Abstract
Galectin-3 (Gal-3), en 31 kDa medlem av familien av beta-galactoside- bindende proteiner, har vært implisert i progresjonen av forskjellige humane kreftformer. Men den foreslåtte roller variere mye, alt fra tumor-fremme cellefunksjoner og negativ innvirkning på pasientens prognose til kreftundertrykkende egenskaper og positiv prognostisk effekt. Vi og andre har tidligere identifisert Gal-3 som overuttrykt i bukspyttkjertelkreft, sammenlignet med kronisk pankreatitt og pankreatisk normalt vev. Hensikten med denne studien var således den omfattende analyse av mulige cellulære funksjoner av Gal-3 etter forbigående så vel som stabil stanse eller overekspresjon av Gal-3 i et panel på 6 veletablerte bukspyttkjertelcancercellelinjer. Våre resultater bekrefter at galectin-3 er oppregulert på mRNA-nivå i bukspyttkjertelkreft og sterkt uttrykt i de fleste bukspyttkjertelkreft cellelinjer. I enkelte cellelinjer, forbigående knockdown av Gal-3 ekspresjon resulterte i moderat inhiberende virkninger på proliferasjon, migrering eller forankrings-uavhengig vekst av cellene, men disse effektene ikke var konsistent over hele spekteret av analyserte cellelinjer. Videre funksjonelle effekter av modulering av Gal-tre uttrykk ble ikke observert i stabile knockdown eller overekspresjon tilnærminger
in vitro Hotell og forandret ikke vekstegenskaper av nakne mus xenografttumorer
in vivo
. Våre data dermed ikke støtte for direkte funksjonell rolle Gal-3 i ondartet transformasjon av bukspyttkjertelen epitelceller, selv om parakrine eller systemiske effekter av Gal-tre uttrykk ikke er utelukket
Citation. Hann A, Gruner A Chen Y, Gress TM, Buchholz M (2011) omfattende analyse av Cellular Galectin-3 avslører noen konsistent onkogene funksjon i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE seks (6): e20859. doi: 10,1371 /journal.pone.0020859
Redaktør: Iris Schrijver, Stanford University School of Medicine, USA
mottatt: 15 april 2011; Godkjent: 10 mai 2011; Publisert: 16 juni 2011
Copyright: © 2011 Hann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert delvis av det tyske føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF) innenfor rammen av NGFN program for medisinsk genomforskning (Paca-Net, prosjekt-ID PKB-01GS08) samt EU FP6 tilskuddet LSHB-CT-2006- 018771 (Integrated Project «MolDiag-Paca»). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom, den vanligste formen av kreft i bukspyttkjertelen, har en samlet 5-års overlevelse på mindre enn 5%. Over 80% av pasientene stede på et avansert stadium av sykdommen uten mulighet for potensiell kurativ tumorreseksjon [1], [2]. Selv om kjemoterapi kombinert med en små-molekyl-inhibitor rettet mot EGF-reseptor signal har nylig blitt vist å resultere i en moderat, men betydelig økning i overlevelse ved lokalt avansert eller metastatiske tumorer, forblir prognose sturen, med median overlevelse som ikke overstiger 6,2 måneder [3] . Dermed er nye diagnostiske og terapeutiske tilnærminger som forbedrer resultatet presserende behov.
Familien til beta galaktosid bindende proteiner (Galectins) består av 14 medlemmer i pattedyr. Et fellestrekk som skiller Galectins fra andre lektiner er deres karbohydrat-anerkjennelse domene. Galectin-3 (Gal-3), 31 kDa medlem av denne familien har blitt knyttet til en rekke tumorer, om enn med vidt forskjellige roller [4]. Gal-3-overekspresjon i kreftvev har vært assosiert med en dårlig prognose i forskjellige krefttyper, inkludert hepatocellulært karsinom [5], [6], klarcellekarsinom nyrekarsinom [7], [8] og blærekreft [9]. Omvendt, redusert Gal-3 ekspresjon i tumorvev sammenlignet med normalt vev ble rapportert i eggstokk-kreft [10], uterin adenokarsinom [11], brystkreft [12], [13] og cervikal neoplasi [14]. I tykktarmskreft, har rapporter vært motstridende. Enkelte forfattere beskriver en positiv assosiasjon av høye nivåer av Gal-3 ekspresjon med avanserte stadier tumor og dårlig prognose [15] – [17], mens andre korrelerer redusert ekspresjon av Gal-3 med dårlig prognose [18] – [20]. I magekreft, Okada et al rapporterte at redusert Gal-tre uttrykk korrelert med lymfeknutemetastase og avansert tumor stadium [21], mens to andre gruppene identifiserte økt uttrykk av Gal-3 i magekreft, men fant ikke en sammenheng med histopatologisk differensiering eller tumorprogresjon [22], [23].
til tross for motstridende resultater om en mulig prognostisk rolle Gal-tre uttrykk, har noen rapporter beskrevet kreftfremmende funksjoner av Gal-3 i tumorcellelinjer
in vitro
. Knockdown av Gal-tre resulterte i redusert cellemigrasjon og cellevekst i prostatakreftceller [24], forbedret apoptoseinduksjon i magekreftceller [25], og hemmet
in vitro
kolonidannelse samt naken mus xenograft induksjon i brystkreftceller [26]. Vi og andre har tidligere vist at Gal-3 er konsekvent overuttrykt i bukspyttkjertelkreft, sammenlignet med både kronisk pankreatitt og normal bukspyttkjertel [27] – [30]. Men undersøkelser i en mulig funksjonell rolle Gal-tre uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler har ikke blitt rapportert. Hensikten med denne studien var derfor å eksperimentelt evaluere effektene av overekspresjon eller knockdown av Gal-3 i et omfattende sett av bukspyttkjertelkreft cellelinjer (Patu 8988s, Patu 8988t, S2-007, S2-028, IMIM-PC-en og MIA PACA-2). Funksjonelle analyser inkludert analyser for celle levedyktighet, apoptose, proliferasjon, migrasjon og forankringsuavhengig vekst samt tumorvekst i en xenograft mus modell. Bortsett fra isolerte effekter i enkelte cellelinjer, modulering av Gal-tre uttrykk hadde ingen konsistent effekt på kreftrelevante kjennetegn ved kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Det menneskelig vev og cellelinjer
Den menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje IMIM-PC-en [31] ble vennlig levert av FX Fast (Insitute Municipale de Investigacion Medica, Barcelona, Spania). S2-028 og S2-007 [32] var fra T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). MIA PACA-2 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, RMD, USA). Patu 8988t og Patu 8988s ble vennlig levert av H.P. Elsässer (Institut für Klinische Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps Universität, Marburg, Tyskland). Alle cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte minimalt essensielt medium (GIBCO, Invitrogen Corp., NY, USA) supplert med 10% FCS (GIBCO, Invitrogen Corp., NY, USA) og Gentamicin 0,045 mg /ml (GIBCO, Invitrogen Corp. , NY, USA).
Etikk erklæringen
Kirurgisk reseksjon bukspyttkjertelen adenokarsinom og kronisk pankreatitt vev ble gitt av kirurgiske avdelinger ved universitetene i Ulm og Homburg /Saar. Normale bukspyttkjertel prøver ble innhentet fra friske områder ved grensen til kronisk pankreatitt resectates. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før du bruker vevsprøver. Studien ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Ulm, Tyskland (Ethikkommission der Universitaet Ulm) samt etisk komité ved Universitetet i Homburg /Saar, Tyskland (Ethikkommission der Universitaet Homburg).
Transfeksjon av cellelinjer
Liten interfering RNA (siRNA) ble transfektert inn i Patu 8988s, S2-007 og S2-028 celler ved hjelp siLentFect Lipid Reagens (Bio-Rad, München, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. SiRNA transfeksjon inn MIA PACA-2-celler ble utført ved hjelp Transmessenger reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) og IMIM-PC-en celler ble transfektert med X-tremeGENE siRNA Transfeksjon Reagens (Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoller, henholdsvis. De Gal-3-spesifikke sirnas var: Sigal-3-1, Hs_LGALS3_1 FlexiTube siRNA SI00470036 og Sigal-3-2, Hs_LGALS3_2 FlexiTube siRNA SI00470043 (Qiagen). Silencer negativ kontroll fra Ambion ble brukt som ikke-tie kontroll.
Gal-3 ekspresjonsvektor ble konstruert ved å klone PCR-forsterket Gal-tre åpne leserammen inn i pcDNA V3.2 /V5 dest vektor hjelp Gateway rekombinasjon kloning teknologi (Invitrogen Livet Technologies, Karlsruhe, Tyskland). Etter transfeksjon av Patu 8988t celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen), seleksjon av stabilt transfekterte cellekloner ble utført ved tilsetning av 800 ug /ml G418 til kulturmediet.
A Gal-3-spesifikk shRNA ekspresjonskonstruksjon i pGIPZ vektoren ble kjøpt fra Open Biosystems, Huntsville, AL, USA (kat. # RHS4430-99137619). Ikke-tie shRNAmir (kat. # RHS4348, Open Biosystems) ble anvendt som den negative kontroll. Stabil transfeksjon av de S2-007-celler ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Stabilt transfekterte kloner ble utvalgt ved tilsetning av hygromycin (400 ug /ml) til kulturmediet.
RNA ekstraksjon og QRT-PCR
RNA fra cellelinjer ble ekstrahert ved bruk av peqGold Total RNA Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Tyskland) ifølge produsentens protokoll. Massetumor vevsprøver ble homogenisert på tørris /flytende nitrogen ved anvendelse av en morter og pistill. RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. Første-tråd cDNA ble syntetisert fra 1 ug total RNA ved hjelp av Omniscript RT Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. Kvantitativ sanntids-PCR (QRT-PCR) ble utført ved anvendelse av SYBR grønn MasterMix (Applied Biosystems, Wellesley, MA, USA) og spesifikke primerpar konstruert med PrimerExpresss program (Applied Biosystems). Følgende primerpar ble anvendt for QRT-PCR: ribosomalt protein, store, P0 (RPLP0) VS: 5′-TGGGCAAGAACACCATGATG-3 «; rev. 5»-AGTTTCTCCAGAGCTGGGTTGT-3 «; Galectin-3 fwd: 5»-AGAGGGAATGATGTTGCCTTCC-3 «; rev:. ACAATGACTCTCCTGTTGTTCTCATT-3 «
subcellulære fraksjonering og immunoblotting
subcellulære fraksjonering ble utført som beskrevet tidligere [33]. I korthet ble cellene vasket to ganger med iskald PBS og samlet ved sentrifugering ved 1,600 r.p.m. ved 4 ° C. Lysatene ble deretter resuspendert i buffer A (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT; proteinaseinhibitorer) i 15 minutter og deretter sentrifugert i 20 minutter ved 3.600 r.p.m. Supernatantene ble overført til nye kopper og sentrifugert ved 14 000 rpm for ytterligere 4 min. Pellets ble resuspendert i 30-100 ml buffer C (20 mM Hepes pH 7,9, 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT; proteinaseinhibitorer) og inkubert på is i 30 min. En siste sentrifugeringstrinn på 14.000 rpm i 10 min ble utført for å separere nukleære proteiner fra cellerester. For Western blotting, ble de resulterende kjerneproteinekstrakter elektroforese gjennom en 7,5% SDS-polyakrylamidgel og overført til PVDF Immobilon-P-membran (Millipore, Billerica, MA, USA) som tidligere beskrevet [34]. Membraner ble analysert med enten anti-Gal-3 (mus monoklonalt, kat. # A3A12, Abcam, Cambridge, UK), anti-ORC2 (polyklonale kanin, katt. # 559266, BD Biosciences), anti-PARP (kanin polyklonale, katt . # 9542, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), eller anti-β-aktin (mus monoklonalt, kat. # A1978, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) antistoffer, vasket i TBS vaskebuffer og inkubert med peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Forbedret kjemiluminescensreaksjon system (Roche) ble anvendt for visualisering.
MTT cellenes levedyktighet assay
Celler ble sådd på nytt 24 timer etter transfeksjon inn i 3,9 cm
2 retter på 60 000 til 100 000 celler /brønn . Etter ytterligere 24 timer eller 48 timer av dyrking ble mediet erstattet av MTT-holdige medium (tiazolyl blå, Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) og retter ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. MTT-inneholdende medium ble erstattet med oppløsnings oppløsning (10% Triton X-100 (Carl Roth), 0,1 molar saltsyre (Fisher Scientific, Schwerte, Tyskland) ble oppløst i isopropanol (Sigma-Aldrich)) og ekstinksjon målt ved 570 nm. 48 h-verdiene ble dividert med 24 timer verdier for å korrigere for mulige variasjoner i antall celler sådd.
BrdU celleproliferasjonsanalyse
DNA replikasjon som et direkte mål på mitotisk aktivitet ble målt ved hjelp av Cell spredning ELISA, BrdU chemiluminescence Kit (Sigma) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble 5000 til 10 000 celler sådd på nytt 24 timer etter transfeksjon inn i en 96 brønners plater μClear (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland). BrdU inneholdende medium ble tilsatt til 4 eller 6 timer. Etter fjerning av BrdU inneholdende medium, ble cellene fiksert i 1 time og deretter inkubert med peroksidase-konjugert anti-BrdU-antistoff i 1,5 timer. Den kjemiluminescensreaksjon ble målt i relative lette enheter per sekund (RLU /s).
Trail indusert apoptose
For å extrinsically indusere apoptose i Patu 8988s celler, ble 300.000 celler sådd i 9,6 cm
2 kulturskåler og behandlet med Trail protein (R D Systems, Minneapolis, MN). i en dose på 25 ng /ml i 24 timer
Cell migrasjon analysen
Modifisert Boyden kammer analyser ble utført ved reseeding 20 000 til 40 000 celler resuspendert i serumfritt medium i Transwell innsatser med en porestørrelse på 8 um (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Innskudd ble suspendert i 24well plater fylt med medium supplert med 1% FCS. Celler ble tillatt å migrere mot den nedre flate av membranen for 2 eller 4 timer ved 37 ° C. Ikke-migrerte celler ble fjernet fra innsiden av innsatsene ved hjelp av bomullspinner. Migrerte celler ble farget ved å senke membranene i 0,2% krystallfiolett som er oppløst i 20% metanol i 10 min. Migrerte celler ble telt ved hjelp av lys mikroskopi ved en forstørrelse på 10 ×.
Myke agar analyser
For å vurdere potensialet for forankringsuavhengig vekst, myke agar analysene ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],35]. I korte trekk, 1 × 10
4 celler per 9,6 cm
2 cellekultur fatet ble sådd i DMEM /0,33% Bacto-agar ut mot et bunnlag av DMEM /0,5% Bacto-agar. Krings-uavhengig vekst ble målt etter 7 dagers inkubering ved å telle antallet levedyktige kolonier.
naken mus xenograft
NMRI-
nu /nu mus
ble formert og opprettholdt i en patogen-fri omgivelser. Kvinnelige 6-8 uker gamle mus ble benyttet i forsøkene. For å generere xenotransplantater, 10
6-tumorceller i 0,1 ml serumfritt DMEM ble injisert subcuntaneously inn i flankene av musene. Tre uker etter inokulering, ble musene avlivet, tumorene ble eksplantert og tumorstørrelsene ble bestemt. Den ene halvdelen av hver tumor ble lagret i 2% formaldehyd og innstøpt i parafin for histologisk og immunhistokjemisk undersøkelse. Den andre halvparten ble hurtigfrosset i flytende nitrogen for RNA og protein isolasjon.
Resultater
Overuttrykte Gal-3 i bukspyttkjertelkreft
I forrige high-innhold microarray analyser, vi har identifisert Gal-3 som en av de genene overuttrykt i microdissected kreft i bukspyttkjertelen vev [28]. For å bekrefte disse resultatene, utførte vi kvantitativ Realtime PCR (QRT-PCR) på et sett av vevsprøver inkludert 10 kreft i bukspyttkjertelen, 5 kronisk pankreatitt og 5 prøver normale pankreatiske vev. Gal-3 mRNA-nivåer ble litt forhøyet i de kroniske pancreatits prøvene, og var sterkt oppregulert i de fleste kreft prøver (fig. 1A), og bekrefter mikroarray data. Etterfølgende analyse av bukspyttkjertelcancercellelinjer viste sterk ekspresjon, både på mRNA, så vel som på proteinnivået, i 5 av 6 testede cellelinjer (Fig. 1B).
Gal-3 mRNA-nivåer ble bestemt av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) (A, B). Ribosomalt protein, store, P0 (RPLP0) ble anvendt som referanse-genet. PC: kreft i bukspyttkjertelen; CP: kronisk pankreatitt; NP: normal bukspyttkjertelen. Protein ekspresjon i forskjellige bukspyttkjertelcancercellelinjer ble bestemt ved Western blot (C) analyser. β-actin ble brukt som lasting kontroll.
Expression nivå av Gal-3 har ingen innflytelse på tumorcellevekst
in vitro
For å vurdere den funksjonelle rollen av abnormt uttrykt Gal-3 i kreft i bukspyttkjertelen celler, Gal-3 ble forbigående eller stabilt overexpressed eller brakt til taushet i forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinjer og effekter analysert i ulike
in vitro
funksjonelle analyser. For transient stanse, ble to uavhengige siRNA sekvenser samt et ikke-Silencing kontroll siRNA brukt. For hver av de fem cellelinjer analysert (Patu 8988s, S2-007, S2-028, IMIM-PC-en og MIA Paca-2), ble transfeksjon reagenser og -conditions optimalisert for å oppnå knockdown effektivitet 80% (Fig. 2A).
(A) transient knockdown av Gal-3 ble utført ved transient transfeksjon av flere cellelinjer ved hjelp av to forskjellige Gal-3 spesifikke siRNA-sekvenser (Sigal-3 1 og 2) eller et ikke-tie styre siRNA (NC). (B) Stabil knockdown i S2-007 ble utført ved hjelp shRNA uttrykk konstruksjoner. Tre Gal-3 spesifikke shRNA transfekterte kloner (shGal-3 1, 2 og 3) og tre nonsilencing kontroll shRNA transfekterte kloner (SHC 1, 2 og 3) ble valgt for videre analyse. (C) Stabil overekspresjon av Gal-3 ble oppnådd ved transfeksjon av Patu 8988t celler med en Gal-3 ekspresjonsvektor (pGal-3 1, 2 og 3) eller en styrevektor (pC 1 og 2). U betegner utransfekterte celler. Totalt cellelysater ble analysert ved QRT-PCR (øvre paneler) og Western blot (nedre paneler) for Gal-tre uttrykk nivåer. Gal-3 mRNA-nivåer ble bestemt i forhold til RPLP0. Sigal-3 1 og 2 ble normalisert til NC. β-actin ble brukt som lasting kontroll for de vestlige blotter.
Stabile knockdown kloner ble generert ved hjelp S2-007 celler transfektert med shRNA sekvenser klonet i pGIPZ vektor. Tre stabilt transfekterte kloner samt tre styrevektor transfekterte kloner ble valgt for videre analyse (Fig. 2B).
Siden Patu 8988t celler viste svært lave endogene Gal-3 nivåer, ble denne cellelinje som er valgt for konstruksjonen stabil Gal-3 overekspresjon kloner. Tre uavhengige kloner ble etablert. To av disse viste moderat overekspresjon av rekombinant Gal-3 på mRNA-nivå, som var mye mer uttalt på protein-nivå (fig. 2C, baner 4, 6). De resterende klon viste ikke vesentlig ekspresjon av rekombinant Gal-3 (fig. 2C, spor 5), men var inkludert i de videre eksperimenter som ytterligere kontroll klon. Interessant, kontroll kloner transfektert med tom vektor viste også noe forhøyede Gal-3 nivåer (Fig. 2c, sporene 2, 3).
I en første funksjonell analyse, påvirkning av Gal-3 ekspresjon på cellelevedyktigheten var analysert ved MTT-analyser. Heller ikke forbigående knockdown i en hvilken som helst av de 5 testede cellelinjer, og heller ikke stabil knockdown i S2-007 celler eller stabil overekspresjon i Patu 8988t cellene hadde noen vesentlig virkning på cellelevedyktighet under vanlige kulturbetingelser sammenlignet med de passende kontrollene (fig. 3 A C).
Forbigående Gal-3 dempede cellelinjer (A), stabilt Gal-3 stilnet S2-007 cellekloner (B) eller stabilt Gal-3 overekspresjon PATU 8988t-cellekloner (C) ble dyrket i 24 og 48 timer, etterfulgt av inkubasjon med MTT reagens. 48 h verdier ble delt på 24 h verdier (for å korrigere for mulige variasjoner i antall seeded celler) og normalisert til å kontrollere siRNA transfekterte celler (NC). Verdier av stabile Gal-3 knockdown cellekloner (shGal-3 1, 2 og 3) og stabile Gal-3 overekspresjon cellekloner (pGal-3 1, 2 og 3) ble normalisert til gjennomsnittet av kontroll vektor transfektert stabile cellekloner ( SHC 1, 2, 3 og henholdsvis pC 1, 2). Data omfatter et minimum av tre uavhengige eksperimenter.
Analyse av celleproliferasjon ved bruk av BrdU-analyser viste en moderat, men signifikant inhibering av proliferativ aktivitet i S2-028 celler etter knockdown av Gal-3 (fig. 4A , panel 3). Men trenden til redusert spredning nådde ikke signifikans i Patu 8988s og S2-007 celler, var fraværende i IMIM-PC-en, og selv reversert i MIA PACA-2-celler (fig. 4A). Verken stabil knockdown i S2-007 celler, og heller ikke stabil overekspresjon av Gal-3 i Patu 8988t celler hatt vesentlig effekt på spredningen av de resulterende cellekloner.
Forbigående Gal-3 forstummet cellelinjer (A), stabilt gal-3 forstummet S2-007 celle kloner (B) eller stabilt gal-3 overekspresjon Patu 8988t celle kloner (C) ble dyrket med BrdU agent for 2 eller 4 timer. BrdU-inkorporering av prolifererende celler ble målt ved ELISA. Verdier av celler transient transfektert med forskjellige Gal-3 spesifikke sirnas (Sigal-3 1 og 2) ble normalisert for å styre siRNA transfekterte celler (NC). Verdier av stabile Gal-3 knockdown cellekloner (shGal-3 1, 2 og 3) og stabile Gal-3 overekspresjon cellekloner (pGal-3 1, 2 og 3) ble normalisert til gjennomsnittet av kontroll vektor transfektert stabile cellekloner ( SHC 1, 2, 3 og henholdsvis pC 1, 2). Data omfatter et minimum av tre uavhengige eksperimenter. * Indikerer
p
0,05 sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler (tosidig uparet
t
-test)
På samme måte transient Gal-3. knockdown hadde ingen effekt på apoptotisk aktivitet (som målt ved hjelp av PARP spaltning) av Patu 8988s celler i fravær (fig. 5, kolonnene 1-4) eller nærvær (fig. 5, kolonnene 5-8) av den ytre apoptose indus Trail. PARP-spaltning ble indusert ved transfeksjon fremgangsmåte og var mer uttalt i nærvær av Trail (fig. 5, baner 2 og 6), men ble ikke ytterligere forbedret ved knockdown av Gal-3 (fig. 5, kolonnene 3-4 og 7 -8).
celler transient transfektert med Gal-3 spesifikke sirnas (Sigal-3 1 og 2), nonsilencing kontroll siRNA (NC) eller ikke-transfekterte celler (U) ble analysert ved Western blot for poly ADP-ribose polymerase (PARP) cleavage. Øket spaltning, angitt med den forbedrede signal av det nedre band, ble observert i alle transfekterte celler. PARP cleavage ble forsterket ved behandling med den ytre apoptose indus Trail, men ble ikke påvirket av Gal-tre knockdown. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. Resultatene som vises er representative for tre individuelle eksperimenter.
Replikering av dette settet med eksperimenter under serumfrie betingelser produsert lignende resultater, ikke å påvise noen konsistent påvirkning av modulering av Gal-tre uttrykk på cellevekst eller apoptose i de testede cellelinjer (data ikke vist).
Inkonsekvent effekten av Gal-3 på cellemigrasjon
Vi ext analyserte innflytelsen av Gal-tre uttrykk på celle migrasjon i en Boyden kammer analysen. Celler som var i stand til å transmigrere gjennom et filter langs en føtalt kalveserum gradient. Antall forbigående Gal-3 forstummet migrerte celler ble normalisert til ikke-tie kontroll siRNA transfekterte celler. Forbigående knockdown av Gal-3 førte til en utvikling i retning av redusert cellemigrering i tre ut av fem analyserte cellelinjer, selv om denne effekten ikke nådde betydning i de fleste tilfeller (fig. 6A). Videre har denne effekten ble ikke gjengitt i de S2-007 cellekloner med stabil Gal-3 knockdown (fig. 6, B). I revers analogi til resultatene av de transiente knockdown eksperimenter, stabil overekspresjon av Gal-3 i Patu 8988t celler indusert en tendens til økt cellevandring (Fig. 6, C), selv om denne trenden igjen nådde ikke signifikans og var også tydelig i klon pGal-3-2, som viste lav eller ingen ekspresjon av rekombinant Gal-3 (se fig. 2C). Til sammen modulering av Gal-tre uttrykk hadde en mild og ganske inkonsekvent effekt i Boyden kammer analysene, og dermed argumentere mot en viktig rolle cellular Gal-3 i rettet migrering av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Forbigående Gal- 3 dempede cellelinjer (A), stabilt Gal-3 stilnet S2-007 cellekloner (B) eller stabilt Gal-3 overekspresjon PATU 8988t celle kloner (C) ble dyrket i Boyden-kammer innsatser for to eller fire timer. Celler migrerer gjennom porene i innsatsene langs en føtalt kalveserum gradient ble fiksert, farget metylenblått og tellet ved hjelp av lysmikroskopi. Antall migrerte celler transient transfektert med forskjellige Gal-3 spesifikk siRNA (Sigal-3 1 og 2) ble normalisert for å styre siRNA transfekterte celler (NC). Migrerte stabile Gal-3 knockdown-celler (shGal-3 1, 2 og 3) og stabile Gal-3 overekspresjon-celler (pGal-3 1, 2 og 3) ble normalisert til gjennomsnittet av kontroll vektor transfektert stabil cellekloner (SHC 1, henholdsvis 2, 3 og pC 1, 2). Data omfatter et minimum av tre uavhengige eksperimenter. * Indikerer
p
0,05 sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler (tosidig uparet
t
-test)
Hemming av Gal-tre uttrykk. svekker forankringsuavhengig vekst i en undergruppe av bukspyttkjertelkreft cellelinjer, men har ingen effekt på veksten av xenografttumorer
in vivo
potensialet for forankringsuavhengig vekst av kreftceller ble vurdert ved evaluering antall kolonier dannet i soft agar analyser. Forbigående knockdown av Gal-3 resulterte i en klar reduksjon i kolonidannelse kapasitet for cellelinjene Patu 8988s, S2-007 og IMIM-PC-en, med den sterkeste effekt og høyeste statistisk signifikans observert for S2-007 celler (Fig. 7A ). Motsatt S2-028 og MIA PACA-2 celler ble ikke påvirket av Gal-tre knockdown. Siden tidligere rapporter har antydet at tumorfremmende funksjoner av Gal-3 i andre cellesystemer, kan avhenge av den subcellulære lokalisering av proteinet [26], [36], [37], analyserte vi hvorvidt forskjellen i virkning av Gal-3-knockdown kolonidannende evne korrelert med forskjellige subcellulære lokalisering av Gal-3 i de testede cellelinjer. Gal-3 protein ble jevnt fordelt mellom kjernen og cytosol i MIA PACA-2 og S2-007 celler og ble litt overrepresentert i cytosoliske fraksjoner i Patu 8988s, S2-028 og IMIM-PC-1 celler (fig. 7b), og dermed viser ingen sammenheng med sensitivitet mot Gal-tre knockdown.
(A) Gal-3 ble forbigående stilnet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved hjelp av to uavhengige siRNA sekvenser (Sigal-3 1 og 2). Knockdown og kontroll-celler ble sådd i myk agar og kolonidannelse bedømmes etter 7 dager. Resultatene var normalisert til å kontrollere siRNA transfekterte celler (NC). Data omfatter et minimum av tre uavhengige eksperimenter. * Indikerer p 0,05 sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler (tosidig uparet
t
-test). (B) Western blot-analyse av kjerne (n) og cytoplasmatic (c) proteinfraksjoner avledet fra bukspyttkjertelcancercellelinjer. Gal-3 er vist i det øvre felt. p-aktin farging ble brukt som lasting kontroll. Farging for nukleær faktor ORC2 ble brukt for å vurdere renhet subcellulære fraksjoner. (C) xenograft tumorer ble indusert i nakne mus ved subkutan injeksjon av to stabile Gal-3 knockdown S2-007 cellekloner (shGal-3 2 og 3) og to nonsilencing kontroll shRNA transfektert S2-007 kloner (SHC 2 og 3). Seks mus per forsøksgruppe ble analysert. Box-and-whisker plott illustrere tumorvolum på dag 22 etter injeksjon. Whiskers betegne 1,5 × indre kvartilområdet (IQR). Verdier utenfor dette området er vist som fylte trekanter. (D) Gal-3 mRNA-nivåer i bulk vev av xenograft tumorer hvor bestemt ved QRT-PCR. RPLP0 ble brukt som referanse genet.
Vi har testet effekten på forankringsuavhengig vekst i S2-007 celler også oversatt til forskjeller i tumorvekst
in vivo
.
for å oppnå dette, xenograft tumorer ble indusert i nakne mus ved subkutan injeksjon av S2-007 celler med stabile Gal-3 knockdown eller kontroll vektor-transfiserte celler, respektivt. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i tumorvolum mellom Gal-3 knockdown og kontrolltumorer (Fig. 7C). Histologisk undersøkelse av svulstene også ikke avsløre noen systematiske forskjeller i differensiering, lokal invasivitet eller microvessel tetthet mellom de ulike gruppene (data ikke vist).
For å bekrefte vedvarende reduksjon av Gal-3 nivåer i knockdown tumorer, mRNA ble fremstilt fra masse tumorvev og analysert ved QRT PCR. Som forventet, Gal-3 mRNA nivåene var signifikant lavere i svulster avledet fra S2-007 knockdown kloner enn i de som stammer fra styrevektor transfekterte kloner (Fig. 7D).
Diskusjoner
Dereguleringen av Gal-3-ekspresjon er blitt beskrevet i flere humane kreftformer, selv om de prognostisk betydning av de observerte forandringer forblir en omdiskutert [37], [38]. Pankreatisk duktus adenokarsinom er blant de humane tumorer der en vesentlig overekspresjon av Gal-3 både på mRNA så vel som på proteinnivået er godt etablerte [27], [30]. Våre egne resultater fra mikromatriseanalyse av microdissected pankreatiske tumor vev indikerte at Gal-3 blir uttrykt av selve tumorcellene i stedet for av de stromale celler som typisk utgjør mesteparten av tumoren [28]. I denne studien, bekrefter vi overekspresjon av Gal-3 mRNA i tumorvev ved QRT-PCR og viser at sterk Gal-tre uttrykk beholdes i de fleste av bukspyttkjertelkreft cellelinjer
in vitro
.
Som tilfellet er med data på den prognostiske rolle i kreft, rapporterer om antatte cellulære funksjoner av Gal-3 i kreftceller er delvis ufullstendig eller til og med motstridende. Mens Honjo et al. Rapporten tap av (serum-uavhengig) proliferativ kapasitet og oppheving av forankringsuavhengig vekst i brystkreftceller følgende stanse av Gal-tre uttrykk [26], Matarrese et al. observerte ikke noen forskjell i cellevekst eller spredning ved modulering av Gal-tre uttrykk, men beskriver forbedret resistens mot apoptose etter overekspresjon av Gal-3 [36]. Likeledes er den samme gruppe som ble observert at veksthemmende virkninger av Gal-3 stanse i brystkreftceller beskrevet sterke anti-tumoreffekter av Gal-3 knockdown i prostatakreftceller, inkludert redusert cellemigrering, invasjon, celleproliferasjon, forankrings-uavhengig koloni dannelse, og tumorvekst i nakne mus xenotransplantater [24]. I motsetning til dette, Califice et al. observerte ikke noen effekt av Gal-tre uttrykk på spredning av prostata kreft celler i noen konstellasjon, og rapporterte at Matrigel invasjonen, forankringsuavhengig vekst og naken mus xenograft dannelse ble forfremmet bare av cytoplasma Gal-tre uttrykk, mens kjernefysiske lokalisering av Gal -3 hadde motsatt effekt [37].
et felles tema i mange av disse studiene er at ofte svært få eller bare en enkelt cellelinjen ble analysert, og at noen av effektene ble bare observert i henhold svært spesifikke eksperimentelle forhold. Jiang et al.
