluorescerende reporter, 1 mM GTP) til en sluttkonsentrasjon på 10 mg /ml. For å analysere tubulin polymerisering, en blanding inneholdende 85 ul av tubulin (endelig konsentrasjon 2 mg /ml), 4,4 ul GTP (lager 100 mM), 280 ul av buffer 1 og 75 ul Tubulin Glycerol-buffer (80 mM PIPES, 2 mM MgCl
2, 0.5 mM EGTA, 60% glyserol, pH 6,9), ble tatt opp og holdt på is. Deretter 5 ul av testforbindelsen, paclitaxel, ble nocodazol eller kontrollbuffer aliquotted i hver brønn av en halv område 96-brønners, svart, flatbunnet plate (Corning Costar). Platen ble oppvarmet i 1 minutt i en 37 ° C forvarmet plateleser. Polymerisering ble initiert ved å pipettere 50 ul reaksjonsblanding /brønn og overvåket ved å måle endringen i fluorescens (E
x = 360 nm; E
m = 420 nm). Målingen ble gjort ved hjelp av SpectraFluor Plus mikroplateleser (TECAN GmbH, Østerrike). Målingene ble tatt hvert minutt i 1 time (totalt 61 målinger).
Tubulin Konkurranse-Binding scintillasjonsproksimitetsanalyse
Denne analysen ble utført for konkurranse binding til kolkisin og vinblastin bindingsseter på tubulin og utført i en 96-brønns plate. Biotinmerket tubulin (Cytoskjelett, Denver, CO) ble oppløst i G-PEM-buffer (80 mM PIPES pH 6,8, 2 mM MgCl
2, 0.5 mM EGTA, 1 mM GTP og 10% glycerol) til en sluttkonsentrasjon på 0,8-1 mg /ml. [
3H] kolkisin eller [
3H] vinblastin (sluttkonsentrasjon på 50 nM og 100 mM, respektivt), 50 uM av SRF og 1,0 mikrogram av biotin-merket tubulin ble blandet i et sluttreaksjonsvolum på 100 ul av G-PEM-buffer og inkubert i 45 minutter ved 37 ° C. Streptavidin SPA-kuler (80 ug /brønn) ble tilsatt til hver reaksjonsblanding og inkubert i ytterligere 30 minutter ved 4 ° C. De radioaktive tellinger ble målt ved anvendelse av en Wallac Micro scintillasjonsteller (PerkinElmer, Waltham, MA). For kontroll reaksjoner, ble SRF utelatt fra reaksjonsblandingen.
In Vivo
effektstudier
Alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) hunnmus, 4-6 uker gamle, ble hentet fra Animal Resources Centre (Murdoch, Australia). Mus ble implantert subkutant i flanken med 1 × 10
7 HCT15 menneskelige kolon adenokarcinomceller. Behandlingen startet da tumorstørrelse oppnådd en 100-200 mm
3 eller større. Dyrene ble behandlet intraperitonealt (i.p.) med 20 mg /kg /dose SRF i sluttdoseringsformulering eller en 0,9% saltvannsbærer. Forbindelsen ble gitt til tumorbærende mus på dag 1, 4 og 7 etter iscenesettelse, og tumormasse [(lengde x bredde
2) /2] ble bestemt en gang i tre dager for 9 dager.
Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt uavhengig av hverandre minst tre ganger. Alle kvantitative data blir presentert som gjennomsnitt ± SEM. Sammenligninger mellom to gruppene ble analysert via studentens
t
test, og verdier
P
. 0,05 ble ansett for å være av betydning
Resultater
Identifikasjon av SRF som en roman tubulin-bindende lite molekyl
for å identifisere nye kreft molekyler som fungerer via binding til tubulin, vi satt i gang en målbasert
i silico
screening av små molekyler ved hjelp av en ChemDiv bibliotek . Den innledende treff identifisert fra den virtuelle skjermen ble testet for deres evne til å inhibere både cellulær proliferasjon og tubulin polymerisering. Av alle forbindelser som ble testet, en indazol-hydrazid-derivatet – 4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indazol-3-karboksylsyre [1- (3-hydroksy-4-metoksy-fenyl) -meth- (E) – ylidene] -hydrazide, ble funnet å potent hemme microtubule polymerisasjon (IC
50 = 0,77 mikrometer). For ytterligere å identifisere-analoger med forbedret potens, ble Structure Activity Relationship (SAR) -studier utføres [Methods S1] og en fokusert bibliotek av 72 analoger ble syntetisert og screenet for deres evne til å inhibere mikrotubuli-polymerisering. Dette arbeidet har identifisert analog-4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indazol-3-karboksylsyre [1-
p-
tolyl-met (E) yliden] -hydrazide (analog 4; heretter referert til som SRF), som en potent molekyl (IC
50 = 0,38 uM) [Figur 1A].
(A) Kjemisk struktur av SRF. (B) Effekt av SRF på microtubule polymerisasjon
in vitro
. Renset tubulin ble inkubert ved 37 ° C i fravær (DMSO) eller i nærvær av stoffer som taxol (3 uM), nocodazol (10 uM) ble SRF og absorbansen målt ved 420 nm hvert ett minutt i løpet av en 60 minutters periode. SRF hemmet mikrotubuli polymeriseringen på en konsentrasjonsavhengig måte som var indikert ved en reduksjon i absorbans med tiden. (C) Confocal mikrografer av HeLa-celler eksponert for SRF, taxol og nocodazol. Celler ble merket med FITC-konjugert anti-tubulin-antistoff. SRF behandling ødelegger fullstendig den intrikate microtubule nettverk. Scale bar = 10 mm.
SRF hemmer celleformering av ulike kreftcelletyper
Vi brukte en kolo analyse for å evaluere anti-proliferativ effekt av SRF på kreftceller hentet fra en bredt spektrum av representative tumortyper – cervical adenokarsinom (HeLa, KB-3-1 KB-V1), T-celle lymfom (Jurkat), gastrisk karsinom (SNU-16), brystcancer (MDA-MB-231), lunge kreft (A549), tykktarms adenokarsinom (HCT-15) og neuroblastom (SH-SY5Y) [Tabell 1]. Alle kreftcellelinjer som ble testet viste følsomhet for SRF med IC
50 verdier i submicromolar området (83-381 nM). Interessant, sammenlignet med taxol, SRF viste høyere potens mot neuroblastom SH-SY5Y og kolorektal adenokarsinom HCT-15-cellelinjer. Videre har vi testet også effekten av SRF på normale celler som hud-fibroblast-cellelinje CCL-116 og human epitelial primær cellelinje F10. Både CCL-116 og F10 viste mer enn 80% overlevelse etter en 24 timers eksponering for SRF mens bare 60% overlevelse ble sett når de samme cellene ble behandlet med taxol under identiske betingelser [Figur S1]. Til sammen våre data bekrefter at SRF selektivt rettet mot kreftceller og er effektiv mot flere forskjellige krefttyper.
SRF kan omgå p-glykoprotein narkotika efflukspumpen
Den kliniske suksessen legemidler som brukes i behandling av kreft har vært hemmet av utviklingen av resistens. Fenomenet multimedikamentresistens er ofte forbundet med en økning i ekspresjon av
MDR1
-genet, som koder for P-glykoprotein (P-gp), en energiavhengig efflukspumpen. For å være klinisk relevant, må SRF kunne omgå P-gp-mediert effluks. Vi bestemte derfor effekten av SRF på spredning av epidermal karsinom cellelinje KB-V1, en vinblastin motstandsdyktig underlinjen stammer fra foreldre KB-3-1 celler [16] [Tabell 2]. KB-V1 celler er høyanriket i P-gp og de viser kryssresistens overfor kolkisin og adriamycin [Figur S2]. Sammenligning av anti-proliferativ effekt mediert av SRF og taxol viste at SRF er 35 ganger mer potent enn taxol mot KB-V1-cellelinjen mens begge forbindelser viser en tilsvarende virkning mot KB-3-1-celler, da disse celler ikke er kjent for å overuttrykke P-gp [17]. Evnen til SRF å omgå P-gp forklarer nok hvorfor det er mer potent enn taxol i SH-SY5Y neuroblastom og HCT-15 kolorektal adenokarcinomceller som begge disse kreftcelletyper uttrykker forhøyede nivåer av P-gp protein [17] – [19].
SRF destabiliserer microtubule montering av binding til kolkisin-bindingssetet
for å evaluere hovedvirknings av SRF, profilert vi dens virkning på tubulinpolymerisering
in vitro product: [Figur 1B]. Resultatene viser at SRF inhiberer tubulin polymerisering i en treringstrinnet avhengig måte med en IC
50 på 0,38 uM. I tillegg ble mikrotubuli-forstyrre virkningen av SRF, sammenlignet med to forskjellige mikrotubul-målrettede medikamenter, taxol, nocodazol, kjent som anti-neoplastiske midler ved forstyrrer polymeriseringen av tubulin. Spesielt, SRF påvirket starten av polymeriseringen (kjernedannelsesfasen) og dens hastighet (forlengelse fase) som resulterer i redusert tubulin polymermasse. Vi studerte også effekten av SRF på microtubule montering på cellenivå ved hjelp av immunhistokjemi. HeLa-celler eksponert for SRF i 24 timer ble fiksert og farget med mikrotubuli a- eller P-tubulin-antistoffer. Sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, som opprettholder en intrikat og organisert mikrotubulus nettverk, SRF behandling førte til en fullstendig ødeleggelse av denne cytoskeletal nettverk og utseende av rikelige karakteristiske korte bunter som ble distribuert over hele cytoplasmaet i disse cellene [Figur 1C]. Lignende forstyrrelse av mikrotubuli ble observert med nocodazol eksponering mens taxol behandling produsert kortere, men tettere mikrotubuli i samsvar med sin rolle som en microtubule stabiliserende middel [Figur 1C].
Forbindelser som hemmer tubulinpolymerisering hovedsakelig binde seg til det kjente tydelig områder, nemlig taxol, vinblastin, orcolchicine områder av tubulin. En konkurransebindings scintillasjonsproksimitetsanalyse (SPA) ble anvendt for å probeSRF bindingssetet på tubulin. SRF ikke redusere spesifikke SPA teller stimulert ved konjugering biotin-merket tubulin med [
3H] taxol eller med [
3H] vinblastin, men sterkt konkurrerte for binding av [
3H] kolkisin til tubulin [Figur 2A og 2B]. Deretter ble molekylære modellering og docking studier gjort for ytterligere å fastslå bindingen modusen for SRF. Ved hjelp av krystallstrukturen av tubulin-colchicin: stathmin-lignende domene (PDB 1SA0), begge colchicin [Figur 2C] og SRF [Figur 2D] var forankret i det colchicin-bindende lomme av tubulin. Til tross for den strukturelle ulikheten, deler SRF samme cartesian plass som kolkisin. I motsetning kolkisin, mangler SRF hydrogen obligasjons interaksjoner med Cys241 av β-kjeden. I stedet er indazol ring av SRF danner hydrogenbinding interaksjon med Asn349, Lys352 av β-kjeden samt Val181 og Thr179 av α-kjede, mens den 4-methyl gruppe av de distale fenylringen danner hydrofobe interaksjoner med β-kjede Lys 254. til sammen docking studier viser at selv om SRF og kolkisin binder seg til samme nettsted på tubulin, har SRF en bindende modus litt forskjellig fra kolkisin [Figur 2E].
(A) SRF konkurrerer med kolkisin for binding til mikrotubuli som ble bestemt ved hjelp av konkurranse-bindings scintillasjonsproksimitetsanalyse (SPA). I forhold til kontroll (ingen konkurrent), redusert SRF kolkisin binding med 2,5 ganger. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05, **
P
0,01 versus kontroll. (B) SRF og vinblastin har forskjellige bindingssteder på tubulin som SRF ikke konkurrere med vinblastin. Resultatene som vises er gjennomsnittlig (± SD) av tre uavhengige forsøk. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05 versus kontroll. (C-E) tegneserie representasjon av bindende modusen for kolkisin (C) og SRF (D) til tubulin. Bindingen modusen for narkotika til tubulin ble undersøkt av tilkoblings studier med molekylære docking program GOLD (Genetic optimalisering for Ligand Docking, Cambridge krystallografiske data Centre, UK) [Metoder S1]. Forbindelsene (kolkisin eller SRF) var forankret i det colchicin-bindende lomme av tubulin ved hjelp av krystallstrukturen av tubulin-colchicin: stathmin-lignende domene [PDB-kode: 1SA0]. H-bindingen interaksjoner mellom den indazol ring av SRF og N349 og K352 av β-kjede (grønn), så vel som T179 og V181 av α-kjede (blå) er uthevet. Panel E viser overlegg av SRF og kolkisin fremheve forskjellen i bindingsmønstre disse molekylene.
SRF arrestasjoner cellesyklus i G2 /M-fase
Siden mikrotubulidynamikk har viktige roller i cellecyklusprogresjonen, mitotisk stall kan føre til ulike kjemoterapeutiske utfall inkludert mitotisk død, mitotisk exit, apoptose eller Aneuploidy [11], [20]. For å studere virkningen av SRF på cellesyklusutvikling, ble HeLa-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SRF i 24 timer og cellesyklusen ble målt ved flowcytometri. SRF behandling forårsaket en fullstendig kollaps av alle cellene i G
en fase i en doseavhengig måte og dramatisk økning i G
2 /M populasjon av celler behandlet med 10 pM av SRF [figur 3A og Figur S3]. Lignende effekter på mikrotubuli ble observert med nocodazol og taxol. Cellesyklus arrest ble ledsaget av svikt i mitotisk spindel å skille i raskt dele celler [Figur 3B]. Imidlertid ingen signifikant økning i G
2 /M fasen ble observert hos normale cellelinjer (CCL-116, WI-38 og F10) ved behandling SRF [Figur S4]. Siden cellesyklus arrest alltid utløser apoptose, utførte vi annexin V-PI dobbel flekker på SRF-behandlede celler, slik som å overvåke fosfatidylserin eksponering, et signal for tidlig apoptose. Etter en kort 7 timers eksponering, befolkningen i tidlige apoptotiske celler (annexin V
+ /PI
-) dramatisk økt fra 2,4% til 21,7% [figur 3C], og dermed indikerer at SRF induserer hurtig apoptose i prolifererende celler .
(A) Strømningscytometrisk analyse av DNA-innhold i celler behandlet med SRF (10 uM), nocodazol eller taxol. Vist er representative ett-parameterhistogrammer av behandlede celler. Som taxol og nocodazol, SRF-mediert hemming av mikrotubulidynamikk resulterte i cellesyklus arrest på G
2 /M overgangsfase. (B) Fluorescens-mikrografer av mitotiske celler som hadde blitt forbehandlet med de angitte forbindelser. Sammenlignet med bærerbehandlede celler, SRF og andre låns-TBAer hemmet dannelsen og segregering av den mitotiske spindel. Mikrotubuli (grønn) ble farget med FITC-konjugert anti-tubulin antistoff; nucleus (blå) ble farget med DAPI. Bilder ble kjøpt til 60X forstørrelse. Scale bar = 5 mikrometer. (C) SRF-behandling induserer apoptose i hurtig prolifererende celler. Etter en kort 7 timers eksponering SRF (10 uM) ble apoptotisk progresjon overvåket ved dobbelt-farging av celler med Annexin V-FITC (FL-1) /PI (FL-2). I denne perioden andelen annexin V
+ /PI
– (indikerer tidlig apoptose) celler økte fra 2,4% (i kontroll) til 21,7%. Kinetikken for denne økning er lik den som sees med nocodazol og taxol. Begge disse forbindelsene induserte apoptose i ca 25,4% (nocodazol) og 33,2% (taxol) av celler i løpet av denne tidsperioden. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer (n = 3) og dataverdi ble i gjennomsnitt.
SRF induserer apoptose via JNK-mediert fosforylering av Bcl-2 og Bad
Bcl- 2 familie av proto-onkogener er mester regulatorer av apoptose og fungerer som molekylære reostater å kontrollere mobil overlevelse [21]. Siden anti-mitotiske midler som paclitaxel, vinkristin, vinblastin, indusere Bcl-2-hyperfosforylering i sløyfen region [22] – [26], undersøkte vi effekten av SRF med Bcl-2. Ekstrakter fra HeLa-celler behandlet med 10 uM SRF i 24 timer ble analysert ved immunblotting med monoklonalt anti-Bcl-2-antistoff. Resultatene viser at det sammen med en Bcl-2, SRF-behandlede celler har tilleggsbånd (r) som har lavere migrasjonsrate sammenlignet med Bcl-2 [figur 4A, Øvre panel]. I motsetning til HeLa-celler, kjøretøy-behandlede celler helt manglet den ekstra band. Likeledes fosforyleringstilstanden av Bcl-2 i den normale diploide lunge fibroblastcellelinje WI-38 forble uforandret selv etter 24 timers behandling SRF [figur 4A, USA panel]. For å bekrefte at bandet (e) er faktisk fosforylerte former av BCL-2, blotter ble så analysert med fosfo-BCL-2 spesifikke antistoffer. SRF indusert fosforylering av Bcl-2 i flere rester (T56, S70 og S87), som alle ligger innenfor en fleksibel sløyfe region [Figur 4B]. Samlet utgjør disse observasjonene lenger gjenta det faktum at SRF selektive er rettet mot kreftceller. I tillegg til bcl-2, et 24 timers eksponering for SRF behandling også indusert fosforylering av de pro-apoptotiske Bcl-2-familiemedlem – Bad [Figur 4C] mens Bcl-x
L, Bak og Bax forble upåvirket [figur S5].
(A) Western blot-analyse av HeLa og WI-38 celle-ekstrakter ble behandlet med 10 uM SRF i 24 timer og probet med anti-Bcl-2 monoklonalt antistoff. En langsommere migrerende bånd tilsvarende fosforylerte form av Bcl-2 er til stede i HeLa-ekstrakter, men fraværende fra WI-38 lysater, som viser at SRF induserer selektiv fosforylering av Bcl-2 i kreftceller. (B) SRF formidler BCL-2 hyperfosforylering. Drug behandlet HeLa lysatene ble løst på 12% SDS-PAGE og immunoblotting ble gjort ved hjelp av spesifikke fosfo-antistoffer mot T56, S70 og S87 rester av BCL-2; alle disse aminosyrene ligge i den fleksible sløyfe region av proteinet. (C) Tid løpet analyse av Bad fosforylering indusert av SRF behandling. HeLa-cellelysatene ble analysert ved immunoblotting ved anvendelse av anti-Bad monoklonalt antistoff. SRF (10 uM) behandling endret fosforylering status av pro-apoptotiske protein Bad som indikert ved tilsynekomst av en langsommere migrerende fosfo-Bad bånd ved 24 timer. Bandet var fraværende fra kontroll (DMSO behandlet) celler, selv etter 24 timer.
mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), uttrykt i alle celletyper, transduce signaler fra cellemembranen til kjernen som reaksjon på en rekke forskjellige stimuli, og også regulere et bredt spekter av biologiske prosesser kritiske for cellulær homeostase [27]. Blant de forskjellige reaksjonsveier mediert av MAPK familiemedlemmer, den ekstracellulære signalregulerte kinase 1 og 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinase /spenning-aktivert protein kinase (JNK /SAPK) og p38 MAPK, er kjent for å
