Abstract
Bakgrunn
PI3K /AKT pathway endringer er assosiert med ufullstendig svar på chemoradiation i menneskelig livmorhalskreft. Denne studien ble utført for å teste for mutasjoner i PI3K veien og for å evaluere effekten av AKT hemmere på glukoseopptak og celle levedyktighet.
Experimental Design
mutasjonsanalyse av DNA fra 140 forbehandling tumor biopsier og 8 menneskelige livmorhalskreft cellelinjer ble utført. C33A celler (
PIK3CAR88Q Hotell og
PTENR233 *
) ble behandlet med økende konsentrasjoner av to allosteriske AKT hemmere (SC-66 og MK-2206) med eller uten glukose analog 2-deoxyglucose (2 -DG). Celleviabilitet og aktiveringsstatusen av den AKT /mTOR-reaksjonsveien ble bestemt i respons til behandlingen. Glukoseopptak ble evaluert ved inkubasjon med
18F-fluorodeoxyglucose (FDG). Cellemigrasjon ble vurdert av scratch-analysen.
Resultater
Aktivering
PIK3CA plakater (E545K, E542K) og inaktive
PTEN plakater (R233 *) mutasjoner ble identifisert i human cervical cancer. SC-66 effektivt hemmet AKT, mTOR og mTOR substrater i C33A celler. SC-66 inhiberte glukoseopptak via redusert levering av Glut1 og GLUT4 til cellemembranen. SC-66 (1 pg /ml-56%) og MK-2206 (30 uM-49%) behandling redusert cellelevedyktighet gjennom en ikke-apoptotisk mekanisme. Reduksjoner i celleviabilitet ble forsterket da AKT-hemmere ble kombinert med to-DG. Scratch analysen viste en betydelig reduksjon i cellemigrasjon på SC-66 behandling.
Konklusjoner
mutasjons spekteret av PI3K /AKT sti i livmorhalskreft er kompleks. AKT-inhibitorer effektivt blokkerer mTORC1 /2, redusere glukoseopptak, glykolyse, og redusere celleviabilitet
in vitro
. Disse resultatene tyder på at AKT hemmere kan øke responsen på chemoradiation i livmorhalskreft
Citation. Rashmi R, DeSelm C, Helms C, Bowcock A, Rogers BE, Rader J et al. (2014) AKT hemmere fremme celledød i livmorhalskreft gjennom Forstyrrelse av mTOR Signa og glukoseopptak. PLoS ONE 9 (4): e92948. doi: 10,1371 /journal.pone.0092948
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 22 august 2013; Godkjent: 27 februar 2014; Publisert: 04.04.2014
Copyright: © 2014 Rashmi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd midler fra NIH (US NIH 5K12HD00145910) til Julie K. Schwarz, MD, PhD. CD ble støttet av Forsknings Medical Student Grant (# RMS113) fra Radiological Society of North America (Julie K. Schwarz mentor). Den Siteman Cancer Center er støttet av NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på verdensbasis er livmorhalskreft den tredje vanligste kvinnelige kreft, og det rangerer fjerde i form av dødelighet [1]. Samtidig chemoradiation (bekken bestråling med samtidig administrering av cisplatin kjemoterapi) er standard på omsorg for pasienter med lokalavansert livmorhalskreft. Vi har tidligere vist at resultatene av post-terapi [
18F] fluor-deoksy-glukose-positronemisjonstomografi (FDG-PET) er prediktive for progresjon og total overlevelse utfall etter chemoradiation [2] – [4 ]. I dag er det ingen effektive behandlingstilbud tilgjengelig for pasienter med tumorer ikke klarer å svare på tradisjonell chemoradiation.
Nylig identifiserte vi PI3K /AKT pathway endringer i svulster fra pasienter med en positiv post-terapi FDG-PET. Vi har også observert høy p-AKT uttrykk i pre-behandling biopsiprøver, og pasienter med tumorer uttrykte høye nivåer av p-AKT hadde redusert overlevelse resultater og økt metastatisk sykdom etter standard chemoradiation [5]. Genetiske endringer som fører til aktivering av PI3K /AKT /mTOR-reaksjonsveien er forbundet med behandling motstand i rekke faste tumorer [6]. Flere PI3K /AKT-hemmere har blitt evaluert i kliniske studier for brystkreft og andre krefttyper med positiv respons hos pasienter med PI3K /AKT endringer [7]. Det finnes rapporter som tyder på at kreft med
PIK3CA
mutasjoner er mer følsomme for AKT eller PI3K /mTOR-hemmere [8], [9].
Vi antok at PI3K /AKT-hemmere vil øke responsen på chemoradiation i livmorsvulster med PI3K /AKT pathway endringer. For å teste for mutasjoner i PI3K /AKT vei, analyserte vi 140 forbehandling livmorhalskreft biopsier og 8 menneskelige livmorhalskreft cellelinjer [10]. Vi valgte livmorhalskreft cellelinje C33A, som er mutert for både
PIK3CA Hotell og
PTEN product: (
PIK3CA
R88Q,
PTEN
R233 *) og uttrykker høye nivåer av p-AKT ved baseline, for å vurdere responsen på to allosteriske AKT-hemmere, SC-66 og MK-2206.
Materialer og Metoder
Pasienter
studie~~POS=TRUNC inkluderte 140 pasienter prospektivt inkludert i tumor bank studier på tidspunktet for diagnosen livmorhalskreft (mars 1998 til juli 2011). Godkjenning fra institusjonelle Menneskelig Forskning Protection Office ble oppnådd for denne studien, og alle pasienter signert informert samtykke. Klinisk oppfølging inkludert FDG-PET billeddiagnostikk ble utført for hver pasient i henhold til institusjonelle retningslinjer som tidligere beskrevet [3]. På tidspunktet for siste oppfølging, 76 pasienter hadde ingen tegn på sykdom, og 8 pasienter var i live med sykdom; 7 pasienter var døde på grunn av samtidig sykdom; 2 pasienter hadde dødd på grunn av behandlingsrelatert toksisitet, og 47 pasienter var døde på grunn av livmorhalskreft. Median oppfølging av pasienter i live på tidspunktet for siste oppfølging var 41 måneder (spredning 4 til 161 måneder).
Statistisk analyse
Overlevelse og tumor tilbakefall ble målt fra avsluttet behandling. Kaplan-Meier (produkt-limit) metoden ble brukt til å utlede estimater av overlevelse [11]. Tester av likeverdighet i beregninger av overlevelse mellom pasientgrupper ble utført av generalisert Wilcoxon log-rank test. Statview versjon 5.0.1-programvaren (SAS Institute Inc., Cary, NC) ble brukt for analyse.
mutasjonsanalyse ved hjelp av MALDI-TOF
Kreft biopsier ble seksjonert og anmeldt for tumorcelleinnhold som tidligere beskrevet [5]. Tumor DNA ble fremstilt ved standardmetoder ved Washington University vev anskaffelser Kjerne Facility. Analyser for en undergruppe av 32 utvalgte onkogene mutasjoner (
akt1
,
akt2
,
PIK3CA Hotell og
PTEN
) fra [10] ble redesignet i tre genotyping signalpakker, bruker Sequenom sin analyse Designer programvare, versjon 3.1.2.2. (Sequenom Inc, San Diego, California). De signal ble designet for å bruke iPLEX kjemi. Den Sequenom MassARRAY system (https://www.sequenom.com) syssels MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser desorpsjon /ionisering – Time of Flight) massespektrometri for å måle masse forskjeller følgende single-basen tillegg til forlengelse primere. Spektrale topper tilsvarende forventet massene for hver utvidet primer er forvandlet til prøven genotype samtaler. Bruke standard iPLEX protokollen, Genotyping kjernen ved Washington University (St. Louis, Missouri, USA) behandlet 15 ng prøve-DNA per multiplex gjennom MassARRAY system. Topparealer som representerer normale og mutante basis tilsetninger ble oppnådd fra hver prøve masse-spektrum. En mutasjon ble betraktet som er til stede i en prøve når den mutante toppen var ansvarlig for 25% eller mer av de kombinerte topparealene, og fraværende når det mutante topparealet var mindre enn 25% av totalen. Liste over OncoMap mutasjoner som ble testet i våre signalpakker er OM_00970-akt1-E17K, OM_00032-akt2-S302G, OM_00033-akt2-R371H, OM_00241-PIK3CA-R88Q, OM_00242-PIK3CA-N345K, OM_00243-PIK3CA-C420R, OM_00246A-PIK3CA -E545K, OM_00248-PIK3CA-H701P, OM_00249-PIK3CA-H1047L, OM_00250A-PIK3CA-H1047R, OM_00250B-PIK3CA-H1047R, OM_00251-PIK3CA-H1047Y, OM_01017-PIK3CA-E545A, OM_01018B-PIK3CA-N1068fs*4,OM_0102-PIK3CA-Y1021C,OM_00839-PTEN-R173C,OM_00840-PTEN-R173H,OM_00841-PTEN-R233*,OM_00842-PTEN-R335*, OM_01038-PTEN-K267fs * 9 OM_01039-PTEN-V317fs * 3, OM_01069-PTEN-K6fs * 4.
Cell kultur og reagenser
livmorhalskreft cellelinjer ble opprettholdt i IMDM media (Livet Technologies, CA) med 10% varmeinaktivert FBS og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO
2. SC-66 ble kjøpt fra Biovision (Milpitas, CA) og MK-2206 fra Selleck Chemicals (Houston, Texas). 2-deoksy glukose, protease og fosfatase hemmer cocktails ble kjøpt fra Sigma (Saint Louis, MO). Alle medikamenter for cellekultur ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma). siRNA oligos mot
akt1
,
akt2 Hotell og
RICTOR
ble kjøpt fra Sigma (Saint Louis, MO).
Western blotting og membran isolasjon
Fosforylering av AKT og nedstrøms mål for AKT og mTOR vei med eller uten SC-66 (6-10 ug /ml) og MK-2206 (0-2,5 mm) ble bestemt ved western blotting med primære antistoffer mot fosforylert og totale former mTOR, p70s6k, 4E-BP1, S6, gsk3-beta, FOXO Pakt
Thr308, Pakt
Thr450 og Pakt
Ser473 (1:1000, Cell Signaling Technology, MA), totalt former AKT, mTOR og 4-EBP1 (1:1000, Cell Signaling Technology, MA), totalt former p70s6k og β-Actin HRP fra Santa Cruz Biotechnology, CA og totale former for PRAS40 og FOXO fra Millipore (1:5000, Santa Cruz Bioteknologi, CA). p-aktin ble benyttet som intern kontroll. Blottene ble probet med HRP-konjugert anti-kanin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) eller anti-mus polyklonalt IgG sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, California) i 1 time ved RT. For påvisning Pierce West Dura substrat (Pierce Biotechnology) ble brukt i henhold til produsentens protokoll og eksponert på røntgenfilm.
Celleviabilitet og Annexin flekker
For celleviabilitet analyse C33A celler ble behandlet med allosterisk AKT-inhibitorer SC-66 (0.0001 ug /ml-5 ug /ml) og MK-2206 (125 nM-30 uM), med eller uten glukose analoge 2-deoksyglukose (2-DG) (5-20 mM) bruker dosetitrering og tid kurs. For siRNA eksperimenter ble C33A celler transient transfektert og vurderes for protein uttrykk etter 48 timer. Celleviabilitet ble testet ved hjelp av Alamar blå fra Life Technologies, i henhold til produsentens instruksjoner. Annexin /7-AAD farging ble utført 24 timer etter behandling, ved hjelp av et kit fra BD, Biosciences følge produsentens instruksjoner, og cellene ble analysert ved flowcytometri.
FDG opptak analyser
FDG opptaksanalyse ble utført som beskrevet tidligere [5]. I korthet ble cellene sådd og forbehandlet med blokken (Cytochalasin B) i 30 minutter etterfulgt av AKT-inhibitorer i ytterligere 30 min. Etter dette,
18FDG ble tilsatt til glukose fritt medium i 1 time. Cellene ble vasket, høstet og tellet på en gamma-teller.
Immunofluorescence
I et kammer sleiden (8-brønn) 25000 celler ble sådd og behandlet med SC-66 1 ug /ml for tre h og festes med 4% p-formaldehyd fra elektronmikros Sciences (Hatfield, PA) i 10 minutter. Platene ble deretter blokkert i 5% normalt geiteserum (Jackson ImmumoResearch, West Grove, PA) i 1 time, etterfulgt av omfattende PBS-vaskinger. Deretter primære antistoffer Glut1 og GLUT4 (Abcam, Cambridge, MA) ble tilsatt fulgt av sekundær antistoff konjugert med Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York). Glassene ble endelig montert ved hjelp Forleng Gold anti-fade (Life Technologies, Inc. Grand Island, NY).
Stoffskifte analyser
Laktat-analysen ble utført ved hjelp av en kit fra (Sigma, Saint Louis , MO) i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av kulturmedier samlet inn etter deproteinisering bruke 10 kDa spin kolonne filtre. ATP og NADP /NADPH analysene ble utført ved hjelp av de kommersielt tilgjengelige fluorometriske kits fra (Abcam, Cambridge, MA) i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av cellelysatene.
Sårtilheling analysen
En million C33A celler ble belagt i en 35 mm vev kultur tallerken og vokst til samløpet. To parallelle riper ble foretatt med en 200 ul pipettespiss pr fatet og det ripe bredde ble målt til å være referanse [12]. Såret bredde ble målt ved et minimum av seks forskjellige punkter for hvert sår. SC-66 (1 og 2,5 ug /ml) og MK-2206 (2,5 og 5 uM) ble tilsatt i 24 timer. Bredden av riper ble målt ved anvendelse Qcapture Pro programvare og vises ved hjelp av OLYMPUS 1 x 70 mikroskop. Prosent leging av sår ble beregnet ved å dividere bunnen bredde etter medikament tilsetning av styre bredde minus 100%. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SEM.
Resultater
PI3K /AKT /mTOR veien er aktiv i livmorhalskreft cellelinjer
Et panel av menneskelige livmorhalskreft cellelinjer ble testet for ekspresjon mønster og aktiveringsstatusen til PI3K /AKT /mTOR spredningsveier molekyler. Cellelysater ble utarbeidet uten behandling og baseline vestlige blotter ble utført. P70S6K, markør for aktivering av mTOR vei, ble fosforylert i flertallet av cellelinjer med unntak av HeLa, C41 og C33A hvor den ble funnet å være svakt fosforylert (Fig. 1A). Fosforylering av 4E-BP1 og S6 ble funnet å være lav i de fleste cellelinjene studert. I Siha og SW756, uttrykket nivåer av ikke-fosforylerte former av mTOR, p70s6k, 4E-BP1 og S6 var lave sammenlignet med de andre cellelinjer. På den annen side ble fosforylering av mTOR funnet å være lik på tvers av cellelinjer (Fig. 1A). Baseline uttrykk for fosforylerte formene for AKT som Ser473, Thr308 og Thr450 ble bestemt. C33A uttrykte alle tre former for p-AKT. For å avgjøre statusen til oppstrøms regulatorer av AKT som PI3K og PTEN, baseline p-PI3K og p-PTEN nivåer ble undersøkt. Fosforylert PTEN nivå var lik på tvers av cellelinjene, bortsett C33A der nivået av total PTEN båndet var minimal. PI3K ble aktivert i de fleste cellelinjer undersøkt her. Siha oppviste meget lav PI3K-aktivering (Fig. 1B). Alle disse resultatene tyder på at livmorhalskreftcellelinjer har aktivert mTOR pathway henhold basale forhold og store variasjoner eksistert i p-AKT nivåer.
(A-B) mTOR pathway komponenter og fosforylerte formene for AKT ble testet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig antistoffer på åtte livmorhalskreft cellelysatene forberedt uten behandling. (C)
PIK3CA
,
AKT
, og
PTEN
genet mutasjonsstatus av 8 menneskelige livmorhalskreft cellelinjer.
Sequenom mutasjonsanalyse av PIK3CA, PTEN og AKT gener i livmorhalskreft
for å teste for mutasjoner i PI3K /AKT vei, gjennomførte vi en Sequenom mutasjonsanalyse for onkogene mutasjoner i genene
PIK3CA
,
PTEN Hotell og
AKT
. Vi gjorde ikke oppdage eventuelle
akt1
eller
akt2
mutasjoner i livmorhalskreft cellelinjer. C33A næret en R88Q
PIK3CA
mutasjon. R88Q er en aktiverende mutasjon funnet i ABD domenet til p110α subenhet av
PIK3CA
genet. Denne feilen er assosiert med øket enzymatisk aktivering av PI3K protein og AKT-aktivitet
in vitro product: [13], [14]. Vi fant ut at E545K
PIK3CA
mutasjonen var til stede i ME-180 og CaSki celler (Fig. 1C).
PIK3CA
E545K mutasjon er en aktiverende mutasjon i spiral domenet p110α subenheten av PI3K protein. Denne mutasjonen er kjent for å gi forbedret kinase-aktivitet og til konstitutivt aktivere AKT [15]. Vi har også funnet en R173C
PTEN
genmutasjon i CaSki og en
PTEN
R233 * mutasjon i C33A celler (Fig. 1C).
PTEN
R173C mutasjon er assosiert med redusert fosfatase aktivitet mot PIP
3 [16].
PTEN
R233 * mutasjon i ekson 7 induserer en tidlig stopp kodon i genet, noe som forklarer fraværet av
PTEN
protein uttrykk i C33A celler [17] (Fig. 1B).
Bruke Sequenom analysen, vi deretter testet for mutasjoner i
PIK3CA
,
AKT Hotell og
PTEN
gener i 140 forbehandling biopsier samlet på vår svulst bank. Vi gjorde ikke oppdage eventuelle analysert mutasjon i
AKT
genet i vår pasientpopulasjon. Vi fant at svulster i 7 av 140 pasienter næret en
PIK3CA
E545K mutasjon og en av 140 hadde en
PIK3CA
E542K mutasjon. Vi fant også at en svulst næret en
PTEN
R233 * mutasjon. Pasienter med E545K og E542K mutasjoner i
PIK3CA
ble funnet å vise dårlig prognose og kortere sykdomsfri overlevelse etter standard chemoradiation (stråling av bekkenet og samtidig cisplatin kjemoterapi) (p = 0,05, fig. 2).
Kaplan Meier kurve for progresjonsfri overlevelse for livmorhalskreftpasienter med villtype PIK3CA versus E545K eller E542K mutante svulster (p = 0,05).
AKT hemmere SC-66 og MK-2206 indusere ikke-apoptotisk celledød i PIK3CA og PTEN mutant C33A celler
Ved hjelp C33A celler som en modell for PI3K /AKT mutant livmorhalskreft, vi avgjort om svulst celle overlevelse var avhengig av AKT signalering. C33A-celler ble inkubert med økende doser av SC-66 og MK-2206 og levedyktigheten ble bestemt etter 24 og 48 timer. Cellenes levedyktighet ble redusert fra 1 ug /ml SC-66 etter 24 og 48 timer, til 55% og 43% henholdsvis. Levedyktigheten ved 5 ug /ml SC-66 ble funnet å være 15% etter (3a Fig.) 24 timer. C33A celler var også følsom for en annen allosterisk AKT inhibitor, MK-2206. Cellelevedyktigheten ble funnet å avta fra og med den konsentrasjon på 15 pM (58%) og avtagende til 2% ved 48 timer (fig. 3B). For å bekrefte at innvirkning på celleviabilitet skyldtes AKT hemming snarere enn utenfor mål effekter av SC-66 og MK-2206, ble siRNA eksperimenter utført. Som vist i figur 3C, redusert C33A cellelevedyktigheten til en tilsvarende grad når cellene ble transfektert med sirnas resulterer i knockdown av
akt1
,
akt2
, og
RICTOR plakater (fig . 3D).
(A-B) C33A celler ble sådd på 48 brønners plater og behandlet med økende doser av SC-66 (0,0001 til 5 ug /ml) og MK-2206 (1.25-30 pM ) i tre paralleller i 24 og 48 timer. Levedyktigheten ble målt ved anvendelse av Alamar blå. Prosent levedyktighet ble beregnet på grunnlag av bærerbehandlede kontroller. (C) C33A celler ble sådd på 48 brønners plater og transfektert med oligos mot
akt1
,
akt2 Hotell og
RICTOR Hotell og behandlet med SC-66 (1 mikrogram /ml) og MK-2206 (20 uM) i tre paralleller til 24. Levedyktigheten ble målt ved anvendelse av Alamar blå. Prosent levedyktighet ble beregnet på grunnlag av kjøretøy behandlet kontroller og kontroll siRNA transfekterte kontroller, p 0,001 for sammenligning av kontroll siRNA versus siRNA for
akt1
,
akt2 Hotell og
RICTOR
SC-661 mikrogram /ml, MK-2206 20 mikrometer. (D) C33A celler ble sådd på 48 brønners plater og transfektert med oligos mot
akt1
,
akt2 Hotell og
RICTOR Hotell og lysatene ble utarbeidet etter 48 timer og vestlige blotter Var fremført. (E) C33A-celler ble behandlet med SC-66 (2,5 ug /ml) og MK-2206 25 uM i 24 timer og deretter farget med Annexin /7-AAD og analysert ved strømningscytometri. Grafen representerer% celleviabilitet. (F) C33A celler ble behandlet med SC-66 (0,0001 mg /ml-0,1 mikrogram /ml) med eller uten 20 mM 2-DG i 48 timer.
For å utforske mekanisme som AKT hemmere induserer celledød, utførte vi Annexin /7-AAD farging. Ved SC-66 (2,5 ug /ml) og MK-2206 (25 uM) behandling var det svært få celler med Annexin bare flekker og fraksjonen av celler med begge farging var 35% og mindre enn 20%, respektivt. 7-AAD bare farging var nær 80% i MK-2206 behandlede celler (fig. 3E). For å ytterligere kobling effekter av SC-66 gjennom glukoseopptak hemming, kombinert vi SC-66 med 2-deoksy glukose (2-DG), en kompetitiv hemmer av glukoseopptak. Ved 48 timer etter behandling med SC-66 (0,01 ug /ml) levedyktighet var på 107%, men med tilsetning av 2-DG, redusert cellelevedyktigheten til 72% p 0,001 (Fig. 3F). MK-2206 utstilt synergieffekter med 2-DG. Etter 24 timer levedyktigheten til MK-2206 behandlede cellene var 78% som reduseres opp til 40% etter tilsetning av 20 mM 2-DG (p 0,001, Data A i File S1).
SC-66 og MK-2206 hemmet mTOR /AKT sti effektivt i C33A celler
for å utforske effekten av AKT hemming på mTOR og nedstrøms mål i C33A celler, vi undersøkte fosforylering status av mTOR pathway komponenter av Western blot og brukt p70S6K som en markør for mTOR aktivering [18]. SC-66 inhiberte fullstendig p70S6K fosforylering etter 3 timer (fig. 4A). MK-2206 inhibert p70S6K-aktivering, men det var liten reaktivering av 4 timer. MK-2206 hemmet mTOR sti komponenter som mTOR, 4E-BP1 og S6 effektivt av 2 timer. MK-2206 hemming av mTOR vei synes å være forbigående som p70s6k var fortsatt aktiv etter 4 h (data D i File S3). SC-66 og MK-2206 effektivt hemmet alle de tre fosforylerte formene for AKT (Thr308, Thr450 og Ser 473) på en doseavhengig måte som tyder på at MK-2206 virker primært gjennom mTORC1 (fig. 4C og Data F i File S3). Dette støttes av den observasjon at SC-66 var mer effektive i å hemme AKT underlag som PRAS 40, særlig PRAS40 som er GSK3p-β og FOXO1 (Fig. 4B) sammenlignet med MK-2206 i mTORC1 komplekset [19] (Data E i File S3). P70S6K ble fosforylert etter 4 timer av MK-2206 behandling antyder at mTOR-reaksjonsveien hemning var forbigående (supplerende data).
(A-C) C33A-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av SC-66 (6-10 ug /ml) i 3 timer og lysatene ble forberedt for western blot.
Rapamycin, en mTOR-hemmer, lindrer tilbakemeldinger hemninger og induserer AKT Ser473 fosforylering i en mTORC2 avhengig måte som fører til ytterligere AKT aktivering [20 ]. For å teste for denne effekten ved hjelp av våre hemmere vi utført en lengre inkubasjon av cellene med SC-66 for 18-24 timer. Vi fant ut at p70S6K, markør av mTOR aktivisering, ble redusert selv etter 18 og 24 timer behandling. SC-66 behandling redusert aktivering av AKT substrater, Thr308 og Thr450 by18 og 24 timer. Thr308 nivåer gikk opp i forhold til 3 timer prøven, men viste likevel en nedadgående trend på 18-24 h (data ikke vist). Alle disse resultatene tyder på at SC-66 effektivt inhiberte både mTORC1 /2 og AKT. MK-2206 ble funnet å være handler hovedsakelig gjennom mTORC1 vei med liten reaktivering av veien etter 4 timer.
SC-66 hemmet glukoseopptak og membran translokasjon av glukosetransportører
glukoseopptak ble testet ved å utføre
in vitro
FDG-opptaksforsøk i nærvær og fravær av SC-66 (35 ug /ml). Vi fant ut at SC-66 hemmet glukoseopptak betydelig som gjenspeiles av reduserte tellinger per minutt (Fig. 5A). Videre bestemmes vi effekten av SC-66 på Glut1 og GLUT4 translokasjon til membranen. For dette en membran cytoplasma fraksjonering ble utført etter behandling av celler med SC-66 (5 ug /ml) i 24 timer. SC-66 inhiberte Glut1 og GLUT4 translokasjon fra cytoplasma til membranen som bestemt ved Western blot (Fig. 5C). Vi har bekreftet dette med immunofluorescerende farging (fig. 5D). Alle disse resultatene tyder på at mTOR inhibering av SC-66 resulterte i redusert glukoseopptak gjennom Glut1 og GLUT4 retensjon i cytoplasmaet.
A) C33A celler ble behandlet med SC-66 (35 ug /ml) eller blokk (cytokalasin B) i 30 minutter før inkuberingen med
18F-fluorodeoxyglucose som beskrevet i metodedelen. Grafen representerer tellinger per minutt verdier, p 0,01 for sammenligningen av FDG alene (celler kun) versus FDG + SC-66. B) C33A-celler ble behandlet med SC-66 (0-5 ug /ml) i 3 og 24 timer og Glut1 nivåene ble analysert ved hjelp av western blot. C) C33A-celler ble behandlet med SC-66 (0, 1 og 5 ug /ml) i 24 timer. Membran og cytosolfraksjonen ble utarbeidet med en kit (MemPER) fra Peirce bioteknologi. Disse subcellulære fraksjoner ble deretter blandet med prøvebuffer og inkubert ved 65 ° C i 20 minutter før lasting på gelene for western blot for Glut1 og GLUT4. D) Immunofluorescens ble utført på C33A celler etter å behandle dem med SC-66 (1 pg /ml) i 3 timer i et kammer lysbilde.
AKT-inhibitor SC-66 inhiberer glykolyse
For å finne ut om AKT hemming resulterte i redusert glykolyse, vi målte ATP og NADPH nivåer etter SC-66 behandling. Vi fant at ATP-nivåer ble betydelig redusert etter SC-66 behandling, og NADPH nivåene ble øket, noe som tyder på at alternative reaksjonsveier for glukosemetabolismen, slik som pentosen fosfat shunt, kan være mer aktiv i C33A cellene når AKT-signalering blir undertrykt (fig. 6A og 6B). Totale laktatnivåer ble også redusert i C33A-celler etter behandling med SC-66 (Fig. 6C og 6D). Alle disse resultatene tyder på at hemming av AKT undertrykker glykolyse i C33A celler. For å evaluere for nedstrøms effekter på tumorcelle metabolisme, overvåket vi aktiveringsstatusen til et substrat av AKT, ATP-citrate lyase (ACL) etter SC-66 behandling. C33A-celler ble inkubert med økende doser av SC-66 og Western blot ble utført. SC-66 inhiberte ACL fosforylering etter 5 og 24 timer, noe som tyder på at inhibering av AKT kan også påvirke andre aspekter av tumorcellemetabolisme, inkludert lipid syntese (fig. 6E).
(A-B) C33A cellene seedet i T 25 cm
2 vevsdyrkingskolber, behandlet med SC-66 og intracellulære NADPH nivåer og ATP ble bestemt. Grafen representerer ATP og NADPH uM nivåer basert på standardkurven, s 0,01 for sammenligningen av kontroll versus SC-66 10 pg /ml 1 og 3 timer og p 0,001 for kontroll versus 30 ug /ml for ATP-nivåer; p 0,01 for sammenligningen av kontroll versus SC-66 5 ug /ml i 3 timer og p 0,01 versus kontroll 10 ug /ml i 3 timer for NADPH nivåer. (C-D) C33A celler ble sådd i T 25 cm
2 vevsdyrkingskolber, behandlet med SC-66 og utskilles laktatnivåer ble målt i nM konsentrasjoner ved anvendelse av en standardkurve, s 0,001 for sammenlikning av kontroll versus SC -66 5 and10 mikrogram /ml. (E) C33A-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av SC-66 (0-5 ug /ml) i 5 timer og 24 timer og lysater ble fremstilt for western blot.
SC-66 reduserer migrering av C33A celler in vitro
det er rapporter som viser hvilken rolle AKT i metastatisk prosess inkludert celle migrasjon og invasjon [21]. For å studere effekter av SC-66 og MK-2206 på cellemigrasjon vi behandlet celler med en mikrogram /ml SC-66 og 2,5 mikrometer MK-2206 i 24 timer og utført en ripe analysen. Vi fant ut at SC-66 hemmet migrasjon av celler ca 50% sammenlignet med kontrollgruppen, mens MK-2206 ikke har noen effekt (Fig. 7).
C33A celler ble behandlet med A) SC-66 (1 og 2,5 ug /ml) og B) MK-2206 (2,5 og 5 uM) i 24 timer. Prosent sårheling ble beregnet som beskrevet i avsnitt metoder, p 0,0001 for sammenligning av kontroll versus en ug SC-66 og p 0,0001 for kontroll versus 2,5 ug SC-66
Diskusjoner
i denne studien utførte vi mutasjonsanalyse av 140 forbehandling tumor biopsier og 8 menneskelige livmorhalskreft cellelinjer for å screene for mutasjoner i PI3K /AKT veien. Dette er den første studien, til vår kunnskap, omfattende analysere mutasjoner i PI3K /AKT sti i menneskelig livmorhalskreft. Vi identifiserte flere mutasjoner i PI3K /AKT sti i menneskelige livmorhalskreft prøver, inkludert aktive mutasjoner i
PIK3CA plakater (E545K, E542K) og inaktivere mutasjoner i
PTEN plakater (R233 *). Mutasjonsanalyse av livmorhalskreft cellelinjer avdekket flere mangler. C33A celler har både en R233 *
PTEN
mutasjon og en R88Q
PIK3CA
mutasjon [22].
Denne studien ble også designet for å teste hypotesen om at livmorhalskreftceller med endret AKT aktivering ville være følsomt for AKT-inhibitorer. SC-66 og MK-2206 effektivt indusert celledød i C33A celler gjennom en ikke-apoptotisk mekanisme. SC-66 ble funnet å være en potent mTORC1 /2 inhibitor. SC-66 effektivt hemmet p70s6k og 4E-BP1 mTORC1 substrater, i tillegg til å inhibere Ser473 og Thr308 fosforylering av AKT, og aktivering av AKT substrater såsom PRAS40, GSK3-β og FOXO. SC-66 vises synergieffekter med 2-DG, og SC-66 hemmes videre nedstrøms arrangementer som translokasjon av glukosetransportører til membranen som resulterte i redusert glukoseopptak. I tillegg, hemming av AKT redusert glykolyse som dokumentert av redusert ATP og laktatnivåer, og økt aktivitet av alternative metabolske veier som fører til økt celle NADPH. Disse resultatene tyder på at AKT-inhibitorer redusere livmorhalskreft levedyktighet ved å interferere med cellulær glukosemetabolismen. Vi hypotese at livmorhalskreft med PI3K /AKT pathway endringer er avhengig av høy forekomst av glukoseopptak og glykolyse for å overleve. Det bør legges merke til at aktiveringen av Akt ved
PTEN
tap og /eller
PIK3CA
mutasjoner ville omgå behovet for aktivering av vekstfaktor-reseptorer (dvs. IGF-1R) for å initiere den PI3K /Akt /mTOR signalkaskade. På denne måte, livmorhalskreft-celler er i stand til å oppregulere glukose import og metabolisme selv i fravær av de passende eksterne signaler.
Tidligere er det blitt vist at inhibering av mTORC2 fører til rask hemming av AKT Ser473 fosforylering, hvilken akselererer destabilisering prosessen med Thr308 nettstedet fosforylering [23]. I tråd med dette har vi også observert at SC-66 mediert en samtidig reduksjon i fosforylering av Ser473 og Thr308 i C33A celler. Tidligere arbeid fra andre foreslått at defosforylering av AKT ved Thr308 stedet fører til dypere hemming av AKT funksjon enn det som ville bli sett fra defosforylering av AKT ved Ser473 alene [23]. Thr308 er en rest i en nøkkel T-løkken av AKT-proteinet og betraktes som en bedre indikator for AKT-kinase-aktivitet. Det er uoverensstemmende data på Ser473 fosforylering og AKT-kinase-aktivitet [24], [25]. Våre resultater viser at SC-66 hemmer alle de tre fosforylerte formene for AKT.
Det er rapporter om at mTORC2 er nødvendig for utvikling av visse kreftformer med
PTEN
tap [26]. C33A celler er
PTEN
defekt, og vi fant ut at SC-66 er en potent mTORC2 inhibitor.
PTEN
R233 * mutasjonen funnet i C33A celler kan føre til større intracellulær akkumulering av PIP
3 som resulterer i forbedret PI3K signalering og PDK-1-mediert AKT Thr308 fosforylering [25], [27], [ ,,,0],28]. Vi spekulere at SC-66 utøver sin hemmende virkning på AKT Thr308 fosforylering indirekte ved å virke som en PDK-1-inhibitor. SC-66 kan ikke være så effektiv som en inhibitor for PDK-1 som det er for mTOR og AKT, og dette forklarer de litt høyere Thr308 nivåer observert etter lengre inkubasjon. Videre observerte vi at SC-66 er en potent celledød induser av 24 timer, og dermed reaktivering av AKT kan ikke være et problem
in vivo
. I samsvar med dette begrepet, har vi funnet at i mus behandlet med en kombinasjon av cisplatin og SC-66, ble alle p-AKT former hemmet sammenlignet med monoterapi motstykker.
