Abstract
Oral kreft er den fjerde vanligste årsaken til død av kreft i taiwanske menn. Indirubin-3′-monoxime (I3M), en potent cyklin-avhengig kinase inhibitor, har terapeutiske virkninger i andre kreftceller. I denne studien gjennomførte vi
in vitro
analyser for å teste celle levedyktighet, cellecyklusprogresjonen, apoptose, cellemigrasjon og invasjonen i denne krefttypen. I tillegg bruker en muntlig tumorigent dyremodell, undersøkte vi target gen og protein uttrykk ved hjelp sanntid qPCR, immunoblotting og immunhistokjemisk farging. Våre resultater viser at I3M har en anti-proliferativ effekt i begge Cal-27 og HSC-3 orale kreftcellelinjer, og at behandling av Cal-27 og HSC-3-celler med I3M resulterer i apoptose gjennom aktivering av cytokrom
c
. Dessuten avbryter I3M cellesyklus i Cal-27-celler på en doseavhengig måte ved å stanse celler i G2 /M-fasen. Vi fant også at I3M undertrykker migrasjon og invasjon i Cal-27 celler ved å hemme uttrykk for fokal vedheft kinase, urokinase-type plasminogen hemmer, og matriksmetalloproteinase 9. Videre identifiserte vi Survivin som et mål protein i I3M behandlet orale kreftceller . Ved anvendelse av en oral cancer musemodell, viser vi at topisk påføring av et klebemiddel gel bestående av I3M og poly (vinylalkohol) (I3M /PVA) har doseavhengig antitumorigen effekter. Etter behandling, ble ekspresjonen av Survivin protein og mRNA nedregulert i cancervev. Videre plasma Survivin nivåer ble også redusert i I3M-behandlede mus. Disse resultatene tyder på at lokal applikasjon av I3M, et stoff syntetisert fra indirubin, som finnes i Qing-Dai – har terapeutisk potensiale for behandling av kreft i munnhulen
Citation: Lo WY, Chang NW (2013) En Indirubin Derivative. undertrykker Indirubin-3′-Monoxime Oral Cancer tumorigenesis gjennom nedregulering av survivin. PLoS ONE åtte (8): e70198. doi: 10,1371 /journal.pone.0070198
Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: May 1, 2013, Godkjent: 16 juni 2013; Publisert: 13 august 2013
Copyright: © 2013 Lo, Chang. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne vil også gjerne takke The National Science Council (NSC96-2320-B-039-024, NSC 97-2320-B-039-016-My3), The Taiwan Department of Health, Kina universitetssykehus Cancer Research Center of Excellence ( DOH102-TD-C-111-005) og Kina universitetssykehus (DMR-96-043) for å støtte dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) står for ca 90% av muntlige malignitet. Omtrent 274 000 nye tilfeller diagnostisert årlig over hele verden, og til tross for bedre diagnostiske og terapeutiske metoder, pasienter kun har en 50% overlevelse over 5 år [1]. Rom, betel-pund tygge, alkoholbruk, og snusprodukter utgjør de største risikofaktorene for kreft i munnhulen. Nåværende behandlingsalternativer for oral cancer omfatter kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, selv om 5-års overlevelse for kreft i munnhulen er fortsatt en av de laveste blant vanlige ondartede svulster [2]. Oral kreft er den sjette vanligste kreftformen i Taiwan og den fjerde vanligste årsaken til død av kreft blant taiwanske menn siden 2006 [3]. Derfor identifisering av nye midler og nye mål for behandling av kreft i munnhulen for å forbedre kliniske behandlingen av denne sykdommen.
Danggui Long Hui Wan er et sammensatt fra tradisjonell kinesisk medisin som brukes til å behandle kronisk myelocytic leukemi [4], og den aktive bestanddel synes å være Qing Dai (
indigo Natur
), som inneholder høye nivåer av indigo fargestoff. Videre har anti-leukemic aktivitet av denne ingrediensen vært knyttet til den rød-farget indigo isomer indirubin. Indirubin og dets derivater sterkt å hemme veksten av forskjellige humane kreftceller, i hovedsak gjennom cellesyklus-stans (i G2 /M fase eller G1), etterfulgt av apoptose [5], [6]. Det er blitt fastslått at indirubin derivater er kraftige inhibitorer av cyclin-avhengige kinaser (CDK), glykogensyntasekinase-3β [7], c-Src-kinase og STAT3 signale [8], [9]. Mens indirubin selv har dårlig oppløselighet, en lav absorpsjon rate, og betydelig gastrointestinal toksisitet, syntetisk indirubin-3′-monoxime (I3M) har bedre farmakologiske egenskaper og redusert toksisitet. Videre, sammenlignet med indirubin, inhiberer I3M mange flere proteinkinaser, så vel som STAT3 signalisering, og det har vist seg å ha anti-proliferative effekter i vaskulære glatte muskelceller [10] – [12]. Nylig har Indirubin-3′-oksim er også blitt rapportert induserer mitokondriell dysfunksjon og utløser veksthemming og cellesyklusarrest i humane neuroblastom-celler [13]. Derfor er I3M ansett som en av de mest potente indirubin derivater for behandling av kreft.
Survivin er en kritisk determinant for celleoverlevelse, og den fungerer både ved regulering av celledeling og inhibering av apoptose [14]. Som medlem av den hemmer av apoptose (IAP) familie av proteiner, ble Survivin opprinnelig karakterisert som en fysisk caspase-hemmer, og gir en cytoprotective skritt nedstrøms død reseptor og mitokondrie apoptose [15]. Imidlertid er det nå kjent at X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) er den eneste virkelige fysiologiske hemmeren av caspaser 3, 7, 9 og [16]. Til tross for en mangel på strukturelle motiver som medierer caspase-binding, kan Survivin hemme aktiv caspase 9 gjennom samarbeid med hepatitt B-virus X-veksel protein [17]. Videre foreningen av survivin med XIAP fører til en synergistisk hemming av caspase 9 aktivisering [18]. Mange studier har vist at Survivin er overuttrykt i forskjellige humane kreftformer, og er assosiert med dårlig prognose samlet [19]. Nærmere bestemt er Survivin uttrykk korrelert med dårlig prognose og chemoresistance i oral cancer [20] – [22]. Videre hemming av survivin i forskjellige hode og nakke kreft øker betydelig anti-tumorigen aktiviteter flere cytotoksiske og målrettet terapi [23].
Bygge på tidligere studier, ønsket vi å studere rollen av survivin med hensyn til I3M behandling i munnhulen. I denne studien viser vi at I3M har flere anti-tumorigen aktivitet, og at det kan inhibere celleformering, migrering og invasjon, mens på samme tid å fremme apoptose, i orale kreftceller. Ved hjelp av immunoblotting og real-time qPCR analyse fant vi at survivin uttrykket ble nedregulert i kreftcellelinje Cal-27 etter I3M behandling, identifisere Survivin som en potensiell formidler av de anti-tumorigen aktiviteter I3M. Til slutt, bekreftet vi at I3M hemmer Survivin uttrykk og viser anti-tumorigen aktivitet i en muntlig tumorigenesis musemodell. Våre resultater tyder på at I3M undertrykker oral cancer tumorigenesis ved å formidle aktiviteten til survivin.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Den protokollen som brukes for den eksperimentelle mus ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i Kina Medical University (IACUC godkjenning nr. CMU-99-26-N). Alle dyrestudier ble gjennomført i henhold til institusjonelle retningslinjer (Affidavit av Godkjenning av Animal Bruk Protocol, nr 98-33-N) godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) i Kina Medical University (Taichung, Taiwan).
Reagenser og cellekultur
Indirubin, I3M, dimetylsulfoksyd (DMSO), tiazolyl blå tetrazolium-bromid (MTT), trypanblått, triton X-100, og penicillin /streptomycin ble kjøpt fra Sigma Chemical ( St. Louis, MO, USA).
den menneskelige munnhulekreft cellelinje Cal-27 og cellelinjen HSC-3 ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC), Food Industry Research and Development Institute (FIRDI) (Hsinchu, Taiwan). Celler ble sådd ut i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco) og DME /F-12 (Gibco) supplementert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin, 100 ng /ml streptomycin, og 1% glutamin ved 37 ° C [24 ], [25].
MTT analyse
Celleproliferering ble vurdert ved hjelp av en MTT analyse. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved en konsentrasjon på 1000 celler /brønn. Seks brønner ble analysert for hver eksperimentell behandling. Etter at cellene ble behandlet med 0, 5, eller 10 uM indirubin eller I3M (oppløst i 0,1% DMSO) i 0, 24 eller 48 timer, 20 ul av MTT-reagens (5 mg /ml; Sigma) ble tilsatt til hver brønn , og cellene ble deretter inkubert i 3 timer. Reaksjonen ble stopper ved å fjerne MTT reagens. DMSO (150 ul) ble deretter tilsatt til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Absorbansen ble målt ved 570 nm. Effektene ble også vurdert ved celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Alle målinger ble utført i triplikat.
Fremstilling av subcellulære fraksjoner og immunblotting av cytokrom c
Celler ble sådd ut i 10-cm skåler og behandlet med variabel dose I3M i 24 timer. Etter inkubering ble cellene høstet, resuspendert i celleekstrakt-buffer (20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 1 mM ditiotreitol), som inneholdt 250 mM sukrose, og protease-inhibitor-blanding (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) og homogenisert. Homogenatene ble sentrifugert to ganger ved 1000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne kjerner og ubrutte celler. Supernatantene ble deretter sentrifugert ved 10.000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatantene fra de 10.000 x
g
spinn er referert til som «cytosoliske fraksjonen». De cytosoliske proteinprøver (30 g) ble separert på 12% SDS-PAGE-geler og immunolabeled med anti-cytokrom
c product: (1:1000) og anti-β-aktin (1:1000) primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Den andre pepperrot peroksidase-merket antistoff ble inkubert med blottene, fulgt av vasking. Kjemiluminescerende signaler ble oppdaget ved hjelp SuperSignal West femto kjemiluminescerende substrat (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner.
De mitokondrielle pellets fra den første 10 000 ×
g
spin ble resuspendert i celleekstrakt buffer som inneholder 250 mM sukrose å beskytte mitokondriene etter 20 slag med en homogenisator. Homogenatene ble sentrifugert ved 750 x
g
for 3 x 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne rusk og kjerner. Supernatanten ble deretter sentrifugert ved 15.000 x
g
i 20 min; pelleten, som inneholdt «mitokondriene fraksjon», ble lysert i SDS-lyseringsbuffer; og 30 ug av mitokondrielle proteiner ble underkastet immunoblotanalyse som beskrivelsene ovenfor.
Annexin V /PI farging
Cal-27 celler (10
5) ble sådd i hver brønn av en 6-brønners plate og behandlet med enten DMSO eller 10 uM I3M i 24 timer. Den Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Strong Biotech Corporation, Taiwan) ble anvendt for å bestemme andelen av apoptotiske celler. Kort sagt ble de høstede cellene ble vasket med PBS og sentrifugert ved 200 x
g
i 5 min. Cellepelletene ble resuspendert i farging buffer og farget med annexin V-FITC og PI i 15 min ved 25 ° C i henhold til produsentens instruksjoner. De celleprøver farget ved hjelp av disse reagenser kan deles inn i tre populasjoner: apoptotiske celler (merket med grønn fluorescens), døde celler (merket med rødt eller gul fluorescens som følge av en kombinasjon av rød og grønn fluorescens), og levende celler (som viser liten eller ingen fluorescens). Cellene ble analysert ved hjelp av en Tali ™ bilde cytometer (Invitrogen). Tali ™ Bilde cytometeret fanger 20 bilder av en farget prøve, automatisk analyserer bilder med digital bildebasert celletelling og fluorescens-algoritmer, og viser en nøyaktig kvantitativ analyse av levende, døde, og apoptotiske celle populasjoner. Alle målinger ble utført in triplo.
cellesyklusanalyse
Cal-27 celler ble behandlet med 0, 2,5, 5, eller 10 uM I3M, og etter 24 timer ble cellene vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS). Cellene ble fiksert over natten med kald 70% etanol og deretter farget med en syklus PI oppløsning bestående av 2 mg /100 ml PBS CAT PI, 1 x PBS, 10 mg /ml RNase A, og 5% Triton X-100. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i mørke, ble et FACScan flow-cytometer brukt for å detektere fluorescens-aktivert celler. Alle målinger ble gjort i triplikat.
Migration bestemmelse
Cal-27-celler (10
6 celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter «såret» ved å skrape individuelle brønner ved bruk av en pipettespiss. Cellene ble inkubert med DMEM-medium (uten FBS), enten med eller uten indirubin og I3M (10 uM). Celler ble fotografert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi (100 × forstørrelse). Den vandrende evne av cellene ble evaluert ved å måle bredden av sårene. Migrasjon avstander cellene ble avledet fra forskjellene mellom breddene av sårene på 0, 24, og 48 timer.
Transwell kultur system for invasjon analyser
invasive evner av kreft celler behandlet med eller uten I3M ble undersøkt ved hjelp av membranTransWell kultursystemet. I korthet, anvendte vi Transwell-membraner (8-um pore størrelse, diameter 6,5 mm; Corning Costar Corporation) belagt med Matrigel for analysene. -Celler (1 x 10
4-celler) ble sådd inn i de øvre brønnene på forbelagte Transwells med I3M (0, 2,5, 5, eller 10 uM). De nedre Transwells inneholdt det samme medium. Etter 24 eller 48 timer inkubering ble cellene fra de øvre brønnene og Matrigel-belagte membraner penslet med en Q-tip, fiksert med metanol og farget med 20% Giemsa-løsning (Sigma). Cellene ble tellet ved bruk av lys-mikroskopi (200 x forstørrelse). Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo
Immunoblotting
In vitro-studier:.
Etter hver behandling ble cellene isolert for å bestemme de proteiner forbundet med trekkende og invasive funksjoner inkludert P21 (20 kDa) og P53 (53 kDa) (Cell Signaling Technology), survivin (human, 16 kDa), matriksmetalloproteinase 9 (MMP-9, 92 kDa) (Thermo Scientific), midt vedheft kinase (FAK, 125 kDa ), u-PA (34 kDa) og p-p38 (Santa Cruz Biotechnology). Prøver ble trukket ut fra de isolerte celler (med eller uten I3M behandling), separert på 12-15% SDS-PAGE-geler, og overført til PVDF-membraner. Kjemiluminescerende signaler ble oppdaget som beskrevet ovenfor for cytokrom
c
. Signalene ble registrert og kvantifisert ved hjelp av ChemiGenius Bio Imaging System (Syngene)
In vivo studier:.
Plasmaprøver (40 ug protein) ble anvendt for å bestemme nivåene av Survivin skilles ut av tumorer ved hjelp av immunoblotting og en survivin (mus) monoklonalt antistoff som beskrevet ovenfor. Vi brukte SwellGel® Blå Albumin Removal Kit (Pierce) for å berike plasmaprøvene.
Bioluminescent analyser av aaspase-3/7 og -9
En tidsavhengig studie av caspase-3 /7 og -9 aktiviteter ble utført i tre paralleller ved hjelp av analysesett caspase-Glo 3/7 og 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) på hvitt 96-brønns mikro. 10.000 celler pr brønn ble sådd ut og behandlet med 10 pM av I3M til 12, 24 og 48 timer. Deretter ble caspase aktivitet undersøkt i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble 100 ul av caspase-Glo-reagens tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. De tilstedeværelsen av aktive caspases fra apoptotiske celler vil kløyve syntetisk tetrapeptid, merket med aminoluciferin i reagenset. Den frigjorte aminoluciferin fungerer som et substrat for luciferase enzymet, som er målt ved hjelp av Synergy ™ 2 Multi-Mode mikroplateleser (Biotek, Winooski, Vermont).
Utarbeidelse av indirubin-3′-oxime /poly (vinyl alkohol) (I3M /PVA) adhesiv medikament
PVA (10 g; Sigma) ble suspendert i varmt destillert vann (100 ml, 90 ° C) og omrørt inntil det var fullstendig oppløst. Etter at polymeren viste seg å være fullstendig oppløst, ble temperaturen og omrøring opprettholdt i ytterligere 4 timer for å sikre at aggregatet ikke lenger var til stede. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur, og I3M ble tilsatt for å oppnå 10 og 20 uM I3M /PVA-klebestoffblandinger.
Utvikling av 4-nitrokinolin-1-oksyd (4-NQO) induserte oral tumorgene musemodell
Vi har evaluert anti-tumorigen aktivitet I3M å bruke en muntlig tumorigent modell i seks uker gammel mannlig C57BL /6JNarl mus (kroppsvekt: 21,6 ± 1,2 g). For å indusere den optimale dannelse av oral SCCS, included0.2 vi mg /ml 4-NQO og 0,5 mg /ml arecolin i dyrenes drikkevann i 8 uker som vår tidligere publiserte [26]. Mus (n = 240) ble randomisert til en av fire grupper: blank gruppe (n = 60) mottok bare drikkevann; Bærergruppen (n = 60), 10 uM I3M (n = 60) og 20 uM I3M (n = 60) gruppene mottok både 4-NQO (200 ug /ml) og arecolin (500 ug /ml) for å utvikle den OSCC dyret modeller. Etter den forrige undersøkelsen, ble drikkevannet skiftes hver uke, og musene fikk tilgang til vann til enhver tid under arecolin /4-NQO behandling, før begynnelsen av I3M behandlinger. Etter den tumor-induksjonsprotokollen, som varte i 8 uker [24], ble tungene og buccale deler av musene smurt med PVA alene (carrier gruppe) eller med enten 10 eller 20 uM I3M /PVA hver 2. dag i 20 uker ( 0,1 mg /g musekroppsvekt), som ble igangsatt etter at week8 (figur S1, figur 1 og 2). Aktuelle behandlinger ble igangsatt ved 8 A.M. og ble ferdigstilt i løpet av en time. De behandlede mus ble forbudt fra å få tilgang drikkevann og mat til 12 A.M. Alle musene ble veid hver 4. uke. Musene (n = 10) ble avlivet hver måned fra hver gruppe etter uke 8; Følgende CO
2 behandling, et gjennomsnitt på 0,9 til 1,3 ml hjertet blod ble samlet inn fra hver mus, og tungen skåret ut hele (med svulster), fast, innebygd, og seksjonert for hematoxylin og eosin farging.
(A) De inhiberende virkninger av indirubin og I3M på Cal-27 og HSC-3 celleproliferasjon. Cellene ble behandlet i 24 eller 48 timer med forskjellige konsentrasjoner av indirubin eller I3M. Celleformering ble analysert ved MTT-assay (øverst) og celle-telling ved hjelp av et hemocytometer (nederst). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S. D. verdier; stjernetegn betegne en statistisk signifikant forskjell (
P
0,05). (B) Cal-27-celler (10
5) ble behandlet med 10 uM I3M i 24 timer, og andelen av apoptotiske celler ble bestemt ved hjelp av Annexin V-FITC Apoptose Detection kit. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. -verdier (n = 3); stjernene betegner en statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) mellom I3M behandling og kontrollgrupper. (C) immunoblot av proteinekstrakter (30 ug) isolert fra cytosoliske og mitokondriene fraksjoner av Cal-27 celler ble behandlet med 0, 2,5, 5, eller 10 uM I3M i 24 timer. Resultatene som er vist er representative for seks uavhengige eksperimenter.
(A) Cal-27 celler ble behandlet med I3M (0, 2,5, 5, eller 10 uM) i 24 timer. Etter behandling ble cellene oppsamlet, fiksert med metanol, farget med propidiumjodid og analysert ved hjelp av flowcytometri. Dataene for hver prøve representerer prosentandelen av celler som finnes i G0 /G1, S og G2 /M-fasene av cellesyklusen. (C) immunoblot som viser ekspresjonen av cellesyklusrelaterte proteiner I3M-behandlede Cal-27-celler. Totale cellelysater ble fremstilt etter 24 timers behandling med I3M (0, 2,5, 5, eller 10 uM). Ekspresjon av p53 og p21, ble bestemt ved hjelp av immunblotting.
β
p-aktin ble benyttet som kontroll lasting i denne studien. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater.
Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (sanntid qPCR)
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen) . RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Real-time kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av en LightCycler 480 maskin og SYBR Grønn jeg Master Kit (Roche Diagnostics) [27]. Primersekvensene er oppført i tabell S1.
Immunhistokjemisk analyse
Vevsprøver ble fiksert i 4% paraformaldehyde (Merck) ved 4 ° C. Etter en kort vask med PBS ble prøvene overført til 30% sukrose i 0,01 M PBS for kryobeskyttelse. Vi pre-inkubert (2 h, 25 ° C) 8-um seksjoner med 10% hesteserum og 0,3% Triton X-100 i PBS for å forhindre ikke-spesifikk binding. Seksjonene ble inkubert med spesifikke primære antistoffer, inkludert kanin polyklonale anti-COX2 (1:200; Abcam), kanin polyklonale anti-survivin (1:50, Novus Biologicals), og TUNEL (1:100, QIA33 Calbiochem, Merck) for 1 time ved 37 ° C, etterfulgt av inkubering over natten ved 4 ° C. Seksjonene ble deretter inkubert (2 h, 25 ° C) med en biotin-konjugert sekundært antistoff (1:200; Vector), etterfulgt av inkubasjon med et avidin-pepperrot-peroksydasekompleks (ABC-Elite)
. statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. verdier. Elevens
t
-test ble brukt til å analysere forskjeller mellom behandlede og ubehandlede grupper. Dataene ble analysert ved hjelp av SPSS 12.0 programmet.
P
-verdier. 0,05 ble ansett for å være av betydning
Resultater
I3M hemmer kreft i munnhulen celleproliferasjon og induserer apoptose
Indigo, indirubin, og I3M ble først testet for veksthemming aktivitet ved hjelp av muntlige kreftcellelinjer Cal-27 og HSC-3, og 50% hemmende konsentrasjon (IC
50) verdier for disse tre stoffene ble bestemt etter 24 timers behandling (Tabell S2). I3M var tydelig mer aktiv i forhold til indigo eller indirubin i begge cellelinjer. Vi deretter undersøkt anti-proliferative effekter av forskjellige konsentrasjoner av indirubin og I3M på HSC-3 og Cal-27-celler (Fig. 1A). De MTT-analyser viste at både 5 og 10 uM indirubin hadde ingen åpenbare anti-proliferative effekter på noen av cellelinjene etter 48 timers behandling. I motsetning til dette, 10 uM I3M fremkalte signifikante anti-proliferative effekter på HSC-3-celler etter 48 timer, og både 5 og 10 uM I3M som virker anti-proliferative effekter på Cal-27-celler. De tidlige stadier av apoptose ble kvantifisert ved hjelp av FITC-konjugert annexin V og analysert med en Tali ™ Bilde cytometeret. I Cal-27-celler, var 38,5% av cellene positive for annexin V etter 24 timers behandling med I3M (10 pM), sammenlignet med kun 5% av cellene i (Fig. 1B) kontrollgruppen. Etter 24 timer I3M behandling, doseavhengig økning av immunoblotting var tydelig i cytosoliske fraksjoner av cytokrom
c product: (Fig. 1B).
I3M induserer cellesyklus arrest i stor grad på G2 /M fase og øker p53 og p21
WAF1 uttrykk
for å avgjøre om I3M induserer Cal-27 cellesyklus arrest, vi brukte flowcytometri for å analysere hvordan økende konsentrasjoner av I3M påvirke utviklingen av cellesyklusen. Behandling med I3M løpet av 24 timer økt andelen av Cal-27-celler som er igjen i G2 /M fase på en doseavhengig måte. Nærmere bestemt prosentandelen av G2 /M-fase-celler økte fra 36,6% til 53,9% som respons på 10 uM I3M. I tillegg bemerket vi en økning i prosentandelen av G0 /G1-faseceller fra 11,4% til 21,4% (fig. 2A). Det er kjent at p53 undertrykker svulstvekst via cellesyklus arrest eller utløser apoptose. Derfor brukte vi immunoblotting for å bestemme hvorvidt I3M behandling modulerer uttrykket nivåer av p53. Etter 24-timers behandling med forskjellige konsentrasjoner av I3M, Cal-27-celler utviste doseavhengig økning i p53-ekspresjon, med samtidige økning i p21
WAF1 protein ekspresjon i tillegg, noe som tyder på at en av de mekanismer som I3M utøver sin anti -proliferative effektene kan være mediert av p53 (fig. 2B).
I3M hemmer kreft celle migrasjon og invasjon
For å undersøke om I3M hemmer Cal-27 celle invasjon, vi utførte en sårheling assay . Som vist på fig. 3A, overføringsavstander ble signifikant redusert i celler behandlet med 10 uM I3M sammenlignet med kontrollen og indirubin grupper. Deretter gjennomførte vi en Matrigel Transwell-analyse for å fastslå om I3M også påvirker celle invasjon. Vi har funnet at en 10 uM dose av I3M signifikant hemmet celle invasjon ved både 24 og 48 timer. Vi har også observert lignende resultater til en lavere I3M dosering (5 mm) Følgende 48 timer etter behandling (Fig. 3B). For å identifisere de spesifikke molekyler som er berørt av I3M utførte vi immunoblotting analyse for å bestemme uttrykket nivåer av flere proteiner involvert i invasjonen og migrasjon. Nivåene av FAK, MMP-9, og urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) ble signifikant redusert etter I3M behandling i 6 timer. Imidlertid I3M induserte en vedvarende aktivering av fosfor-p38 (fig. 3C). Disse resultatene foreslår at endringer i ekspresjonsnivåer av FAK, MMP-9, og uPA spille en rolle ved inhibering av invasjon og migrasjon observert i I3M-behandlede Cal-27-celler.
(A) Inkubering av cellene i fravær eller nærvær av 10 pM indirubin eller I3M ble utført i 0, 24 eller 48 timer. Cellene ble fotografert under fase-kontrastmikroskopi (100 x forstørrelse). Dataene er vist som den prosentvise inhibering; stjernene indikerer en statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) mellom behandlings- og kontrollgrupper. (B) Celler (10
4) ble sådd ut i det øvre kammer med I3M (0, 2,5, 5, eller 10 uM) og fikk gjennomgå migrasjon i 24 eller 48 timer. Kvantifisering av cellene i det nedre kammer ble utført ved å telle cellene i henhold x 200 forstørrelse. Den prosentvise inhiberingsverdier og kolonnegjennomsnittsverdier ble avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. Stjernene indikerer en statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) mellom behandlings- og kontrollgrupper. (C) immunoblot som viser endringer i mengden pp38, FAK, MMP-9 og uPA proteiner forbundet med migrering og invasjon i Cal-27 celler etter 10 uM I3M behandling (n = 3).
identifisering av survivin som et mål av I3M
en immunoblotting analyse viste både tids- og doseavhengig nedregulering av survivin av I3M (fig. 4A og 4B). Survivin ekspresjon ble betydelig redusert etter behandling med 10 uM I3M 12-48 timer. Sanntids qPCR viste også nedregulering av Survivin mRNA-nivåer i I3M-behandlede celler, hvilket antyder at I3M undertrykker Survivin ekspresjonen på transkripsjonsnivå (fig. 4C). For å undersøke nedregulering av survivin av I3M ha noen effekt på caspase-3/7 og -9 aktiviteter. Vi målte caspase-3/7, og -9 aktivitetene til 10 uM I3M behandling ved 12, 24 og 48 timers tids-punkt. Resultatet viser meget betydelig økt i caspase-3/7 og -9 aktiviteter ble oppdaget etter 12 (94 ganger og 131 ganger), 24 (388 ganger og 282 ganger) og 48 timer (462 ganger og 314 ganger) av I3M eksponering . Således er disse data tyder på at I3M ikke bare undertrykker Survivin i Cal-27-celler, også påvirker det indre (mitokondrie-caspase-9) bane.
(A) En demonstrasjon av tidsavhengige Survivin downregulation følgende 10- iM I3M behandling for ulike varigheter. Data er presentert som gjennomsnitt ± S. D.-verdier (n = 3); stjernene indikerer en statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) mellom behandlings- og kontrollgruppene. (B) Den doseavhengige for nedregulering av Survivin følgende I3M behandling i 12 timer. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S. D.-verdier (n = 3); stjernene indikerer en statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) mellom behandlings- og kontrollgrupper. (C) Cal-27-celler ble inkubert med I3M (10 uM) i 0, 6, 12, 24 eller 48 timer. Vist er de relative genekspresjon nivåer for hver prøve i behandlingsgruppen (n = 6). De tykke streker angir den midlere relaterte prosentandelen av de enkelte behandlingsgruppene. T /C: Behandlet gruppe (6, 12, 24, eller 48 h) /kontrollgruppen (0 timer). (D) En demonstrasjon av tidsavhengige Caspase-3/7 og -9 upregulations følgende 10-mikrometer I3M behandling for 12, 24 og 48 timer.
I3M undertrykker 4-NQO /arecoline- indusert kreft i munnhulen i mus
Vann forbruk ble rapportert ukentlig i hver gruppe over 28 uker, ble tidsforløpet (4 uker /tidspunkt) vist i figur S1. De forbruk ble observert blant de eksperimentelle gruppene. Mus som tilbys vann med 4-NQO (200 ug /ml) og arecolin (500 ug /ml) forbrukes mindre mengde vann før uke 8 (bærer, 10 uM, og 20M-grupper) enn den tomme gruppe. Imidlertid, den minste mengde av vann ved 20, 24 og 28. uke er transportøren gruppe. Ved 8 uker, kroppsvekten var lavere i bæreren gruppe mus (Fig. 5A). Når 4-NQO og arekolin administrasjoner ble avbrutt og mus ble gitt vann fra springen ved uke 9, både vanninntak og kroppsvekt av musene øket. Ved uke 12, 16, 20 og 24, var det ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt blant de fire gruppene. Ved uke 28, kroppsvekten var signifikant lavere i bærergruppen enn i noen annen gruppe. Mus behandlet med bærer alene viste en tidsavhengig økning både i antall og størrelse av de tunge tumorer. Påfallende, lokal behandling som består av 10 eller 20 mikrometer I3M /PVA gel smurt på tunger mus trykt tumorigenesis, med høyere konsentrasjoner viser større effektivitet (Fig. 5B).
(A) i mus eksperimenter, kroppsvekt ble ikke vist signifikant forskjellig mellom de fire gruppene til 8. uke. Etter I3M eksperimentene, kroppsvekten av bærergruppen var signifikant lavere enn alle andre grupper ved uke 28 (
p
= 0,031, n = 10). (B) Oral kreft lesjoner ble indusert på tungene i mus med 0,5 mg /mL arekolin og 0,2 mg /ml 4-NQO. Tabellen viser tumor tall og størrelser fra fire grupper (10 mus /gruppe /sampling).
I3M reduserer survivin og COX-2 uttrykk og samtidig øke andelen TUNEL-positive celler
in vivo
H E farging ved ulike tidspunkt viste at 4-NOQ /arekolin eksponering økt SCC formasjonen i carrier-behandlede mus. I motsetning til dette, redusert I3M SCC dannelse etter 28 uker i en dose-avhengig måte. Immunhistokjemisk farging viste høye nivåer av både COX-2 og survivin i SCCS i carrier-behandlede mus i 28 uker. Spesielt I3M forårsaket doseavhengig reduksjon i survivin og COX-2 uttrykk. En TUNEL Analysen ble utført for å vurdere nivået av apoptose oppstår
in vivo
. Shi et al.
