Abstract
For å forstå de molekylære mekanismene for Bifidobacterium infantis tymidinkinase /Nukleosidanalog ganciklovir (BI-TK /GCV) behandlingssystem som ble påvist å stille bærekraftig antitumorvekst aktivitet og indusere apoptose i blærekreft, en proteomikk tilnærming av isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ), etterfulgt av væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS /MS) ble anvendt. 192 nedregulert og 210 opp-regulerte proteiner ble identifisert etter behandling med BI-TK /GCV system i Sprague-Dawley (SD) rotter. Western blot-analyse og immunhistokjemi analyse bekreftet at Peroxiredoxin-I (prx-I) signifikant nedregulert i blærekreft etter behandling. Prx-I stanse ved transfeksjon av prx-I shRNA undertrykte betydelig vekst, fremmet apoptose og regulert cellesyklus i T24 celler og redusert fosfor-NF-kB p50 og p65 protein uttrykk som avslørte sammenhengen mellom prx-I og NF-kB pathway tilsi Oppfinnsomhet pathway analyse (IPA). Disse funn gir ny innsikt i behandlingen av blærekreft, avslører prx-I som en ny terapeutisk mål, og som indikerer BI-TK /GCV system som en potensiell behandling av nedregulering av prx-I via NF-kB signalveien.
Citation: Jiang L, Xiao X, Ren J, Tang Y, Weng H, Yang Q, et al. (2014) proteomikk Analyse av blærekreft Indikerer PRX-jeg som en nøkkel Molecule i BI-TK /GCV Treatment System. PLoS ONE 9 (6): e98764. doi: 10,1371 /journal.pone.0098764
Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences sentrum, USA
mottatt: 30 desember 2013, Godkjent: 06.05.2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av forskningsstipend fra Natural Scientific Foundation of China (No. 81072087 /H1619). Webadressen for National Natural Science Foundation of China: https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/default.htm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den vanligste urologisk kreft i. Asia og sin kliniske behandlingen er ekstremt dyrt [1]. I 2014 er ca 74 690 nye tilfeller av blærekreft forventes å bli diagnostisert, og om 15 580 av dem vil dø [2]. Blærekreft kan deles inn i to store kliniske og patologiske subtyper: overfladisk ikke-muskel-invasiv type og avansert muskel-invasiv type [3]. Generelt er overfladisk blærekreft behandlet med endoskopisk reseksjon med gunstig prognose, men det noen ganger oppstår igjen med grad progresjon [4]. Behandling av avansert blærekreft er en stor utfordring, og disse pasientene har en dårligere prognose med en svært lav 5-års overlevelse; derfor mer aggressive behandlingsalternativene er nødvendig slik som radikal cystektomi og urinavledning [5]. Videre blærekreft spesielt avansert type gjentar seg i et betydelig antall pasienter, og selv fører til døden, og derfor foretrukket mindre aggressive metoder bør utvikles for å bekjempe sykdommen.
Herpes simplex virus tymidinkinase (HSV -TK) -mediert selvmord genterapi som et allment akseptert strategi for behandling av blærekreft kan konvertere den ikke-toksisk nukleosid-analog ganciclovir (GCV) inn i en giftig triphosphorylated form, som deretter fører til død av hurtig delende celler [6]. Vi har tidligere tydd til
Bifidobacterium infantis
(BI) som en tumor-targeting bakterie, fordi det selektivt lokaliserer og prolifererer i de hypoksiske områder av tumorer som et ikke-patogent og anaerob bakterie [7], [8] . Vi fant at BI og TK /GCV (BI-TK /GCV) system viste en bærekraftig antitumorvekst aktivitet i gnagere blærekreft modell in vivo, som involverte både ytre og indre apoptose trasé [9].
i et forsøk på å forstå de underliggende molekylære mekanismer og identifisere potensielle mål-proteinmolekylet av denne trygg og effektiv behandling system, vi tydd til massespektrometri (MS) -baserte isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) for å oppnå fullstendig differensial protein profiler. Videre undersøkte vi molekyl sti Peroxiredoxin-I (prx-I), en av de identifiserte nedregulert proteiner i blærekreft identifiseres ved iTRAQ etter behandling med BI-TK /GCV.
Materialer og Metoder
Material
BI-TK /GCV behandlingssystemet ble bygget med hell av vår forskningsgruppe (Chongqing, Kina) [9].
Forsøksdyr
sytti Sprague-Dawley-rotter (6-8 uker gamle, som veide 180-200 g) ble innkjøpt fra Chongqing National biologisk industrien base av Experimental Animal senter (Kina) og holdt under spesifikke patogen-frie tilstand ved 23-27 ° C og luftfuktighet 55-65% med 12-timers lys-mørk sykluser. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Animal bruk og vedlikehold komité Chongqing Medical University. En rotte blære tumor-modellen ble bygget ved perfusjon av N-metyl-nitrosourea (MNU) (Sigma, USA). MNU ble fortynnet til 20 g /l av en sitronsyrebufferløsning. Hver blære ble dynket med 0,1 ml en gang hver 2 uker, for totalt fire perfusjoner.
Studier in vivo
Sixty tumorbærende Sprague-Dawley rotter ble tilfeldig delt inn i fire grupper (hver
n
= 15): en vanlig saltvann gruppe, en BI-gruppe, en BI /pGEX-en gruppe, og en BI-TK gruppe. Etter at bifidobacterium ble konsentrert, ble omtrent 0,5 ml av samsvarende inngrep injisert via halevenen (bakterie telling, 4,4 x 10
9) en gang i uken i 4 uker. Alle gruppene fikk daglig intraperitoneal injeksjon av GCV (50 mg /kg) i 28 dager. Alle rottene ble avlivet under bedøvelse med natriumpentobarbital. En del av blærekreft vev fra de fire gruppene ble bevart i parafin for immunhistokjemisk (IHC) analyse, og resten av vevene ble holdt ved -80 ° C for videre analyse.
Protein prøvepreparering og iTRAQ merking
De vev ble lysert i en lyseringsbuffer (7 m urea, 1 mg /ml DNaseI, en mmNa
3VO
4, og 1 mm fenylmetan sulfonylfl uoride, PMSF) og sentrifugert ved 6000 g og 4 ° C i 30 minutter. Supernatanten ble samlet opp, og det totale proteininnholdet ble målt ved hjelp av 2D Quantification Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Hver prøve ble spaltet med 20 pl 0,1 pg /pl trypsin-oppløsning (Promega, Madison, USA) ved 37 ° C over natten og deretter merket med iTRAQ kodene som følger: (i) fysiologisk saltvann gruppe, 114 lapper; (Ii) BI-TK gruppe, 115 koder; (Iii) BI /pGEX-en gruppe, 116 koder; (Iv) BI gruppe, 117 koder. De merkede prøvene ble samlet før videre analyse.
Sterk kationerbytter (SCX) kromatografi
For å redusere prøve kompleksitet for væskekromatografi (LC) -MS /MS analyse, samleprøver var fortynnet 10 ganger med en SCX-buffer A (10 mm KH
2PO
4 i 25% acetonitril i pH 3,0) og anvendt til en 2,1 x 200 mm polysulfoethyl en SCX-kolonne (PolyLC, Columbia, USA). Kolonnen ble eluert med en gradient av 0-25% SCX buffer B (10 mM KH
2PO
4 ved pH 3,0 i 25% acetonitril inneholdende 350 mM KCI) i løpet av 30 minutter, etterfulgt av en gradient av 25- 100% SCX buffer B i løpet av 40 min. Disse SCX fraksjoner ble lyofilisert i vakuum konsentrator og underkastet C-18 clean-up ved hjelp ekstraksjonskolonne (100 mg kapasitet, Supelco; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
elektrospray ione-kvadrupol tids -av-flight MS (ESI-Q-TOF-MS) Analyse
MS ble utført ved hjelp av en nano-LC koblet på nettet til en QStar Elite massespektrometer (Applied Biosystems). LC elueringsmiddel ble rettet mot et ESI kilde for Q-TOF-MS-analyse. Massespektrometer ble satt til å utføre informasjonen avhengige kjøp (IDA) i den positive ion-modus, med en utvalgt masse rekke 300-2,000 m /z. Peptider med 2 til 4 ladningstilstander ble valgt for tandem massespektrometri, og tiden for summering av MS /MS-hendelser ble satt til 3 sek. Relativ kvantifisering av proteiner, i tilfelle av iTRAQ, ble utført på de MS /MS-skanninger og var forholdet mellom arealene under toppene ved 113, 114, 115, og 116 Da, som ble massene av de koder som svarer til iTRAQ reagenser.
proteomikk analyse
de bioinformatiske prosesser og molekylære funksjon av de identifiserte proteiner i BI-TK gruppe etter behandling ble klassifisert av PANTHER klassifiseringssystem (www.pantherdb.org). Trasé av ulikt uttrykte proteiner identifisert av iTRAQ ble analysert ved oppfinnsomhet pathway analyse (IPA) program (https://www.ingenuity.com). På programvare oppfinnsomhet, ble dataene brukes til å trekke interaktive nettverk blant proteinene i Index (IPI) database International Protein. Et nettverk med en score høyere enn to er vanligvis betraktet som gyldig.
Validering av Western blot og IHC
Western blotting og IHC ble brukt til å bekrefte uttrykk for PRX-I. T Proteinprøver (omtrent 20 mg) ble separert ved hjelp av SDS-PAGE. Etter SDS-PAGE-elektroforese, ble proteinene overført til PVDF-membraner. Deretter ble lysatene inkubert med et primært anti-prx-I-kanin-monoklonalt antistoff (1:1500) (Abcam, USA). De immunoreaktive signaler ble påvist ved forsterket kjemiluminescens kit (Amersham Biosciences, Sverige). Prosedyrene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Blærekreft vev fra fire grupper som ble inkubert over natten med primære antistoffer. Vevene ble inkubert med sekundære antistoffer i 2 timer. Cellekjerner ble kontra med hematoksylin. Andelen av positivt fargede tumorceller ble bestemt ved bilde-Pro Plus (IPP) 6,0 og ble gradert som følger: 0, negativ; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. Den farging intensitet ble scoret som følger: 0, fraværende; 1, lys gul; 2, gulaktig brun; 3, brun. Proteinet i blæren kreft vev ble evaluert ved bruk av farging indeks (SI).
SI
= andel × intensitet positive tumorceller
PRX-en knockdown av shRNA
T24-celler ble utsatt for Prx1 knockdown. Kort hårnål RNA (shRNA) ble exprssed med GV102 system (GeneChem, Kina). De tre par av sense og antisense oligonukleotider sekvenser av målrettet mot human Prx1 (GeneBank_ID: NM_002574) var som følger: PRDX1-RNAi (sh-1) senstråden 5′-GATCCCGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCTTTTTGGAT-3 «, PRDX1-RNAi (sh-1) antisensekjeden 5»-AGCTATCCAAAAAGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCGG-3 «; PRDX1-RNAi (sh-2) senstråden 5»-GATCCCGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCTTTTTGGAT-3 «, PRDX1-RNAi (sh-2) antisensekjeden 5′-AGCTATCCAAAAAGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCGG-3′; PRDX1-RNAi (sh-3) senstråden 5»-GATCCCCCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGTTTTTGGAT-3 «, PRDX1-RNAi (sh-3) antisensekjeden 5′-AGCTATCCAAAAACCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGGG-3».A egge sekvensen til prx-I target ble anvendt som en negativ kontroll (con sh). T24-celler ble transient transfektert med Prx1-shRNA ekspresjonsvektorer ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). Ikke-infiserte T24 celler (foreldre) og PRX-styrer jeg shRNA smittet T24 celler (con sh) ble også brukt. Den høyeste effektivitet av knockdown etter shRNA vektorer i T24-celler ble bestemt ved kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR). Primersekvensene for PRX-I var 5′-AGCCTGTCTGACTACAAAG-3 «(fremover) og 5′-TCTGCCCTATCACTGAAAG-3′ (bakover), som ga et 104 bp produkt. Primersekvensene for internkontroll GAPDH var 5»-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 «(fremover) og 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3» (bakover), som ga en 110 bp produkt. Uttrykket Verdien av prx-I, sammenlignet med den for GAPDH ble beregnet som 2-ΔΔCt. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Deretter uttrykk for prx-I i T24-celler slått ned av shRNAs ble målt ved Western blotting.
celleproliferasjonsanalyse
Etter transfeksjon med prx-I shRNA i 24 timer, de T24 cellene sådd ut i 96-brønners kulturplater ved en tetthet på 4 x 10
3-celler i et sluttvolum på 100 ul /brønn, og de ikke-transfekterte celler ble anvendt som en kontroll. Den celle-proliferasjon ble beregnet ved forskjellige tidspunkter (24, 48 og 72 h) ved hjelp av celletellingsleder-8 (CCK-8) (Sigma, USA). Eksperimenter ble utført i henhold til produsentens protokoll. Absorbansen ved 450/630 nm ble målt med en Thermo spektrofotometer (Waltham, USA). Den gjennomsnittlige absorbans fra seks brønner pr gruppe ble beregnet.
Strømningscytometrisk analyse
Etter transfeksjon i 48 timer, ble cellene trypsinert og sentrifugert ved 1500 rpm i 5 min. Cellene ble høstet og vasket to ganger med PBS. Etter farget med 50 ug /ml Annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) (BD Biosciences, USA) og 20 ul av 500 ug /ml propidiumjodid (PI) (Sigma, USA) for apoptose deteksjon, ble cellene inkubert i mørke ved romtemperatur i 15 minutter og underkastet strømningscytometri-analyse (FACS). Deretter ble cellene samlet opp, vasket med PBS, fiksert med 75% etanol ved -20 ° C over natten. De fikserte cellene ble vasket med kald PBS to ganger, tilsatt 500 pl DNA-fargeløsning (inkludert 200 ug /ml RNase A og 20 pg /ml propidiumjodidfarging løsning) og inkubert i 30 minutter. Til slutt ble cellene underkastet cellesyklusanalyse ved FACS. Dataene ble analysert og evaluert på programmet ModFit (Topsham, USA).
Effekt av PRX-I på fosfor-NF-kB p50 og p65
Koblingen mellom PRX-I og NF-kappa-B (NF-kB) -kompleks signale var blitt antydet i protein vei av IPA. Derfor, for å utforske hvorvidt effekten av prx-I på apoptotiske signaliseringsproteiner tilskrives NF-kB-inhibering, evaluerte vi atom nivåer av fosfo-NF-kB p50 og p65 (Abcam, USA) ved hjelp av Western blot.
Statistisk analyse
dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) og sammenlignet ved hjelp av variansanalyse. Graden av signifikant forskjell ble definert som p 0,05. Alle analyser ble utført på SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, USA) for Windows.
Resultater
Kvantifisering og identifisering av differensielt uttrykte proteiner av iTRAQ
Totalt 2343 unike proteinene ble identifisert med 95% sikkerhet ved ProteinPilot søkealgoritme mot IPI rotte protein database v3.49. En streng grenseverdi på en 1,3 ganger endring resulterte i et endelig sett av 402 differensielt uttrykte proteiner, inkludert 192 nedregulert proteiner og 210 opp-regulerte proteiner i BI-TK gruppe etter behandling. Påfallende, en roman molekyl Prx- jeg trakk vår spesielle oppmerksomhet, med en 0,52-fold nedgang i BI-TK gruppe versus vanlig saltvann gruppen. Et skjematisk diagram av iTRAQ er vist i figur 1A, og MS /MS-spektret av Prx- I (peptidsekvens: VVGDHVEVHAR) er vist i figur 1B. De iTRAQ kodene er som følger: (i) fysiologisk saltvann gruppen, 114 koder; (Ii) BI-TK gruppe, 115 koder; (Iii) BI /pGEX-en gruppe, 116 koder; (Iv) BI gruppen, 117 koder. Proteinet ID i IPI, navn og hovedfunksjoner med overflod endringer illustrert i tabell S1
A:. Prinsippskisse som viser arbeidsflyten av iTRAQ. B: MS /MS-spektrum som viser peptidene prx-I (peptidsekvensen: VVGGDHVEVHAR). De 4 rush konturer beskrive at prøvevolumer er de samme som garanterer resultatene er ekte og pålitelig.
bioinformatiske funksjonell analyse av forskjellig uttrykt proteiner etter behandling med BI-TK /GCV
for å sondere inn i sine biologiske roller i helbredende effekten av BI-TK /GCV på blærekreft, ble differensielt uttrykte proteiner inndelt i ulike prosesser og funksjons klasser basert på PANTHER klassifiseringssystemet. I biologisk prosess analyse, den største andelen av differensielt uttrykte proteiner var i metabolske prosess, etterfulgt av cellulær prosess og celle kommunikasjonsprosessen (figur 2A). Spesielt proteiner som er involvert i katalytisk aktivitet, innbinding, strukturelle molekyl aktivitet, enzym regulator aktivitet og reseptor aktivitet var de fem beste molekylære funksjonskategorier (figur 2B). Videre er proteiner som er involvert i antioksidantaktivitet utgjorde 1,3%, henholdsvis. Figur 2C viser de primære trasé som genereres av IPA av forskjellig uttrykt proteiner. Dette nettverket mottok 36 og besto av 37 proteiner som er involvert i apoptose, oksidativt stress, og metabolisme. Spesielt er prx-I, er markert ned-uttrykte protein etter behandling, direkte knyttet til transkripsjonsfaktor NF-A-B kappa (NF-kB) kompleks bane i dette nettverket, noe som indikerer at prx-I kan spille en viktig rolle i apoptose av blærekreft ved BI-TK /GCV system dels via NF-kB signalveien.
PANTHER- klassifisering av proteiner basert på (A) biologisk prosess og (B) molekylær funksjon. (C) samspillende nettverk av proteiner med overflod forandring som genereres av oppfinnsomhet sti-analyse (IPA). Nettverket forstått tilkobling av PRX-I og NF-kB kompleks.
Validering av PRX-I med Western blot og IHC
differensial uttrykk nivåer av Prx- jeg identifisert av iTRAQ tilnærming ble validert av Western blot (figur 3A). Sammenlignet med normal saltløsning gruppe, er ekspresjon av prx-I nedregulert i de tre andre gruppene (spesielt i BI-TK-gruppe), som er lik de oppnådde resultater ved iTRAQ. Dessuten ble det prx-I ekspresjon i tumorvev verifisert ved IHC-analyse (figur 3B). Den prx-I-innhold i blærekreftceller BI-TK gruppe var betydelig lavere enn i de andre gruppene (p 0,05, figur 3B)., Som er i overensstemmelse med resultatene oppnådd ved iTRAQ og Western blot
A: uttrykk for PRX-i i fire grupper av Western blot analyse. Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B: Representative bilder som viser immunoexpression av prx-I i tumorvev, i fire grupper. Sammenlignet med normal saltløsning gruppe, er ekspresjon av prx-I nedregulert i de tre andre gruppene (spesielt i BI-TK-gruppe), som er lik de oppnådde resultater ved iTRAQ. (Asterisk (*) viser P 0,05 i BI-TK gruppe versus vanlig saltvann gruppe)
qPCR og Western blot for å forstyrre effektiviteten i T24 celler
Først Prx- i-mRNA-nivåer fra fire shRNA vektorer transfektert i 48 timer i T24 cellelinjer ble målt ved hjelp av qPCR Lipofectamine 2000. prx-i ekspresjon ble redusert med ~40%, 26%, 18% og 1% i sh-1, sh -2, sh-3 og con sh grupper, henholdsvis i forhold til foreldregruppen (figur 4A). For å bekrefte dette forstyrrer effektiviteten ble protein ekspresjonsnivåene av prx-I i T24-celler etter transfeksjon undersøkt ved hjelp av Western blot. Resultatene viste at prx-I-nivåer betydelig redusert med -48%, 30%, 18% og 3% fra basislinje i den sh-1, sh-2, SH-3 og con SH-gruppene henholdsvis (figur 4B), som indikerer at høyeste interfererende effektivitet i T24-celler var i det sh-1 gruppe
A:. ekspresjon av prx-i-mRNA ble undersøkt ved qPCR. GAPDH fungerte som en intern kontroll. B: prx-I-proteinnivåer ble analysert ved hjelp av Western blot etter transfeksjon. Sh-1-behandling førte til en betydelig reduksjon i prx-I-protein-ekspresjon i T-24 celler. (Asterisk (*) viser P 0,05 i sh-en gruppe versus foreldregruppe)
PRX-I knockdown hemmet T-24 cellevekst
Virkningene av PRX-I shRNA transfeksjon på T24 cellevekst ble undersøkt gjennom CCK8 analyser. En svak inhibering i vekst ble observert ved 24 timer etter transfeksjon. Videre ble åpen hemmende effekt på celleproliferasjon observert i PRX-I knockdown-celler på 48 og 72 timer, sammenlignet med foreldrenes og con sh grupper (figur 5, s 0,05), noe som tyder på at hemming av PRX-jeg kunne undertrykke T24 cellevekst in vitro.
vekst~~POS=TRUNC i PRX-i knockdown gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med foreldre og con sh grupper, målt ved CCK8 analysen.
Effekt av prx-i shRNA transfeksjon på apoptose og cellesyklus av T-24 celle
virkningene av prx-i knockdown på apoptose og cellesyklusen T24 cellen ble undersøkt. Etter 48 timer av transfeksjon, apoptose satsen i sh-en gruppe (21,99 ± 1,10%) var signifikant høyere sammenlignet med con shRNA gruppen (4,51 ± 0,73%) og foreldregruppen (4,96 ± 0,46%) (P 0,05) (Figur 6A). Cellesyklus analyse viste at G0 /G1 fase forholdet i sh-en gruppe (61,13 ± 0,50%) var signifikant høyere sammenlignet med con sh gruppen (49,62 ± 0,84%) og foreldregruppen (48,03 ± 1,17%) (P 0,05) (figur 6B)
A:. PRX-i knockdown indusert apoptose i T24 celler. B:. Representative bilder av FACS analyse som viser PRX-I knockdown indusert G0 /G1 cellesyklus arrest i T24 celler med en tilsvarende reduksjon i S-fase celler (P 0,05)
Effekt av Prx- i på NF-kB veien
som beskrevet ovenfor, prx-i er direkte knyttet til NF-kB-komplekset, som er blitt antydet i protein pathway (figur 2C). For å undersøke om effektene av PRX-I på apoptotiske signalproteiner skyldtes NF-kB hemming, ble de aktiverte formene for fosfor-NF-kB p50 og p65 undersøkt med Western blot etter transfeksjon med PRX-I shRNA i T24 celler. En betydelig reduksjon (P 0 · 05) i protein ekspresjon av både fosfo-NF-kB p50 og p65 ble observert i sh-en gruppe (figur 7), sammenlignet med con sh og foreldre grupper, noe som indikerer at prx-I knockdown inhiberte aktiveringen av NF-kB P50 og P65 i T24-celler.
En betydelig reduksjon i protein ekspresjon av både fosfo-NF-kB p50 og p65 i sh-1 gruppe. (Asterisk (*) viser P 0,05 i sh-en gruppe versus foreldregruppe)
Diskusjoner
I vår forrige undersøkelse, BI-TK /GCV ble konstruert og bevist effektive i inhibering av progressiv vekst av blære tumor som var knyttet til apoptose in vivo [9], [10], noe som indikerer at BI-TK /GCV var et vellykket behandlingssystem og kan tilveiebringe en ny strategi for behandling av fremskreden eller metastatisk blærekreft i fremtiden .
i denne studien ble en proteomikk tilnærming iTRAQ brukes til å identifisere ulikt uttrykte proteiner, med formål å avdekke molekylære mekanismer og gir teoretisk støtte for effektiviteten av BI-TK /GCV system. iTRAQ identifisert 402 differensielt uttrykte proteiner i blærekreft vev etter behandling, inkludert 192 downregulated proteiner og 210 oppregulert proteiner. Målrettingsnavnene proteiner med differensial overflod (tabell S1) Dato sentral rolle i en rekke cellulære reaksjonsveier, inkludert metabolisme, apoptose, antioksidantaktivitet, cellesyklus, proliferasjon, signaltransduksjon og celleadhesjon. Selv om den eksakte mekanismen som BI-TK /GCV når sine intracellulære mål er uklart, er rettet mot proteiner av BI-TK /GCV skal delta i spredning og apoptose av blære kreft celler, og gi nye mål for fremtidig behandling.
PRX-jeg sto ute i vår proteomikk analyser fordi det hadde sjelden vært knyttet direkte med blærekreft selv om det har vist seg å down-express i blærekreft vev etter behandling med BI-TK /GCV. Pattedyr peroxiredoxin (prx) familie som består av seks proteiner er H
2o
2 fjernende enzymer tilstede i prokaryote og eukaryote celler [11] – [13]. Prx-I representerer typiske-2-Cys, og er den mest tallrike og ubiquitously fordelt isoform av PRDX [14], [15], som har vært nært beslektede med celleproliferasjon og differensiering, intracellulær redoks-signalisering, og apoptose [16] – [19]. Prx-I er sterkt uttrykt i faste organer og i vev av enkelte kreftformer [20] -, og er også positivt assosiert med tilbakefall og progresjon av blærekreft [24], [25]. Tilsvarende PRX-I over-uttrykket er assosiert med redusert total overlevelse, dårlig klinisk resultat, og motstand av kreftceller til strålebehandling og kjemoterapi [26] – [28], mens den ned-uttrykk for PRX-I av RNAi er assosiert med terapeutiske utfordringer for leverkreft, spiserørskreft, og skjoldbruskkjertelkreft [29] – [31]. Faktisk, basert på den iTRAQ analyse (tabell S1), Western blot (Fig. 3A) og IHC-analyse (Fig. 3B) i den foreliggende undersøkelse, prx-I ekspresjon signifikant redusert i blærekreft vev etter behandling med BI-TK /GCV Dette indikerer at prx-i kan bidra til virkningen av BI-TK /GCV behandling med anti-vekst og pro-apoptose av blærekreft. Knockdown av prx-I-genet ved shRNA undertrykte betydelig vekst, fremmet apoptose og regulert cellesyklus i blærecancerceller (figur 6, 7). Disse resultatene demonstrerer den positive rollen prx-I i utviklingen av blærekreft. Vi antar at BI-TK /GCV behandlingssystemet er i stand til å forebygge tumorvekst og induserer apoptose i den gnager blærekreft modellen ved å nedregulere prx-I ekspresjon. Men hva signalveien er det gjennom?
Heldigvis har sammenhengen mellom PRK-I og NF-kB kompleks signale vært antydet i protein vei av IPA (figur 2C), som fører oss til å finne hint . Prxs har vært innblandet som sentrale regulatoriske forhold i Redox signal [32] – [34]. Prxs kan slukke den andre messenger H
2o
2 og hemme signaloverføring ved å aktivere metabolismen av H
2o
2. Overoxidation av PRX fra en cystein-sulfensyre syre (Cys-SOH) til en cysteinesulfinic syre (Cys-SO
2 H) kan stoppe metabolismen av H
2o
2, slik at opphopning av H
2o
2-konsentrasjon og utbredelse av signaltransduksjon. Reduksjon av Cys-SO2H til Cys-SOH oppnås gjennom handlingene til sulfiredoxin, som gjenoppretter PRX-mediert H
2o
2 metabolisme [35] – [37]. Cytoplasmatiske Prx1 regulerer H
2o
2-avhengige NF-kB aktivering og kjernekraft translokasjon, og kjernefysisk Prx1 regulerer NF-kB /DNA-binding gjennom eliminering av H
2o
2 som en p50 subenheten oksidasjonsmiddel [ ,,,0],38]. Prx1 forbedrer p65-mediert cyklooksygenase (COX) -2 genuttrykk i østrogenreseptor (ER) mangelfulle menneskelige brystkreft celler (MDA-MB-231), og knockdown av PRX-jeg kan dempe COX-2 uttrykk ved å redusere belegg på NF -κB ved sin oppstrøms promotorelement, noe som indikerer at prx-i virker som en anstand for å forbedre den trans potensialet av NF-kappaB i ER–mangel-brystcancerceller [39]. Faktisk, i foreliggende studie, knockdown av prx-I reduserte protein uttrykk for fosfo-NF-kB p50 og p65, og dermed den undertrykte veksten fremmes apoptose og regulert cellesyklusen av blærecancerceller ved å inhibere NF-kB vei, som likedannet IPA nettverk (Figur 2C).
Konklusjoner
til sammen identifiserte vi at PRX-jeg sammen med NF-kB vei bidro til blærekreft for første gang. BI-TK /GCV-behandlingssystemet oppviste en varig antitumorvekst aktivitet og induserte apoptose i blæren kreftvev ved inhibering av prx-I via NF-kB pathway. Vår forskning gir ny innsikt i blærekreft behandling og viser at BI-TK /GCV behandlingssystemet ved å målrette på PRX-jeg kan være en roman terapeutisk strategi i fremtiden.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
iTRAQ Analyse av forskjellig uttrykt Proteiner i normal salt gruppe (iTRAQ 114), BI-TK gruppe (iTRAQ 115), BI /pGEX-en gruppe (iTRAQ 116) og BI gruppe (iTRAQ 117)
doi.: 10,1371 /journal.pone.0098764.s001 plakater (docx)
