Abstract
Kliniske studier tyder på at svarene på HPV16 E6E7L2 fusjonsprotein (TA- CIN) vaksinasjon alene er beskjedne, og GPI-0100 er en godt tolerert, potent adjuvant. Her søkte vi å optimalisere både immunogenisitet av TA-CIN via formulering med GPI-0100 og behandling av HPV16 + kreft ved vaksinasjon etter cisplatin kjemoterapi. HPV16 nøytraliserende serum antistofftitere, CD4 + T-celle-proliferative og E6 /E7-spesifikke CD8 + T-celleresponser ble betydelig forbedret når mus ble vaksinert subkutant (s.c.) eller intramuskulært (i.m.) med TA-CIN formulert med GPI-0100. Vaksinasjon ble testet for behandling av mus med syngene HPV16 E6 /E7 + tumorer (TC-1) enten i lungene eller subkutant. Mus behandlet med TA-CIN /GPI-0100 vaksinering oppviste robuste E7-spesifikke CD8 + T-celleresponser, som ble forbundet med redusert tumorbyrde i lungene, mens mus som mottok de enkelte komponentene alene var tilsvarende kontroller. Siden vaksinasjon alene var ikke nok for kur, mus med subkutan TC-1 tumor ble først behandlet med to doser av cisplatin og deretter vaksinert. Vaksinasjon med TA-CIN /GPI-0100 i.m. vesentlig forsinket tumorvekst og forlenget overlevelse etter cisplatin terapi. Injeksjon av TA-CIN alene, men ikke GPI-0100, inn i tumoren (i.t.) var likeledes virksom etter cisplatinbehandling, men musene etter hvert bukket under. Imidlertid ble tumorregresjon og utvidet remisjon observert hos 80% av musene som ble behandlet med cisplatin og deretter intra-tumoral TA-CIN /GPI-0100 vaksinasjon. Disse musene viste også robust E7-spesifikke CD8 + T-celle og HPV16 nøytraliserende antistoffresponser. Dermed formulering av TA-CIN med GPI-0100 og intra-tumor levering etter cisplatin behandling utløser potente terapeutiske tiltak i en murine modell av HPV16 + kreft
Citation. Peng S, Wang JW, Karanam B, Wang C, Huh WK, Alvarez RD, et al. (2015) Sekvensiell Cisplatin Terapi og vaksinasjons med HPV16 E6E7L2 Fusion Protein i Saponin Adjuvans GPI-0100 for behandling av en modell HPV16 + Cancer. PLoS ONE 10 (1): e116389. doi: 10,1371 /journal.pone.0116389
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 15 august 2014; Godkjent: 08.12.2014; Publisert: 05.01.2015
Copyright: © 2015 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Studien ble finansiert med tilskudd fra V foundation (www.jimmyv.org) til SP og RBSR og Public Health Service (tilskudd. nih.gov) gir P50 CA098252 til TCW, RO1 CA133749 til DY, og CA118790 til RBSR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. RBSR er en oppfinner av L2-relaterte patenter (US applikasjons 20090047301 papillomavirus L2 N- Terminal peptider for induksjon av grovt Cross-nøytraliserende antistoffer og amerikanske program 20130177585 papillomavirus L2 N-terminale peptider for induksjon av grovt CROSS-nøytraliserende antistoffer) lisensiert til Shantha biotechnics Ltd., GlaxoSmithKline, PaxVax, Inc. og Acambis, Inc. RBSR og TCW er grunnleggerne av Papivax LLC og vitenskapelige rådgivere til Papivax Biotech Inc. vilkårene for disse ordningene forvaltes av Johns Hopkins University i samsvar med sin konflikt av interesse politikk. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
introduksjon til
«høy risiko» menneskelige papillomavirus (hrHPV) årsak 5,2% av alle krefttilfeller i verden [ ,,,0],1]. Mens vedvarende hrHPV infeksjon er en nødvendig årsak til kreft, er det store flertall av infeksjoner spontant klarert av vertsimmunitet. Sekundær forebygging via cytologiske og HPV screening og intervensjonsprogrammer har redusert byrden av livmorhalskreft med anslagsvis 80% i industrialiserte land, og nå to forebyggende HPV-vaksiner målrette de to mest utbredte av de 14 hrHPV typer, HPV16 og HPV18. HPV16 er genotypen til stede i 50-60% av livmorhalskreft, i 87% av HPV + orofaryngeal karsinom [2], i 55% og 76% av HPV + invasive vaginal og vulva karsinom [3], og i 73% av analkreft [ ,,,0],4]. Den betydelige effekt og sikkerhet av lisensierte HPV-vaksiner for å forebygge nye HPV16 og HPV18 infeksjoner er godt dokumentert [5]. Imidlertid er det vern av disse kommersielt tilgjengelige vaksiner generelt Typen begrenset [6], og vaksinasjons prisene dessverre forbli lav i utviklingsland. Viktigere, disse vaksinene mangler terapeutisk aktivitet for pasienter med vedvarende HPV infeksjon og etablerte HPV assosiert celleforandringer [7], har Terapeutisk HPV-vaksinering potensial til å forsterke effekten av konvensjonelle uspesifikke, kirurgiske og ablativ behandling av høy klasse neoplasi, eller selv chemoradiation terapi av invasive HPV + kreft. Til tross for bruk av cisplatin og /eller strålebehandling [8], fem-års overlevelse av avanserte livmorhalskreftpasienter forblir 30%. Dermed målrettede behandlingsstrategier, for eksempel terapeutiske HPV-vaksinering, er nødvendig for å forbedre resultatene hos pasienter med avansert livmorhalskreft [9].
Kandidaten terapeutiske HPV-vaksine TA-CIN er et rekombinant protein bestående av en blanding av HPV16 teinene E6, E7 og den mindreårige kapsidprotein L2 som er renset fra
E. coli product: [10]. E6 og E7 virale oncoproteiner er lovende mål for immunterapi, som blir uttrykt i alle infiserte celler, som kreves for levedyktigheten av HPV + kreftceller og fraværende fra normale vertsceller. Den mindre kapsidprotein L2 er ikke påvisbart uttrykt i HPV-+ kreftceller, men det er en potensiell terapeutisk antigen for forstadier [11], [12], [13]. Videre L2 inneholder konserverte nøytraliserende epitoper og har potensial som en bredt forebyggende HPV-antigen [14]. Tre månedlige immuniseringer fra friske frivillige med TA-CIN uten adjuvans, fremkalte en L2-spesifikke nøytraliserende antistoffer og T-celle proliferative responser på en doseavhengig måte [15]. E6 og E7 spesifikke CD8 T-celle immunitet ble oppdaget av IFNy ELISPOT i 8 av 11 evaluerbare fag ved den høyeste dosen, selv om E6 var den dominerende antigen. Men den totale responsen var beskjedne, noe som tyder på behovet for et hjelpestoff [16], [17] og heterolog boosting med en rekombinant viral vektor [18], [19], [20].
Protein-baserte vaksinasjon uten en adjuvant induces vanligvis svak immunrespons. GPI-0100 er en potent adjuvant avledet ved å modifisere utvalgte naturlige saponiner [21] for å fjerne forholdsvis giftige og ustabile acylenheter, og innføring av en lipofil gruppe [22], [23]. Doser på 100 mikrogram til 5000 mikrogram av GPI-0100 er testet med flere antigener i tidlig fase kliniske forsøk og ble godt tolerert [21], [24]. Vaksinering av aper med TA-CIN i kombinasjon med adjuvant GPI-0100 (TA-CIN /GPI-0100) ble også godt tolerert og fremkalte robuste nøytraliserende antistofftiter mot HPV16, med mindre responser mot andre HPV-typer som ble testet, og T-celle responser til HPV16 E6 og E7 [16]. Utforming av TA-CIN med GPI-0100 dypt forbedret nøytraliserende antistoffrespons og beskyttet mus fra eksperimentell hud utfordring med HPV16 pseudovirions som leverer en luciferase reporter. Inkludering av GPI-0100 også forbedret E7 spesifikke CD8 T-celle respons på TA-CIN vaksinering og beskyttet mus fra utfordring med TC-en cellelinje, en HPV16 E6 /E7 + murine tumor modell [16]. Imidlertid sin terapeutiske aktivitet mot etablerte tumor ble ikke testet.
Nyere studier antyder at lokal immunisering er viktig å utløse en cellulær immunrespons at boliger tilbake til det aktuelle området, og at kjemoterapi kan forsterke immunresponsen delvis av krymper sykdomsbyrde, slippe tumorantigener og forbigående å modifisere immunmikromiljøet i tumoren [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Behandling med cisplatin og /eller lav-dose stråling kan øke styrken av terapeutiske HPV-vaksiner i musemodeller [32], [33], [34]. Samtidig behandling med cisplatin og intratumoral injeksjon (det) på E7 peptid i C57BL /6 mus med E6 /E7-uttrykker TC-1 svulster som genereres betydelig mer E7-spesifikk IFN-γ-sekresjon CD8
+ T-celler og kunne kurere mange mus, mens de som ble behandlet med enten behandling alene ikke genererte lignende tumorvekst kontroll. Viktigere, subkutan administrering av E7 peptid kontrollert tumorvekst mindre effektivt enn intratumoral administrasjon, noe som indikerer at levering av antigenet inn i tumoren mikromiljøet forbedrer priming av en tumor antigen-spesifikke CD8 + T-celle-immunrespons etter kjemoterapi [34]. Cisplatinbehandling også forbigående induserte en signifikant akkumulering av dendrittiske celler (DCS) i svulsten mikromiljøet. Videre intratumoral injeksjon av antigent peptid førte til opptak av E7 peptidet ved CD11c + DC og migrering av E7-peptid-lastet DC til de drenerende lymfeknutene [34]. De E7 peptid-lastet DC i drenering lymfeknute kunne aktivere E7-spesifikke CD8 + T-celler. Viktigere, dette merket forbedring av E7-spesifikke CD8 + T-celler i sirkulasjon og antitumor effekt ble også observert da TC-1 tumorbærende mus ble behandlet med cisplatin og intratumoral TA-CIN vaksinasjon [35].
Vår tidligere studier hos mus og aper støtter sikkerheten og styrken av GPI-0100 som en adjuvant for TA-CIN, men fikk ikke undersøke dens innvirkning på terapeutiske aktivitet [16]. Her sammenlignet vi vaksinasjon alene og cisplatin etterfulgt av intratumoral eller intramuskulær vaksinasjon TA-CIN formulert med GPI-0100 adjuvant for behandling av etablerte TC-1 tumorer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
human-avledede cellelinje 293TT er brukt i denne studien. Denne cellelinje er tidligere blitt beskrevet [37], [38]. Dyrestudier ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health og med forhåndsgodkjenning av Animal Care og bruk komité Johns Hopkins University (MO14M43). Musene ble overvåket i minst tre ganger i uken, og humane endepunkter ble anvendt i overlevelse studier; Musene ble avlivet på overflødig tumorbelastning (≥2 cm diameter eller sår), eller første tegn på nød for eksempel tap av vekt (≥10%), slapphet, dårlig pelskvalitet, lysfølsomhet, hekkende eller riper. Mus ble bedøvd med isofluran inhalasjon, avlives ved karbondioksyd kvelning og død sikres ved cervikal dislokasjon.
Mus
5~8 uker gamle hunn C57BL /6 eller Balb /c-mus ble innkjøpt fra National Cancer Institute (Frederick, MD) og holdt i minst en uke før studiestart. Alle mus ble opprettholdt ved Johns Hopkins University School of Medicine (Baltimore, Maryland) kreftsenter dyr anlegg under spesifikt patogen frie forhold. Musene ble opprettholdt 5 per mikroisolatorbur bur med steril mat og sengetøy, skiftes ukentlig, og randomiserte av buret.
peptider, antistoffer og reagenser
H-2K
b-begrenset HPV16 E6aa50-57 peptid, YDFAFRDL, og H-2D
b-begrenset HPV16 E7aa49-57 peptid, RAHYNIVTF ble syntetisert ved Macromolecular Resources (Denver, Colorado) ved en renhet på ≥80%. FITC eller PE-konjugert anti-mus CD4 (klon RM4-5) og CD8a (klon 53.6.7), og FITC-konjugert anti-muse IFN-γ (klon XMG1.2) antistoffer ble innkjøpt fra BD Pharmingen (San Diego, CA). PE-konjugert, HPV16 E7aa49-57 peptid lastet H2-D
b tetramers ble hentet fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer Tetramer Facility. Medroksyprogesteronacetat ble kjøpt fra Greens LLC (Peapack, NJ), og 4% Nonoxynol-9 (N-9) ble kjøpt fra Revive personlige produkter selskap (Madison, NJ). Cisplatin, Tween-40, og mannitol ble anskaffet fra Sigma (St. Louis, MO).
Cellene
HPV-16 E6 og E7-uttrykkende TC-1-celler ble samlet som tidligere beskrevet [ ,,,0],36]. CT26 kolon karsinom celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellene ble holdt i RPMI-medium supplert med 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). 293TT-celler ble dyrket i DMEM medium inneholdende 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% FBS [37].
Vaksine og formulering
TA-CIN har blitt beskrevet tidligere, og ble vennlig levert av Cancer Research Technology, UK [15]. GPI-0100 ble sjenerøst gitt av Hawaii Biotech Inc. (Aiea, HI). For vaksinasjonsstudier, TA-CIN (31,25 mg /ml) ble formulert med GPI-0100 (250 ug /ml), alene eller sammen med enten Tween-40 (4 mg /mL) eller mannitol (50,7 mg /ml) i 0,025 M natriumfosfatbuffer (pH 7,2). For å fremstille vaksine for intra-tumoral injeksjon, TA-CIN (312,5 ug /ml) ble formulert med GPI-0100 (2500 ug /ml) sammen med mannitol (50,7 mg /ml) i 0,025 M natriumfosfatbuffer (pH 7,2). Det formulerte vaksinen ble inkubert natten over i en slak risteapparat ved 4 ° C før bruk. Den frosne formuleringen av TA-CIN /GPI-0100 inkludert mannitol, og etter inkubasjon over natten, ble det delt opp i aliquoter og nedfryses ved hjelp av tørris /isopropanol. Alikvotene ble deretter lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Fremstilling av HPV16 og HPV58 pseudovirus og nøytralisering assay
Pseudoviruses (PSV) ble fremstilt ved ko-transfeksjon av 293TT celler [37] [38] med plasmider som koder for HPV-L1 og L2 og reporter plasmid som uttrykker enten utskilt alkalisk fosfatase (SEAP) eller ildflueluciferase [39], [40]. SEAP-baserte pseudovirus nøytraliserings-analyser ble utført som tidligere beskrevet [38]. Kort sagt ble HPV16 SEAP PSV inkubert med titrert musesera (som starter fortynning 1:50) eller 4 pl av positiv kontroll monoklonalt antistoff RG-1 (1,1 mg /ml) i 2 timer ved 37 ° C før tilsetning til 293TT celler. Cellene ble deretter inkubert i 72 timer, og supernatantene ble samlet. SEAP-aktivitet ble målt ved hjelp av via den kolorimetriske analysemetoden. Serum nøytralisering titre ble definert som den høyeste fortynning som resulterte i minst 50% reduksjon av SEAP aktivitet sammenlignet med virus bare infeksjonskontroll.
Intracellulær cytokin farging og flowcytometri analyse
For å oppdage HPV16 E6 eller E7-spesifikke CD8
+ T-celleresponser hos IFN-γ intracellulær farging ble splenocyttene stimulert med enten HPV16 E6aa50-57 eller E7aa49-57 peptid (1 pg /ml) ved tilstedeværelse av GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego , CA) ved 37 ° C over natten. For å detektere TA-CIN-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celle responser, ble splenocyttene stimulert med 10 ug /ml av TA-CIN-proteinet i 24 timer ved 37 ° C. GolgiPlug ble deretter tilsatt til cellene og videre inkubert over natten ved 37 ° C. Når CT26 celler transfektert med HPV16 L2 ble anvendt, ble CT26 celler først transfektert med plasmid som koder for kodon-optimalisert HPV16 L2 [41] ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Splenocytter ble deretter ko-dyrket med HPV16 L2 transfektert CT26 celler med E:T forhold på 10:01 ved tilstedeværelse av GolgiPlug ved 37 ° C over natten. De stimulerte splenocytter ble deretter vasket en gang med PBS inneholdende 0,5% BSA og farget enten med PE-konjugert anti-mus-CD4 eller CD8-antistoff. Celler ble permeabilized og festes med Cytofix /Cytoperm kit i henhold til produsentens instruksjoner (BD Pharmingen, San Diego, California). Intracellulær IFN-γ ble farget med FITC-konjugert-anti-rotte-IFN-γ. Flowcytometri analyse ble utført ved hjelp av FACSCalibur flowcytometer med Cellquest programvare (BD Biosciences, Mountain View, California).
Tetramer farging
For tetramer farging, PBMC fra musene ble farget med renset anti- mus CD16 /32 (Fc blokk, BD Pharmingen, San Diego, CA) først, og deretter farget med anti-mus CD8-FITC, PE-konjugert, HPV16 E7aa49-57 peptid, RAHYNIVTF lastet H2-D
b tetramer på 4 ° C. Etter vask, ble cellene farget med 7-AAD før strømningscytometri-analyse for å ekskludere døde celler. Cellene ble kjøpt med FACSCalibur flowcytometer og analysert med Cellquest programvare.
Passiv overføring av mus eller macacque sera og vaginal HPV PSV utfordring
For passiv overføring studier, grupper av kvinnelige BALB /c mus (n = 5) ble injisert med 3 mg av medroksyprogesteron subkutant fire dager før vaginal PSV utfordring. En dag før utfordring vaginal, 90 ul av sera fra hver kontroll eller TA-CIN vaksinert BALB /c-mus ble slått sammen i sine respektive grupper, med en ytterligere 150 ul PBS (totalt volum 600 ul). Som en positiv kontroll ble mus monoklonalt antistoff RG-1 benyttes i tre separate doses- Internett (50 ug /mus), middels (25 ug /mus) og lav (12,5 ug /mus). Deretter ble 100 ul av den respektive sammenslåtte sera eller RG-1 doser ble deretter injisert i.p. inn i hver mus av den respektive gruppe. Ved 24 timer etter passiv overføring, ble vaginal utfordring med HPV PSV utført som beskrevet tidligere [42] med -10
8 viral genomisk tilsvarende (VGE) enheter /mus. Tre dager etter at HPV PSV utfordring, ble uttrykket av luciferase i vaginal hvelv kjøpt med en Xenogen IVIS 100 (Sylinder Life Science, Hopkinton MA) imager og analysert med Leve Bilde 2.5 software. De samme trinnene ble utført for passiv overføring studier med sera fra 3 makaker (indre diameter 746, 811 eller 831) enten før eller etter tredje vaksinasjon med TA-CIN + GPI-0100 generert i en tidligere studie [16]. 100 ul pre-immun sera (fortynning = 1:200, basert på mus blodvolum estimat av 2 ml) eller vaksinert sera ble titrert med en fortynning rekke 1:200-1:2000 ble passivt overført i.p. i grupper på naive mus (n = 5). Dagen etter ble musene utfordret intravaginalt med HPV58 PSV og avbildes 72 timer etterpå for å vurdere smittsomhet.
Behandling studier av hematogeneosuly spredt TC-1 tumorceller
C57BL /6 mus ble injisert med 5 × 10
4 av TC-1 celler intravenøst. For å teste antitumoreffekt indusert ved vaksinering, 3 dager senere ble musene vaksinert tre ganger med den angitte regime. Når det ubehandlede mus viste tegn på sykdom (se etikk setning), ble alle musene avlivet, og miltceller ble fremstilt for å detektere HPV16 E6 eller E7 eller TA-CIN-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celleresponser. Lungene ble høstet for å kontrollere tumorvekst. Alternativt, ble PBMC og sera samlet opp fra musene for analyse av HPV16-E7-spesifikke CD8
+ T-celleresponser med tetramer flekker eller HPV16-spesifikke nøytraliserende antistofftiter med HPV16-SEAP PSV respektivt.
Behandling studier av subkutan TC-en svulst
1 × 10
5 av TC-1 tumorceller ble injisert subkutant i C57BL /6 mus. På dag 5 og 12 etter tumorcelle-utfordring, ble musene injisert med 5 mg /kg av cisplatin eller saltoppløsning intraperitonealt. En dag etter cisplatin eller saltvann injeksjon, ble musene igjen enten ubehandlet eller vaksinert med bare GPI-0100, eller TA-CIN bare, eller TA-CIN pluss GPI-0100 intratumorally. En gruppe av cisplatin behandlede mus ble vaksinert med TA-CIN pluss GPI-0100 intramuskulært. Et volum på 200 ul ble anvendt for alle vaksinasjonsstudier unntatt 20 ul for intratumor vaksinasjon. Musene ble forsterket to ganger med det samme regime. Tumorvekst ble overvåket ved visuell inspeksjon og måling av tumordiameter med calipers to ganger hver uke. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen [største diameter x (vinkelrett diameter)
2] x π /6. Tumor overlevelse ble registrert som enten naturlig død eller en svulst diameter større enn 2 cm.
Statistisk analyse
cellemediert immunitet data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Sammenligninger mellom grupper utnyttes Student
t
test. Overlevelses distribusjoner for mus i forskjellige grupper ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med den log-rank test. For passive overføringseksperimenter, ble dataene uttrykt som gjennomsnittlig prosent infeksjon ± standardfeil (SE). En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Mangfold justering ble ikke vurdert på grunn av utforskende karakter av dataanalyse.
Resultater
GPI-0100 forbedrer HPV16 E7 spesifikke CD8 + T celle responser og tumorterapi indusert av TA-CIN
Vi har tidligere vist at formuleringen av TA-CIN med GPI-0100 i stor grad forbedrer både HPV16 spesifikke nøytraliserende serum antistofftiter og E7-spesifikke CD8 + T-celle responser til subkutan vaksinering av naive mus [16]. For å teste om ulike grupper av GPI-0100 og TA-CIN kan generere lignende data, vaksinert vi naive C57BL /6 mus med to forskjellige cGMP grupper av TA-CIN (0847FP og 0861FP) formulert med tre forskjellige cGMP grupper av GPI-0100 ( 0400806, 0400306R og 0400106R) subkutant. Ingen signifikant forskjell ble observert for både HPV16-spesifikke nøytraliserende antistofftiter og E6 /E7-spesifikke CD8 + T-celleresponser (data ikke vist). Siden vaksinering rute potensielt kan påvirke immunresponsen, vi også sammenlignet immunogenisiteten av TA-CIN formulert med GPI-0100 som ble gitt av enten subkutant (subkutant) eller intramuskulær injeksjon (i.m.). Ingen signifikant forskjell ble observert for enten HPV16-spesifikke nøytraliserende serum antistoff-titer eller E6 /E7-spesifikke CD8 + T-celleresponser (S1 fig.).
I vårt tidligere studium, vaksinering med TA-CIN formulert med GPI- 0100 helt beskyttet mus fra en etterfølgende subkutan utfordring med HPV16 E6 /E7-uttrykke TC-en tumor modell [16], men behandlingen av pre-eksisterende og metastatisk TC-en svulst ble ikke testet. Injeksjon av TC-1-celler i halevenen (i.v.) fører til sin etablering i lungene, noe som gir en modell av lungemetastatisk kreft HPV16 + [43]. Derfor ble det undersøkt hvorvidt formuleringen av TA-CIN med GPI-0100 påvirker den terapeutiske effekt mot TC-1 tumorimplantater i lungene. Den TC-1-tumorceller ble injisert i halevenen til C57BL6 mus og 3 dager senere, de tumor-bærende mus ble vaksinert subkutant med enten en lav dose (6,25 pg /mus) av TA-CIN alene eller formulert med 50 ug GPI -0100, etterfulgt av to boostere med en ukes mellomrom. Lungene ble høstet ti dager senere for å vurdere tumorvekst (Fig. 1A). Hverken vaksinasjon med TA-CIN alene eller GPI-0100 alene inhibert TC-1 tumorvekst i lungene. I motsetning til musene var vaksinert med TA-CIN formulert med GPI-0100, hadde signifikant færre lungetumorknuter og derfor en lavere lungevekt sammenlignet med uvaksinerte mus (Fig. 1 B og C og S2A fig.). Imidlertid tumorbelastning ble bare redusert, ikke fullstendig eliminert. Når HPV16 E6 /E7-spesifikke CD8 + T-celle-responser ble analysert, har vi funnet at TC-1 tumor-bærende mus vaksinert med TA-CIN formulert med GPI-0100 indusert dramatisk høyere E7-spesifikke CD8 + T-celle-responser enn enten TA-CIN eller GPI-0100 bare (fig. 1D og S2B fig.). Selv om TA-CIN inneholder også en E6 CD8 + T-celle epitop, var det bare svak E6-spesifikke CD8 + T-celle-responser observert som E7 er den dominerende antigenet i C57Bl /6-mus (fig. 1D og S2B fig.). Formulering med Tween-40 har vært foreslått for å øke adjuvanseffekt av GPI-0100 [44]. Imidlertid, i samsvar med våre tidligere funn i naive mus [16], inkluderingen av Tween-40 i TA-CIN /GPI-0100 preparat derimot ikke signifikant antitumoreffekt eller E6 /E7-spesifikke CD8 + T-celleresponser (fig. 1D og S2B fig.). Samlet utgjør disse data utvide vår tidligere funn at GPI-0100 er i stand til å betydelig forbedre immunogenisiteten av TA-CIN inkludert en E7 spesifikke CD8 + T celle respons og her viser sitt potensial for terapeutisk aktivitet mot HPV16-transformert svulst i C57BL6 mus.
A. Skjematisk illustrasjon av eksperimentet. Kort sagt ble 5~8 uke gammel kvinnelig C57BL /6 mus (10 mus /gruppe) injisert med 5 x 10
4 TC-1-celler intravenøst på dag 0. På dag 3 ble musene vaksinert med enten 6,25 ug /mus av TA-CIN, eller formulert med 50 ug av GPI-0100, eller formulert med 50 ug av GPI-0100 i 800 ug Tween-40 via subkutan injeksjon. Musene ble forsterket to ganger med det samme regime. På dag 27 ble musene avlivet for å høste lungene og milt. B. Oppsummering av antallet TC-1-metastase knuter i lungene hos hver mus (og fotografier av lungene er presentert i S2A fig.). C. Oppsummering av vekten av lungene. D. Oppsummering av flowcytometri analyse av HPV16 E6 og E7-spesifikke CD8
+ T-celleresponser analysert ved IFN-γ intracellulær farging. Dataene ble kjøpt med FACSCalibur, analysert med Cellquest og representative data er vist i S2B Fig.
Immunogenisitet av TA-CIN formulert med GPI-0100 i mannitol og frossen
For enkelhets skyld og bedre stabilitet, er det potensielt gunstig å formulere en stor gruppe med TA-CIN /GPI-0100 vaksine og delmengde det inn engangsdoser som kan fryses for langtidslagring. På grunn av sin dodecylgruppe, i GPI-0100 mer hydrofob enn sin
Quillaja
saponin forløper og unngåelse av høye ionestyrke buffere og formulering i 5% (isotonisk) mannitol er fordelaktig. Derfor formulerte vi TA-CIN med GPI-0100 ved å blande det over natten i 5% mannitol løsning. Doser ble frosset og lagret ved -80 ° C inntil det er behov for administrering. For å teste om en enkelt fryse /tine syklus påvirker immunrespons, vi vaksinert naive BALB /c mus med enten fersk formulert TA-CIN /GPI-0100, eller TA-CIN formulert med GPI-0100 i 5% mannitol og frosset til – 80 ° C for lagring inntil bruk. Musene ble forsterket to ganger som vist på fig. 2A. To uker etter siste vaksinering ble splenocyttene og sera høstet for å detektere HPV16-spesifikke T-celler responser (fig. 2B-D, S3A og C Fig.) Og nøytraliserende antistoff (fig. 2E) respektivt. Vaksinasjon med TA-CIN /GPI-0100 induserte en nøytraliserende antistoffrespons mot HPV16, mens TA-CIN alene eller GPI-0100 ikke utløse en påvisbar (titer ≥50) nøytraliserende antistoffrespons mot HPV16 (Fig. 2E). Med hensyn til cellulær immunitet, vaksinering med TA-CIN alene var i stand til å generere både TA-CIN-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celleresponser (fig. 2B-D, S3A og C fig.). Men formulere TA-CIN med GPI-0100 kraftig forbedret begge disse T-celle responser, særlig TA-CIN-spesifikke CD4
+ T-celle responser ved 7-fold (Fig. 2B, S3A og C Fig.). Dette CD4
+ T-cellerespons i det minste delvis L2-spesifikk siden HPV16 L2, men ikke narretransfekterte, CT26 celler var i stand til å aktivere CD4
+ T-celler av de vaksinerte mus for å produsere IFN-γ (fig. 2C, S3b fig.). Vi har også undersøkt om det er CD4 + T-cellerespons mot HPV16 E7 ved bruk av et peptid som inneholder en tidligere rapportert CD4 T-celle-epitop [45] og fant ingen påvisbar respons (S4 fig.). Viktigere, mus vaksinert med TA-CIN formulert med GPI-0100 i mannitol-løsning og lagret ved -80 ° C ble generert lignende TA-CIN-spesifikke CD4
+, CD8
+ T-celle og HPV16-spesifikke nøytraliserende antistoffresponser til nylig formulert TA-CIN med GPI-0100 (fig. 2). Disse data tyder på at TA-CIN formulert med GPI-0100 in mannitol-løsning kan fryses og lagres ved -80 ° C i en lengre periode (potens ble beholdt etter 11 måneders lagring er den lengste tid testet til dato), uten å kompromittere dens immunogenisitet .
A. Skjematisk illustrasjon av den eksperimentelle protokollen. I korthet 5~8 uker gamle hunn BALB /c-mus (5 mus /gruppe) vaksinert subkutant med enten 6,25 ug /mus av TA-CIN, eller formulert med 50 ug av GPI-0100, eller formulert med 50 ug av GPI-0100 på 50,7 mg /ml av mannitol og underkastet en enkelt fryse /tine-syklus. Musene ble forsterket to ganger med samme regime med to ukers intervall. To uker etter siste vaksinasjon, ble sera og splenocytter høstet. B. Sammenfatning av strømningscytometrisk analyse av TA-CIN-spesifikke CD4
+ T-celleresponser analysert ved IFN-γ intracellulær farging (og representative data er vist i S3A fig.). C. Sammenfatning av flowcytometri analyse undersøker HPV16-spesifikke CD4
+ T-celle-responser indusert av TA-CIN formulert med GPI-0100 i mannitol og frosset /tint en gang. Splenocytter ble høstet etter vaksinasjon og stimulert med enten TA-CIN eller HPV16 L2 transfektert CT26 celler (og representative data er vist i S3b fig.). D. Oppsummering av flowcytometri analyse av TA-CIN-spesifikke CD8
+ T-celleresponser analysert ved IFN-γ intracellulær farging. Dataene ble kjøpt med FACSCalibur og analysert med Cellquest (og representative data er vist i S3C fig.). E. Oppsummering av HPV16 L2-spesifikke nøytraliserende antistofftiter analysert med HPV16-SEAP pseudovirus nøytralisasjonsanalyse.
For ytterligere å teste om den frosne formuleringen beholder immunogenisitet etter en enkelt fryse /tine syklus, C57BL /6 mus med TC-1 tumor i lungene ble administrert enten TA-CIN ferskt formulert med GPI-0100 eller TA-CIN formulert med GPI-0100 i mannitol-løsning, lagret ved -80 ° C og tint like før bruk. Musene ble forsterket to ganger som vist på fig. 3A, og 4 dager etter siste vaksinering, lunger og splenocytter ble høstet for å påvise tumorvekst og T-celleresponser. Som vist på fig. 3B, C og S5a fig.), Mus behandlet med GPI-0100 alene hemmet ikke TC-1 tumorvekst, og mus vaksinert med TA-CIN alene viste en svak antitumoreffekt sammenlignet med ubehandlede mus. I motsetning til mus vaksinert med TA-CIN /GPI-0100 i stor grad hemmet tumorvekst sammenlignet med TA-CIN eller GPI-0100 alene behandlede mus, og responsen var lik i de ferske og frosne /tinte formuleringer. Neste vi analyserte CD8
+ T-cellerespons mot HPV16 E6 /E7 fremkalt ved vaksinasjon (Fig. 4A og S5b Fig.). Ingen av gruppene viste betydelige E6-spesifikke CD8
+ T-celle responser. TA-CIN vaksinert mus generert svake E7 spesifikke CD8
+ T-celle responser (0,074 ± 0,065% sammenlignet med 0,013 ± 0,008% i ubehandlet og 0,027 ± 0,024% av GPI-0100 behandlet). I motsetning til dette, mus vaksinert med fersk formulert TA-CIN /GPI-0100 generert 25 ganger mer (1,888 ± 1,679%, p = 0,003) og frosset formulering generert 27 ganger mer (2,049 ± 2,078%, p = 0,008) E7- spesifikk CD8
+ T-celler. E7 spesifikke CD8
+ T-celler som genereres av fersk eller frossen formulering av TA-CIN /GPI-0100 var sammenlignbare (p = 0,851).
A. Skjematisk illustrasjon av den eksperimentelle protokollen. Kort sagt ble 5~8 uker gammel kvinnelig C57BL /6 mus (10 mus /gruppe) injisert med 5 x 10
4 TC-1-celler intravenøst på dag 0. På dag 3 ble musene vaksinert s.c. med enten 6,25 ug /mus av TA-CIN, eller formulert med 50 ug av GPI-0100, eller formulert med 50 ug av GPI-0100 i 50,7 mg /ml av mannitol og frosset /tint en gang. Som vist på fig. Som vist på fig.
