Abstract
Menneske fosfatidyletanolamin-bindende protein 4 (hPEBP4) er en roman anti-apoptose molekyl i forbindelse med motstanden av tumorer til apoptotiske midler. Her søkte vi å undersøke hvilken rolle hPEBP4 i radioresistance av endetarmskreft. Immunhistokjemi analyser viste hPEBP4 ble uttrykt i 27/33 av endetarmskreft prøver, men bare i 2/33 av nabo normal slimhinne. Dempe uttrykk for hPEBP4 med siRNA betydelig redusert klonogene overlevelse og økt apoptose av endetarmskreftceller på bestråling. I stedet tvunget overekspresjon av hPEBP4 fremmet sin overlevelse og redusert apoptose. Western blot viste hPEBP4 kunne øke den strålingsinduserte Akt aktivering, hvor det reaktive oksygenholdige prøven (ROS) var nødvendig. Den radioresistance effekten av hPEBP4 ble reversert etter gitt LY-294002 til å hemme Akt aktivering eller antioksidant å avskaffe ROS produksjon. Vi bekreftet også at virkningen av hPEBP4 in vivo med nakne mus. Dermed har vi konkludert med at hPEBP4, spesielt uttrykt i endetarmskreftceller, er assosiert med radioresistance av endetarmskreft, noe som tyder på at modulering av hPEBP4 kan ha viktige terapeutiske implikasjoner i strålebehandling av endetarmskreft
Citation. Qiu J, Yang G Lin A, Shen Z, Wang D, Ding L (2014) Menneskelig Fosfatidyletanolaminsyntese-Binding Protein 4 fremmet Radioresistance of human Rektal kreft ved å aktivere Akt i en ROS-Dependent Way. PLoS ONE 9 (3): e90062. doi: 10,1371 /journal.pone.0090062
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 6 august 2013; Godkjent: 28 januar 2014; Publisert: 03.03.2014
Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av National Natural Science Fund of China (prosjektnummer 81101876), Medical Research Fund of Zhejiang Provincial Health Department (prosjektnummer 2011RCA035), og Natural Science Fund i Zhejiang-provinsen (prosjektnummer Y2110782) og Medisinsk forskningsfond vitenskap teknologi avdeling i Zhejiang-provinsen (prosjektnummer 2012C33SA100045). Ovennevnte organer hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest rådende kreft over hele verden. Det er anslått at det finnes nesten 1,2 millioner menn og kvinner som lever i USA med en tidligere diagnostisering av tykk- og endetarmskreft, og ytterligere 143 460 vil bli diagnostisert i 2013 [1]. Blant disse pasientene, lokale avanserte endetarmskreft utgjør en stor del av dem. I dag preoperative chemoradiation terapi har blitt en integrert komponent i behandlingen av lokale avansert kreft i endetarmen, som antas å være i stand til å redusere risikoen for lokale tilbakefall og øke sannsynligheten for sphincter bevarende kirurgi [2]. Dessverre ikke alle endetarms kreft er følsomme for strålebehandling. For eksempel er det anslått at bare omtrent 20% av pasientene oppnår fullstendig patologiske responser på preoperativ strålebehandling [3]. Så utdype forståelsen av radioresistace kan hjelpe oss til å velge radiosensitive rektal kreftpasienter å motta preoperativ strålebehandling, unngå forsinkelse av kirurgi for radioresistance pasienter og med overvinne radioresistance med nye radiosensitive strategier.
hPEBP4 er et nytt medlem av PEBP familie [4]. Overuttrykker i et bredt spekter av faste tumorer, inkludert brystkreft, eggstokk-kreft og prostatakreft har hPEBP4 blitt demonstrert å hemme apoptose av cancerceller ved å regulere nedbrytning av apoptotiske molekyler, slik som Bcl-2 /Bcl-X og Caspase-3 [ ,,,0],5] – [8]. Tatt i betraktning at unnvikelse av apoptose er et av kjennetegnene på humane cancere [9] og radioterapi-indusert cytotoksisitet er mediert, i stor grad, ved induksjon av apoptose i cancerceller [10], [11], spekulere vi at hPEBP4 kan delta i motstanden av endetarmskreft til preoperativ strålebehandling. Egentlig vår siste undersøkelse betyr viser hPEBP4 var en selvstendig prediktiv biomarkør for responsen av endetarmskreft til preoperativ strålebehandling, noe som antyder at opptil regulerende hPEBP4 kan være en potensiell mekanisme som endetarmskreftceller unngå den ødeleggende effekten av bestråling [12]. Men det er fortsatt ingen direkte eksperimentelle bevis om rollen hPEBP4 i redioresistance av endetarmskreft så langt.
I denne studien undersøkte vi uttrykket status for hPEBP4 i endetarmskreft prøver og tilstøtende normal slimhinne så vel ved immunohistokjemi og undersøkt om hPEBP4 har en rolle i den radioresistance av humane rektale kreftceller. Våre data indikerer hPEBP4 ble relativt uttrykt i endetarmskreft vev og deltok på radioresisitance av endetarmskreft, som var Akt og ROS avhengige. Vår studie antyder at farmakologisk eller genetisk modulering av hPEBP4 kan ha viktige terapeutiske implikasjoner i å forbedre helbredende effekten av preoperativ strålebehandling for kreft i endetarmen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
alle dyrene ble hevet ved hjelp av protokoller som hadde blitt godkjent av Animal Care og bruk komité den tredje Folkets sykehus i Hangzhou, Kina i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer og Animal Care og bruk Committee også godkjent denne studien å gjennomføre. Skriftlig informert samtykke fra donor ble innhentet for bruk av menneskelige vev i denne forskningen, som også ble godkjent av Ethic komiteen av den tredje Folkets sykehus i Hangzhou.
Reagenser og cellekultur
Lipofectamine reagent og DCF-DA var fra Invitrogen (Carlsbad, California). Antistoffer spesifikke for fosfor-Akt (Ser473) og total Akt var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). PI 3-kinase hemmere, LY-294002 ble hentet fra Calbiochem. N-acetyl-Lcysteine (NAC) antioksydant (Sigma) ble anvendt for å hemme ROS produksjon. Alle humane kolorektale cancerceller ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opprettholdt i DMEM-medium (Gibco, USA) supplementert med 10% (v /v) føtalt kalveserum, 4,5 g /liter D-glukose, unødvendige
Immunhistokjemi Analyse av hPEBP4-ekspresjon i humane Rectumcancerregisteret aminosyrer (100 uM hver), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 2 mM glutamin ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære.
Alle patologisk bekreftet menneskelige endetarmskreft og tilstøtende kreft vev ble hentet fra radikalt resected vevsprøver med informert samtykke fra hver pasient ved Institutt for kolorektal inngrep, den tredje Folkets sykehus i Hangzhou, Kina. Prøvene ble fiksert med formalin, innstøpt i parafin, og immunostained med anti-hPEBP4 antistoff [4] med avidin-biotin peroksidase kompleks metode (Cybrdi, Xi’an, Shanxi, Kina). Immunoreaktivitets ble evaluert basert på prosent av positive-farget celler. Intensiteten er betegnet som 0 når ingen tumorceller flekk (negativ), en når 10-20% av cellene flekk (svak farging), 2 når 20-50% av cellene flekk (moderat farging), og 3 når mer enn 50% av celler flekken (sterk farging). For statistiske analyser, vev ledelsen 2 og 3 ble slått sammen som klart positiv og vev ledelsen 0 og 1 ble betegnet som negative.
Cell Transfeksjon
hPEBP4 ekspresjonsvektor konstruert som beskrevet tidligere [4] ble transfektert inn SW480 celler ved hjelp Lipofectamine reagens med pcDNA3.1 /Myc-His (-) B som en mock kontroll. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene undersøkt i henhold til 0,8 mg /ml G418 (Merck, Darmstadt, Tyskland) i tre uker.
Individuell G418-resistente kolonier ble subklonet som SW480 /hPEBP4 og SW480 /Mock. Den hPEBP4 ble bestemt ved RT-PCR og Western blot analyse.
hPEBP4 RNA interferens analysen
For stabil stanse av hPEBP4 uttrykk i menneskelige endetarmskreft HRT-18 celler, celler ble transfektert med den hPEBP4-siRNA eller neo-plasmidet ved hjelp av Lipofectamine-reagens, som beskrevet tidligere [5]. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene undersøkt i henhold til 0,6 mg /ml G418 i 25 dager. Individuelle G418-resistente kolonier ble subklonet som HRT-18 /Mock og HRT-18 /hPEBP4-siRNA og stanse resultat av hPEBP4 ble bestemt ved RT-PCR og Western blot analyse.
RT-PCR For hPEBP4
RNA ble oppsamlet med TRIzol (Invitrogen) og cDNA ble syntetisert med 1 ug av total-RNA ved hjelp av første tråd cDNA syntese kit-ReverTra Ace-α (Toyobo) ved 42 og 99 ° C i 20 og 5 minutter, respektivt. PCR-reaksjonen ble utført i en 10 ul reaksjonsvolum, som bestod av en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 30 sekunder og etter amplifikasjon av 30 sykluser ved 95 ° C i 5 sekunder, 56 ° C i 30 sek. Primere som var spesifikke for hPEBP4 var 5′-GGGTTGGACAATGAGGCTG-3 «(sense) og 5′-TGTGCTTGGGCTCGCTGGC-3» (antisens).
Apoptose-analysen
Cellene ble vasket, resuspendert i fargebuffer , og farget med Annexin V /PI apoptose (Invitrogen) eller R123 (R-302, molekylære prober) i henhold til produsentens instruksjoner. Fargede celler ble analysert ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACSCalibur, Becton Dickinson, Mountain View, California) .Experiments ble gjentatt tre ganger.
Western Blot analyse
BCA Protein Assay Reagent Kit ( Pierce) ble anvendt for å måle proteinkonsentrasjon. Prøver inneholdende like mengder protein ble separert ved 12% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner Protran. Blotter ble undersøkt med de angitte antistoffer med passende pepperrotperoksidase konjugerte antistoffer som sekundære antistoffer (Cell Signaling Technology). SuperSignal West Femto maksimal følsomhet substrat (Pierce) ble anvendt for den kjemiluminescerende visualisering av proteinene [5].
klonogene overlevelses Assay
eksponensielt voksende rektale kreftceller i monolagskultur ble bestrålt i 100 mm- petriskåler ved hjelp av en 250-kVp X-ray (0,61 Gy /min) ved enkelt stråling. Etter eksponering for ioniserende bestråling ble cellene høstet for klonogene overlevelsesanalyse. Overlevelse etter bestråling ble definert som evnen til cellene for å opprettholde deres klonogene kapasitet og til å danne kolonier. Kort fortalt, etter eksponering for stråling, ble cellene trypsinert, telles og sådd for kolonidannelse i 100-mm petriskåler på 500-1000 celler /fatet. Etter inkubering intervaller på 21 dager ble kolonier farget med krystallfiolett og tellet manuelt. Kolonier som består av mer enn 50 celler ble scoret, og tre replikate rettene ble tellet for hver behandling. Forsøkene ble utført minst 3 ganger for alle datapunkter. De eksperimentelle resultatene ble korrigert for effekter indusert av den ikke-bestrålt kontroll. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
caspaseaktivering Assay
HRT /Mock og HRT /siRNA-celler ble sådd ut i 96-brønners plater (10,000 celler pr brønn) og bestrålt (8Gy). Etter 24 timers inkubering, ble aktivering av cellulære caspaser 3/7 målt ved hjelp av en fluorescencebased assay (Apo-ONE Homogen Caspase-3 /7. ANALYSE; Promega). Seks brønner per behandling tilstand ble brukt for å få gjennomsnittlig fluorescens signaler og normalisert for imitert behandlet kontroll HRT celler.
Måling av ROS
For innholdsanalyse ROS, ubehandlet og IR-behandlet (8Gy ) adherente rektal kreft celler ble først analysert for levedyktighet ved trypan blå eksklusjon fargestoff og inkubert med 4 mM DCF-dA i 45 minutter ved 37 ° C.Then cellene ble analysert ved strømningscytometri, som beskrevet tidligere [13]. Forsøkene ble utført minst 3 ganger for alle datapunkter.
In vivo stråling studier
Mann athymiske nu /nu mus (4 wk gamle) ble kjøpt fra Experimental Animal Center of Shanghai og ble reist ved hjelp av protokoller som hadde blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. 48 mus ble tilfeldig delt inn i fire grupper. Mus ble injisert subkutant med 2 × 10 henholdsvis 6 HRT-18 /Mock og HRT-18 /siRNA celler på høyre fot pad
. Når tumorene var omtrent 0,5-0,8 cm i den lengste diameter, ble musene bestrålt med 2 Gy Cs-strålingskilde hver tredje dag til tre ganger som tidligere beskrevet [14]. Svulster ble overvåket og målt med formelen V = (a x b
2) /2 hver tredje dag. Observasjon ble lukket når den gjennomsnittlige volumet av svulst av noe gruppen nådde ca 2,0 cm
3. Alle mus ble skåret ut 33 dager etter bestråling og tumorstørrelse-tidskurven, så vel som den apoptose av tumorvevet ble analysert.
TUNEL-analysen
Tumorene ble oppnådd, ble fiksert i 10% formalin og innleiret i parafin etter mus ble skåret ut. Etter deparaffinization ble tumorprøver befridd for protein ved inkubasjon med 20 mg /ml proteinase K (Sigma Chemical) i 15 min ved romtemperatur. TUNEL-farging ble utført ved anvendelse av en apoptose in situ deteksjon kit (Roche) i henhold til produsentens protokoller. Kjernene ble farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, blå fluorescens), og TUNEL-positive celler ble visualisert ved grønn fluorescens. Mer enn 200 DAPI-positive celler ble undersøkt i 5 tilfeldige felt av hver gruppe, og TUNEL-positive celler ble tellet for å beregne in situ apoptose.
Statistical Analysis
Data er uttrykt som middelverdi verdier ± SD. Statistisk signifikant forskjell mellom gruppene ble testet med Student t test eller enveis ANOVA. Forskjell på hPEBP4 uttrykk intensitet mellom menneskeendetarmskreft vev og tilstøtende normale endetarms vev ble analysert ved hjelp av Pearson chi-kvadrat test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
økt uttrykk av hPEBP4 i Human Rectumcancerregisteret
Å belyse uttrykk mønster av hPEBP4, vi først undersøkte uttrykk for hPEBP4 både i menneskelige endetarmskreft vev og normal tilstøtende endetarms vev med resected prøver etter radikal kirurgi ved hjelp av immunhistokjemisk analyse. hPEBP4 uttrykk var til stede i en svært høy andel av endetarmskreft vev (78,8%, 26/33), sammenlignet med den svært lave prosenter i passet normale rektal vev (6,1%, 2/33, p 0,001, Tabell 1, fig 1A , B). Dataene viser fortrinnsrett uttrykk mønster av hPEBP4 i menneskelige endetarmskreft vev. For å studere funksjonen til hPEBP4 som reaksjon på bestråling av human kreft i endetarmen, ble ekspresjonen av hPEBP4 i to tykktarmskreftcellemodeller undersøkt, og viser hPEBP4 ble sterkt uttrykt i HRT-18-celler, men meget moderat uttrykt i SW480 celler (fig 1c) .
A, B
uttrykk for hPEBP4 i menneskets endetarmskreft og tilstøtende normale rektal vev med immunhistokjemi (× 200);
C
uttrykk for hPEBP4 menneskeendetarmskreft cellelinjer målt med western blot.
hPEBP4 Forfremmet klonogene Survival of endetarmskreft cellene i respons til Stråling
for å undersøke hvilken rolle hPEBP4 i radioresistance av endetarmskreft, må vi først etablert stabile transfektanter banke ned hPEBP4 uttrykk og overekspresjon hPEBP4 i HRT-18 og SW480 celler henholdsvis. Effektiviteten av overekspresjon eller stillhet av hPEBP4 ble bekreftet ved RT-PCR (figur 2A). Deretter utførte vi kolonidannelse assays i de to cellelinjene for å vurdere effekten av hPEBP4 på celleoverlevelse etter bestråling. Vi fant at den klonogene overlevelses av HRT-18 cellene i respons til stråling ble betydelig svekket etter hPEBP4 ble stille, mens overekspresjon av hPEBP4 forbedret den som er vist i SW480 celler (figur 2B, C). For å bekrefte radioresistance effekten av hPEBP4, vi gjentok ovenfor eksperimenter med HT-29 og Løvø celler som henholdsvis genet knockdown og overekspresjon modeller (Fig 2D). Vi fant at klonogene overlevelsen av HT-29 celler ble betydelig svekket etter hPEBP4 ble stille, mens overekspresjon av hPEBP4 økt overlevelse av Løvø celler etter bestråling (Fig 2E).
A, etter RT-PCR for å bekrefte stabil overekspresjon av hPEBP4 i SW480 celler og stillhet hPEBP4 i HRT-18 celler;
B, C, etter virkningen av hPEBP4 på clogenical overlevelse av HRT-18 og SW480 celler;
D
, Western blot å bekrefte stabil stillhet hPEBP4 i HT-29 celler og overekspresjon av hPEBP4 i Løvø celler;
E
, effekten av hPEBP4 på clogenical overlevelse av HT-29 og Løvø celler ved hPEBP4 stillhet og overekspresjon hhv. *, P . 0,05
hPEBP4 var involvert i Resistance of Radiation-indusert apoptose av endetarmskreftceller
Som vist i fig. 3
En
, SW480 /mock cellene følsomme for stråling-indusert apoptose. Men SW480 /hPEBP4 celler som overuttrykker hPEBP4 var relativt ildfast for stråling-indusert apoptose, noe som indikerer at hPEBP4 kreerer stråling motstand i endetarmskreft. Følgelig etter hPEBP4 ble stille, HRT-18 celler ble mer følsomme for stråling-indusert apoptose sammenlignet med HRT-18 /mock-celler (Fig. 3
B
). Ovennevnte effekt av hPEBP4 ble også gjentatt i en annen knockdown og overekspresjon eksperimentere med HT-29 og Løvø celler som modeller (Fig. 3C), ytterligere bekrefter effekten av hPEBP4 på stråling motstand i endetarmskreftceller. hPEBP4 kan hemme strålings-indusert apoptose ved å holde aktivering av caspase3 og 7 (fig. 3D). Tatt i betraktning at etter at caspase kaskade aktivering, den spesifikke proteolytiske spaltning av PARP-proteinet er et viktig begivenhet for forekomst av apoptose, ble effekten av hPEBP4 på PARP undersøkt etter bestråling. Med hPEBP4 lyddemping kombinert med bestråling, ble det observert en tydelig nedbrytning av 116 kDa PARP til en 85 kDa fragmentering-protein sammenlignet med stråling bare (figur 3E), noe som bekrefter at hPEBP4 hemmer den strålingsinduserte apoptose av rektale kreftceller, representert ved aktivering av caspase-3, og proteolytisk spalting PARP
A,
Representative resultat av FCM for å vise effekten av hPEBP4 på bestrålingen-indusert apoptose av SW480-celler.;
B,
Representative resultat av FCM for å vise effekten av hPEBP4 på bestrålingen-indusert apoptose av HRT-18 celler; C, Histogram å oppsummere virkningen av hPEBP4 på bestrålingen-indusert apoptose av HRT-18 (hPEBP4-siRNA), HT-29 (hPEBP4-siRNA), SW480 (hPEBP4 overekspresjon) og LoVo-celler (hPEBP4 overekspresjon);
D, etter virkningen av hPEBP4 på bestråling-indusert capase3 /7 aktivering av endetarmskreft HRT-18 celle;
E, etter virkningen av hPEBP4 på bestråling-indusert PARP cleavge av endetarmskreft HRT-18 celler. *, P 0,05; **, P . 0,01
hPEBP4-mediert Stråling-motstand av endetarmskreft Cells Var Akt og ROS Dependent
Akt aktivering har vist seg å være involvert i radioresistance av mange svulster [15] – [17]. Så vi utforsket rollen Akt i hPEBP4-mediert motstand mot stråling-indusert apoptose. Først undersøkte vi Akt aktivering etter stråling. Vi fant Akt ble dramatisk aktiveres etter stråling i endetarmskreftceller som ble fremmet av hPEBP4 (Fig 4A). For å bestemme hvorvidt hPEBP4-mediert radioresistance krever Akt aktivering, vi deretter pre-inkubert rektale kreftceller med 20 uM LY-294002 i 1 time, og behandles cellene med stråling. Vi fant at LY-294002 reversert nesten den hemmende effekten av hPEBP4 på strålings-indusert apoptose både i HRT-18 og SW480-celler (Fig. 4B). Som generering av reaktive oksygenarter (ROS) har blitt rapportert å spille en viktig rolle i strålings-indusert apoptose av kreftceller [18], ble effekten av hPEBP4 på den intracellulære redoks-status også bedømmes. Som vist i flowcytometrisk analyse med DCFH-DA, hPEBP4 alene hadde ingen effekt på den intracellulære redoks status. Imidlertid eksponering for stråling forårsaket en betydelig økning i akkumuleringen av intracellulære peroksider i rektale kreftceller. Men det var ingen signifikant endring for nivået av intracellulære peroksider i endetarmskreftceller etter hPEBP4 ble forstummet eller overuttrykt (Fig4 C, D). Likevel, samtidig bruk av antioksidant NAC (forbehandling for 4 timer ved konsentrasjonen av 5 mm) med stråling snudd nesten effekten av hPEBP4 på stråling-indusert apoptose av endetarmskreftceller (Fig 4E). Interessant, samtidig bruk av NAC og stråling hemmet også reguleringen av Akt ved hPEBP4 (Fig 4F), som foreslo at ROS kreves av hPEBP4 å modulere Akt i sammenheng med stråling-indusert apoptotiske hendelser. Samlet utgjør disse resultatene indikerte at hPEBP4 fremmet radioresistance av endetarmskreftceller ved å opptre i midten av ROS og Akt signalveien, som kan ytterligere aktivere Kaspaser å utløse apoptose.
A, etter Western blot for å vise effekten av hPEBP4 på aktivering av Akt etter bestråling med HRT-18 og SW480 rektal kreft celler;
B,
Annexin V /PI farging vise Akt aktivisering var nødvendig i radioresistance effekten av hPEBP4 i HTR-18 og SW480 celler ved hPEBP4 stillhet og overekspresjon henholdsvis;
C
, representant ROS flekker resultat å vise hPEBP4 hadde ingen effekt på den intracellulære nivået av ROS i HRT-18 endetarmskreftceller;
D
, Histogram vise hPEBP4 hadde ingen effekt på den intracellulære nivået av ROS i begge HRT-18 og SW480 rektal kreft celler ved hPEBP4 stillhet og overekspresjon henholdsvis;
E
, Resultat av Annexin V /PI farging vise ROS var nødvendig i radioresistance effekten av hPEBP4; .
F
, Representant resultat av western blot vise ROS var nødvendig i aktiveringen av Akt ved hPEBP4 etter bestråling med HRT-18 som studiemodell *, P . 0,05
hPEBP4 deltar radioresistance av Endetarms kreft i vivo
for å avgjøre om hPEBP4 kan også formidle radioresistance av tykktarmskreft in vivo, undersøkte vi effekten av stråling alene, hPEBP4 forstummet alene, eller i kombinasjon på veksten av underhudsfett HRT-18 xenograft endetarmssvulster i hårløse mus (fig 5A). Fra den femtende dagen, tumorvolumet i den kombinerte behandlingsgruppe var signifikant lavere enn det i strålings eneste gruppe. Vekst-forsinkelse etter den kombinerte behandling var mer enn det som forårsakes av en av de andre behandlinger (figur 5B). Representative bilder av tumorvolumet ved den femtende dagen er illustrert i fig 5C. Vi har også observert apoptose av kreftceller in situ, som indikerte at det var en dramatisk høyere apoptose indeksen i HRT /hPEBP4-RNAi gruppen enn i HRT /Mock gruppe (Fig 5D, E).
A, etter flytskjema over de in vivo-forsøk;
B, etter vekstkurve for effekten av hPEBP4 på det transplanterte humane rektal tumor in vivo etter bestråling;
C,
representativt bilde av det transplanterte endetarms svulst i fotbladet av hårløse mus for hver gruppe 15 dager etter bestråling;
D,
representant TUNEL bildet for å vise i situ apopatosis av de transplanterte endetarms svulster for hver gruppe etter at musene ble ofret;
E
, In vivo apoptose sammendraget etter bestråling for hver gourp mus.
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å fastslå effekten av hPEBP4 på Radiosensitivity av tykk- og endetarmskreft. Våre resultater tyder på at hPEBP4 forbedrer radioresistance av kolorektal kreft celler både in vitro og in vivo, som ble formidlet av fremme ROS-avhengig aktivering av Akt.
Preoperativ strålebehandling har blitt en standard del av den omfattende behandlingen av lokalavansert endetarmskreft. Men mange pasienter med endetarmskreft er faktisk resistente mot strålebehandling på grunn av heterogenitet av endetarmskreft til bestråling respons. For disse pasientene, preoperativ strålebehandling ikke bare forsinker rask intervensjon av kirurgi, men også kan forårsake alvorlige toksisitet, slik som anastomotic lekkasje, perineal sårinfeksjon, og påvirke anal sfinkter funksjon etter sphincter bevarende kirurgi [19], [20]. Så utforskning av mekanismen for radioresistance av endetarmskreft er meget viktig for å forbedre renseeffekt. Det har blitt demonstrert at strålings-indusert apoptose er en viktig mekanisme for radiosensitiviteten i et panel av kreftceller, inkludert kolorektal cancer [21], [22]. Således kan et middel som er i stand til å forbedre den strålingsinduserte apoptose av tumorceller har potensial til å utvikle seg til en radiosensitizing middel. hPEBP4 er et nytt medlem av familien phosphatidylethanolaminebinding protein, identifiseres fra humane benmargs stromale celler [4]. Overekspresjon av hPEBP4 i bryst, prostata og eggstokk-kreft har blitt vist å hemme apoptose av kreftceller [4] – [8]. Så vi spurte om hPEBP4 spille en rolle i responsen av kreft i endetarmen til strålebehandling. Egentlig i en nyere arbeider, hadde vi vist at hPEBP4 uttrykk i en forbehandling biopsiprøve som en uavhengig prediktor for respons på preoperativ strålebehandling hos pasienter med endetarmskreft, og vi fant en dramatisk oppregulering av hPEBP4 uttrykk i endetarmskreft vev etter preoperativ strålebehandling comprared med biopsiprøve under koloskopi undersøkelse, som tyder på at hPEBP4 kan spille en rolle i radioresistance av endetarmskreft, men en direkte kobling mellom hPEBP4 og radioresistance ikke ble gitt på den tiden [12]. Nå med dette arbeidet, preget vi den relativt spesifikke uttrykk for hPEBP4 i endetarms kreft sammenlignet med tilstøtende normale rektal vev og gitt direkte eksperimentelle bevis om radioresistance effekten av hPEBP4 i endetarmskreft. Vi har også beskrevet den underliggende mekanisme for dette formål, som skal samles på den ROS-Akt signalveien. Men vi visste ikke nøyaktig signal arrangementet nedover av ROS, der hPEBP4 aktivert Akt å fremme radioresistance av endetarms ning. For stråling med lav Linear Energy Transfer, oftest brukes i strålebehandling av endetarmskreft i dag, oksygen og dets derivater som frie radikaler og reaktive oksygenforbindelser (ROS) er svært viktig i drapet på kreftceller i stedet for et direkte angrep på DNA fra radioaktive stråler [23]. Men rollen ROS i strålebehandling av svulsten er litt komplisert. På den ene siden ROS er kritiske formidlere av ioniserende stråling-indusert celle ødeleggelse, og på en annen side ROS kan gi kreftceller med overlevelse fordel fremfor vanlige kolleger under stressede tilstanden. Faktisk ROS er viktige intracellulære signalmolekyler som regulerer balansen mellom overlevelse og celledød [18], [24] – [26]. AKT syntes å være en kritisk faktor i radioresistance ved regulering av apoptose, cellevekst, glukoseopptak og utnyttelse, og proteinsyntese som BCL-2 familiemedlemmer, Caspase-3/9, FKHRL1, frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene [27 ] – [30]. Crosstalk mellom ROS og Akt signalveien har vist seg å eksistere i mange tumorceller. Ioniserende stråling i det terapeutiske doseområdet kan indusere en reversibel mitokondriell permeabilitet overgang og stimulere til en forbigående mobil generasjon av ROS, som deretter kan fungere som andre budbringere i signaltransduksjon [31] – [32]. Vår foreliggende studie viste at aktiveringen av Akt ved hPEBP4 i rektale kreftceller for bestråling ble opphevet etter antioksydant ble gitt for å hemme produksjonen av ROS, men hPEBP4 hadde ingen virkning på det intracellulære nivå av ROS, noe som tyder på at hPEBP4 fremmer spesifikt aktiveringen av AKT av ROS etter bestråling i endetarmskreftceller. Egentlig kan både overlevelse og apoptotisk virkning også finnes for Akt signal veien etter aktiveres av ROS [33] – [36]. Basert på data vi fikk fra denne studien, mener vi at hPEBP4 kan representere en overlevelse signal molekyl ved å aktivere ROS-Akt signalveien i forbindelse med strålebehandling av kreft i endetarmen. Spesielt overexpressed i kreftceller, hjelper hPEBP4 kreftcellene skjev å motstå stråling-indusert dreping av selektivt styrke overlevelsen signal nedstrøms ROS etter strålebehandling. Vi kan selv gjøre en dristig spekulasjoner om at Src kinase kan være den mellomliggende stillas for samspillet mellom hPEBP4, ROS og Akt siden vi har gitt den direkte bevis for sammenheng mellom hPEBP4 og Src i et annet arbeid med brystkreftceller og Src hadde blitt demonstrert å være nødvendig i aktiveringen av Akt ved ROS tidligere [32], [37].
i sammendraget er det den aller første rapporten tyder på en rolle hPEBP4 i radioresistance av endetarmskreft og vi også foreløpig spores ut den molekylære mekanismen for den effekten. Pluss prediktiv verdi av hPEBP4 i radioresistance av endetarmskreft med kliniske kreftprøver i vår siste rapport [12], tror vi hPEBP4 kan være et potensielt mål å forbedre følsomheten av strålebehandling for kreft i endetarmen. Videre arbeid er nødvendig for å demonstrere effekten av hPEBP4-målrettet terapi i å fremme strålebehandling i dyremodeller for endetarmskreft og avsløre den svarte boksen av signal hendelse mellom ROS og Akt, som hPEBP4 integrerer å spille sin rolle.
takk
Vi takker professor Wang Fan for hans nyttig diskusjon og Miss Yu for hennes støtte i arbeidsplanen.
