Abstract
Bakgrunn
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter viser en høy tilbøyelighet til å utvikle skjelettmetastaser, noe som resulterer i overdreven osteolytic aktivitet. Den RANKL /RANK /OPG system, som spiller en sentral rolle i benremodelleringen ved å regulere osteoklastdannelse og aktivitet, er av potensiell interesse i denne sammenheng.
Materialer og metoder
Reverse transkriptase polymerase chain reaksjon, western blotting, og immunhistokjemisk analyse ble brukt for å undersøke ekspresjon av RANKL, RANK, og OPG i humane NSCLC-cellelinjer med forskjellige metastatiske potensial, så vel som i 52 primær NSCLC-prøver og 75 NSCLC benmetastase prøver. I primær NSCLC pasienter, ble uttrykket av disse proteinene korrelert med clinicopathological parametere. Rekombinant human RANKL og transfektert RANKL cDNA ble tilsatt til PAA cellelinjen for å evaluere virkningen av promoteren RANKL under prosessen med metastase
in vitro
og
in vivo
.
resultater
oppregulert RANKL, RANK, og OPG uttrykk og økt RANKL: OPG forholdet ble oppdaget hos NSCLC cellelinjer og i tumorvev med beinmetastaser, og ble korrelert med høyere metastatisk potensial. Den metastatisk potensial for NSCLC
in vitro Hotell og
in vivo
, inkludert migrasjon og invasjon evne, ble betydelig forbedret ved rekombinant humant RANKL og transfeksjon av RANKL cDNA, og ble svekket etter OPG ble lagt . Den økte uttrykk for RANKL og OPG korrelert med tumor stadium, lymfeknutemetastase, og fjernmetastaser.
Konklusjoner
Differensial uttrykk for RANKL, RANK, og OPG er forbundet med metastatisk potensial for menneskelig NSCLC til skjelettet, øke muligheten for at RANKL /RANK /OPG system kan være et terapeutisk mål for behandling av metastatisk NSCLC
Citation. Peng X, Guo W, Ren T, Lou Z, Lu X Zhang S, et al. (2013) Differential Expression av RANKL /RANK /OPG System er assosiert med benmetastaser i Human Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (3): e58361. doi: 10,1371 /journal.pone.0058361
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 18 juli 2012; Godkjent: 06.02.2013; Publisert: 13 mars 2013
Copyright: © 2013 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation National of China (nr 30973020 og 81001193). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste diagnosen kreft og den viktigste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i asiatiske og vestlige populasjoner, med over 150 000 mennesker ventes å dør årlig av denne sykdommen [1] . Skjelettet representerer den mest vanlige området av tumormetastase. Omtrent 9% til 30% av pasienter med lungecancer utvikler benmetastaser, noe som fører til en betydelig sykelighet fra ryggmargs kompresjon, patologiske frakturer, og umedgjørlig smerte [2], [3]. Til tross for den høye frekvensen av metastaser, forblir de underliggende molekylære mekanismer som regulerer muligheten for lungekreft celler til å spre seg og invadere dårlig forstått, og vellykkede behandlingsmetoder forblir unnvikende.
For å utvikle effektive behandlinger for beinmetastaser, er det nødvendig å klargjøre de molekylære mekanismene bak tumor-induserte endringer i benet mikromiljøet. Normalt er det en nøye koordinert balanse hvori osteoklastmediert benresorpsjon og osteoblast-mediert bendannelse motvirke og bidra til den konstante ombygging av benstrukturen [4]. Når lungekreft metastasizes til bein, kan avbrudd av denne balansen føre til økt benresorpsjon, noe som resulterer i overdreven osteolytic aktivitet og påfølgende skjelettsykdom [5].
Nye rapporter har avdekket en ny reseptor-ligand system tilhørighet til tumor nekrose faktor (TNF) superfamilien: reseptoren aktivator for nukleær faktor (NF) -kB (RANK), dets ligand (RANKL), og proteinet osteoprotegrin (OPG) [6], [7]. RANKL, et membranbundet protein uttrykt i hovedsak på overflaten av osteoblaster og stromale benmargsceller, binder seg til RANK på overflaten av osteoklast-forløpere, stimulere deres differensiering til modne osteoklaster [8] – [10]. OPG, en lokkefugl reseptor av RANKL som også produseres av osteoblast /stromale celler kan forhindre bendestruksjon ved å blokkere bindingen mellom RANKL og RANK, og hemmer osteoklast differensiering og aktivering [6], [11]. Feilregulering av RANKL /RANK /OPG systemet har blitt påvist i flere tumorer, slik som brystkreft [12], [13], prostata kreft [14], ondartede bensvulster (f.eks multippel myelom, gigantiske celle svulster i ben, og chondroblastoma) [15] – [17], plateepitelkarsinom [18], og Hodgkins sykdom [19]. Tidligere studier har vist at RANKL er nødvendig for utvikling av osteolytiske lesjoner i benet [20]. I tillegg, ved å blokkere RANKL-RANK interaksjon, osteolytiske lesjoner har blitt hemmet i flere typer kreft, inkludert multippel myelom og prostata kreft [21] -. [23]
I lungekreft, den RANKL /RANK /OPG system har blitt påvist både i nærvær og fravær av benmetastaser. Forhøyede serumnivåer av løselig RANKL og OPG er rapportert hos lungekreftpasienter med skjelettmetastaser [24]. Nylig ble det rapportert at RANKL utløser også migreringen av humane tumorceller som uttrykker RANK [25]. Videre RANK-Fc, en kimære protein som hemmer RANK-RANKL interaksjon, har vist seg å motstå osteoclastogenesis [26]. Følgelig hypoteser vi at uttrykket av RANKL /RANK /OPG kan korrelere med NSCLC progresjon. I denne studien ble uttrykk for RANKL, RANK, og OPG undersøkt i ulike menneskelige lungekreft cellelinjer med ulike metastatiske potensialer. Rekombinant human RANKL og transfektert RANKL cDNA ble tilsatt til en NSCLC cellelinje for å evaluere virkningen av promoteren RANKL i prosessen med metastasering. Immunhistokjemisk analyse ble utført for å vurdere uttrykk for RANKL, RANK, og OPG i grunnskolen NSCLC svulster, samt i bein metastatisk vev av NSCLC. Uttrykk av disse proteinene ble korrelert med clinicopathological parametre for primær NSCLC.
Materialer og metoder
Pasienter
Denne studien undersøkte kirurgiske biopsiprøver fra 127 pasienter med NSCLC, inkludert 52 tilfeller av nylig diagnostisert NSCLC og 75 tilfeller av bein metastasering av NSCLC. Alle pasientene ble behandlet på Peking University Folkets sykehus og fikk ingen behandling på tidspunktet for prøvetaking. Detaljerte kliniske data om disse pasientene er gitt i tabell 1. NSCLC pasienter ble iscenesatt i henhold til American Thoracic Society TNM-klassifikasjon, og gradert histologisk som enten godt, moderat eller dårlig differensiert. Studien ble godkjent av Institutional Review Boards of Peking University Folkets sykehus. De etikkomiteer godkjent denne prosedyren. Informert samtykke til eksperimentell bruk av kirurgiske prøver ble innhentet fra alle pasientene i skriftlig form i henhold til sykehusets etiske retningslinjer.
Cell kultur og reagenser
humane lungekreftcellelinjer PG- BE1, PG-LH7, og PAA ble kjøpt fra Institute of Pathology, Peking University Health Science Center (Beijing, Kina). Celler ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Rekombinant humant protein RANKL og OPG ble kjøpt fra Prospec Bioteknologi Inc. (Prospec, Ness-Ziona, Israel, Cat No: CYT-334 og CYT-633). Antistoffer reist mot RANK, RANKL og OPG ble kjøpt fra Abcam Inc. (Abcam, MA, USA, Cat No: ab12008, ab9957 og ab73400). β-actin antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA, Cat No: sc-130065).
Dyr
Seks uker gammel mann alvorlig kombinert immunsvikt ( SCID) mus som veide 20-25 g ble anvendt for denne studien. Den dyrestudie ble godkjent av Institutional Review Boards of Peking University Folkets sykehus. Dyrene ble hentet fra Model Animal Research Center of Peking University Health Science Center, holdt under patogen-frie forhold i henhold til NIH retningslinjer ved hjelp av et dyr protokoll godkjent av Animal Care og bruk komité ved høgskolen.
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra PG-BE1, PG-LH7, og PAA celler ved en enkelt-trinns metode bruker TRIzol reagens (Invitrogen, La Jolla, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, og RNA ble deretter revers transkribert til komplementære DNA. De spesifikke primere anvendt for DNA-amplifikasjon er oppsummert i tabell 2. Det amplifiserte PCR-produktet ble fraksjonert ved 1,5% agarosegelelektroforese, fotografert under ultrafiolett lys, og analysert ved hjelp av densitometri. Kvantitativ real-time PCR ble utført i en ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) med en GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Den termiske Profilen var 95 ° C i 15 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 58 ° C i 30 sek. MRNA uttrykk for RANKL /RANK /OPG ble analysert ved hjelp av 2
– (ΔΔCt) metode (PAA cellelinje som en kalibrator) basert på Ct-verdier for både mål- og referanse gener. Mengden av hvert transkript ble normalisert mot en kjent mengde av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og β-aktin. Hvert forsøk ble utført in triplo. Resultater av sanntids-PCR-analyse er gitt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Termisk dissosiasjon tomter ble undersøkt for bifasisk smeltekurver, som indikerer om primer-dimer eller andre ikke-spesifikke produkter kan bidra til forsterkning signal.
Western blot analyse
Western blot analyse var utført som tidligere beskrevet [27]. I korthet proteinene ble separert på en 10% denaturerende polyakrylamid gel og overført til en PVDF-membran. Individuelle immunoblotter ble utført med primære antistoffer dannet mot RANK (1:500), RANKL (1:1000), OPG (1:500), og β-aktin (1:1000). Membranene ble blokkert i TBS-T inneholdende 5% fettfri tørrmelk, og deretter inkubert over natt med primært antistoff. Deretter ble membranene inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz, CA, USA) i 1 time. ECL-reagens (GE Healthcare, NJ, USA) ble anvendt for proteindeteksjon. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Immunohistochemistry
Parafin seksjoner ble reagert med kanin polyklonale anti-RANKL antistoffer (1:500 fortynning), mus polyklonale anti-rank antistoffer (1:200 fortynning) eller kanin anti-OPG-antistoffer (1:100 fortynning), som tidligere beskrevet [27]. Seksjoner farget med ikke-immun kanin eller mus serum (1:200 fortynning) i fosfat-bufret saltvann (PBS) i stedet for primært antistoff tjente som negative kontroller. For å evaluere RANKL, RANK, og OPG flekker, ble kreftceller utviser positiv farging på cellemembraner og i cytoplasma telles i minst 10 representative felt (400 × forstørrelse) og den gjennomsnittlige prosentandelen av positive kreftceller ble beregnet. Tilfeller hvor andelen av positive cancerceller var ≥50% ble definert som positiv, og de som inneholdt 50% positive cancerceller ble definert som negativ. Farging ble vurdert av to uavhengige patologer blindet til kliniske kjennetegn og resultater.
Datamaskinassistert bildeanalyse av immunhistokjemi
farging av alle antistoffer ble analysert kvantitativt ved hjelp av en datamaskin-assistert bildeanalyse system . Kort fortalt ble bilder av fargete snitt tatt med en Leica digital kamera og behandlet ved hjelp av Image Pro Plus analyse programvare (versjon 6.0, Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Terskelen ble satt ved å bestemme positiv farging av styreseksjoner og ble brukt til automatisk å analysere alle registrerte bilder av alle prøvene som ble farget i samme økt under identiske betingelser. Arealet av immunfarget regioner ble beregnet automatisk av programvaren i hver mikroskopiske felt. Pixel tellinger av den immunologiske reaksjonsprodukt ble beregnet automatisk og ble gitt som total tetthet av den integrerte immunfarging over et gitt område av seksjonene. Dette viser den relative mengde av proteiner som detekteres av antistoffene på tumorsnitt. Forholdet RANKL /OPG ble beregnet ut fra integrerte farging tettheter av RANKL og OPG i hver gruppe
RANKL cDNA transfeksjon
Full-lengde human RANKL cDNA. (RefSeq: NM_033012.2) ble satt inn inn i eukaryote vektor pCMV6-XL5 (kjøpt fra OriGene Technologies, Inc. Cat No: SC305532). PAA-celler ble transfektert med det rekombinante plasmid eller vektor alene (mock-transfektanter) under anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) som beskrevet av produsenten, og dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS og 500 ug /ml G418 (AMRESCO, OH, USA). RANKL stabile transfektanter (oppkalt PAA-RANKL) og mock transfektanter (oppkalt PAA-mock) ble etablert og opprettholdt i RPMI 1640 supplert med 10% FBS og 250 mikrogram /ml G418.
In vitro
migrasjon og invasjon analyser
Migrasjon og invasjonen ble utført av seeding 3 × 10
5 celler i 200 mL RPMI 1640 på toppen av Transwell cellekulturinnsatser inneholder en polyetylentereftalat membran pre-belagt med eller mangler Matrigel ( 24-brønns inserts, 8,0 mikrometer porestørrelse, Coster, Corning Inc., Corning, NY, USA). Det nedre kammer ble fylt med 0,8 ml RPMI 1640, med eller uten tilsatt human rekombinant RANKL og med eller uten humant rekombinant OPG. Etter inkubering i 24 timer, ble de ikke-migrerende cellene skrapet av og membranene ble fiksert og farget med Diff-Quik flekk kit (Sysmex Co., Hyogo, Japan). Celler som hadde migrert gjennom membranene ble kvantifisert ved bestemmelse av celletallet i tre tilfeldig valgte synsfelt ved 200 x forstørrelse.
tibial implantering av lungekreftceller
A murine intratibial injeksjon modell av bein metastasering ble brukt til å lage osteolytiske lesjoner i denne studien [28] -. [30] De lungekreft celler (5 × 10
5 celler) ble suspendert i 10 ul av 1% PBS og blandet med 10 ul av matrigel (BD biovitenskap , San Jose, CA) for hver tibial injeksjon. 20 ul av celler og matrigel blanding ble injisert i den proksimale tibia av 6-uker gammel SCID-mus som tidligere er publisert [29], [31]. I korthet, ble musene bedøvd ved hjelp av isofluran (1,5-2%) og oksygen. Den overliggende huden ble preparert i sterile mote med 70% etanol og betadine. En 3 mm langsgående innsnitt ble foretatt over den patellare leddbånd med et antall 12 skalpellblad, og deretter en 2-mm langsgående snitt ble gjort langs den mediale kant av patella ligament til tibial platå. A 26 1/2 gauge kanyle ble innført gjennom den proksimale tibiale platået og 20 ul av lungekreftceller og matrigel blanding ble injisert inn i marghulen. Såret ble avsluttet med en enkel 5-0 Vicryl sutur (Ethicon Inc.).
Animal kollokviegrupper
I denne studien, femti mann SCID mus gikk tibial implantasjon med lungekreft celler og var likt fordelt på fem studiegrupper. Gruppe I (PAA) dyr mottatt intratibial injeksjon av PAA celler alene. Gruppe II (PAA-Mock) skinnebein mottatt PC-3 celler som ble transfektert med en tom vektor å kontrollere for transfeksjon. Gruppe III (PAA-RANKL) mottok dyrene paa celler som ble transfektert med en vektor som overuttrykker RANKL cDNA. Tibias i gruppe IV (PAA-RANKL + OPG) ble implantert med PAA-RANKL celler og dyr ble deretter behandlet med OPG. OPG ble anvendt i doser på 10 mg /kg oppløst i en 100 ul fosfatbuffer saltvann (PBS) og ble injisert subkutant tre ganger i uken som starter på dagen for tibial implantasjon av kreftceller og fortsatte i totalt 8 uker. Gruppe V (PAA-RANKL + PBS) skinnebein ble implantert med PAA-RANKL celler og mus ble behandlet med 100 ul PBS, som også ble injisert subkutant tre ganger i uken i 8 uker.
radiotracer forberedelse
Fluor ion ble produsert ved hjelp av O-18 vann og proton bombardement bruker en RDS syklotron (CTI).
18F-fluor ion ble produsert på spesifikke aktiviteter på ca 1000 Ci /mmol og
18F-FDG ble syntetisert på spesifikke aktiviteter på ca 5000 mCi /mmol som er publisert tidligere [30].
Micro PET /CT bildebehandling protokollen
Dyr i bilde undergruppene gikk positronemisjonstomografi (PET) og mikro CT-skanning på 8 uker på forfatterens institusjon i henhold til en tidligere utgitt protokollen [30]. I korthet, ble musene bedøvet med isofluran (1,5-2%) og oksygen i induksjonskamrene. Musene ble deretter injisert direkte med ca. 250 uCi
18F-FDG via halevenen ved anvendelse av en 27 gauge nål gjenget til et polyetylen-kateter. Dyrene ble administrert vedlikehold bedøvelse med 2% isofluran i isolasjonssjiktsystem i løpet av radiotracer opptak. Blærene ble manuelt uttrykt 5 min forut for avbildning og dyrene ble plassert i en bærbar multimodalitet sjiktsystem som består av et kammer med lucite anestesi porter og hevet plattform. Hel-kroppsskanning ble utført med en 10-minutters oppkjøpet tid ved hjelp av en MicroPET® FOCUS 220 system (CTI Concorde Micro LLC). Umiddelbart etterpå ble en uten kontrast micro CT undersøkelse ved hjelp microCAT® II (IMTEK Inc.) bildesystem som brukes til å skanne dyr med en 10-minutters fangsten. PET scan bildene ble rekonstruert ved hjelp av filter tilbake projeksjon. MicroPET og microCAT® bildene ble deretter fusjonert til analyse for bruk med AMIDE® programvare.
Kvantitativ analyse av mikro PET /CT-data
PET og CT scan data ble analysert og kvantifisert ved AMIDE® ( A Medical Image data Examiner) versjon 0.7.154 som er publisert tidligere [30].
18F-FDG opptak korrelerer med mobilglukosemetabolismen og ble brukt i mikro PET avbildning for påvisning og langsgående overvåking av tumorbyrde. Kort fortalt ble regioner av interesse (Rois) tegnet med en ROI verktøyet over bilaterale tibial platåer som var tredimensjonalt rekonstruert for å begrense alle bare signal uptakes. Ved hjelp av avkastnings kasser av samme størrelse, ble verktøy for dataanalyse anvendt for å beregne maksimum og midlere signalintensitet i begge tumor implantert tibias og kontralaterale uinjiserte tibias. Den kontralaterale tibia ble anvendt som en intern kontroll for hvert dyr. For å kvantifisere tumorstørrelse ble 3D isocontour ROI trukket i tumoren tibia bruker maksimal FDG signalintensiteten i det kontralaterale tibia som terskelen, og FDG signal volum (mm
3) ble så beregnet i tumor implantert tibias. Micro CT-bilder ble brukt for å identifisere og kvantifisere osteolytiske lesjoner.
tumorbyrde målinger
Dyrene ble avlivet etter micro PET /CT scan på 8 uker, og deres svulster i bakbenet ble høstet for myk -tissue måling. Bløtvevet tumormengde ble beregnet ved hjelp av formelen som er publisert tidligere [29], [32].
Statistisk analyse
Data fra bildeanalyse av delene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av middelverdien (SEM) i hver gruppe. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av
t
-test og variansanalyse (ANOVA), med
p
-verdier 0,05 ansett som statistisk signifikant. Pearsons chi-kvadrat-testen ble benyttet for å bestemme korrelasjonen mellom RANKL /RANK /OPG-ekspresjon og clinicopathological parametere. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 15.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).
Resultater
Expression of RANKL, RANK, og OPG i humane lungekreftcellelinjer
Først bestemte vi den metastatiske potensialet i PG-BE1, PG-LH7, og PAA celler. PG-BE1 celler sterkere trengt inn i filter enn de andre cellelinjer, og antallet migrerte PAA-celler var minimal (
p
0,05, figur 1A, B). Videre er nivået av matriks metalloproteinase-9 (MMP9) mRNA observeres gjennom RT-PCR-analyse var lik nivået observert med Transwell innsatser (
p
0,05, figur 1C). Alt ovenfor indikerte at disse tre cellelinjene hadde forskjellige metastatiske potensialer. Deretter ble uttrykket av RANKL, RANK, og OPG vurdert i alle tre cellelinjene ved transkripsjons og proteinnivåer ved hjelp av kvantitativ real-time PCR og Western blotting. Alle tre NSCLC cellelinjer viste ulike nivåer av RANKL, RANK, og OPG uttrykk. Av de tre cellelinjer, PG-BE1 celler (som hadde den høyeste metastatisk potensial) viste den sterkeste uttrykk for RANKL, RANK, og OPG (
p
0,05 vs. andre cellelinjer, figur 2 og 3 ). Paa celler, som var den minst invasive, utstilt bare minimal RANKL, RANK, og OPG flekker. Immunocytochemistry bekreftet RANKL, RANK og OPG uttrykk observert med kvantitativ real-time PCR og Western blotting. I tillegg er en betydelig høyere RANKL: Det ble ikke observert OPG tetthetsforhold i cellene med høyere metastatisk potensiale (
p
0,05 Figurene 2D og 3D)
metastatisk potensial på tre NSCLC. cellelinjer ble først bestemt ved anvendelse av en in vitro-migrasjon assay (A, B). Differensiell MMP9-ekspresjon i tre NSCLC-cellelinjer ble ytterligere analysert ved RT-PCR (C). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra tre separate eksperimenter. **
p
0,05 for PG-BE1 versus PG-LH7. *
p
. 0,05 for PG-LH7 versus PAA
RT-PCR ble utført for å påvise RANKL, RANK, og OPG mRNA nivåer i PG-BE1, PG-LH7 og PAA-celler (a). Kvantitativ real-time PCR avslørte den relative uttrykk for RANKL, RANK, og OPG mRNA i tre NSCLC cellelinjer ved hjelp av to
– (ΔΔCt) metode (PAA cellelinje som en kalibrator). GAPDH og β-aktin ble benyttet som intern referanse (B, C). Deretter forholdet RANKL: Det ble OPG-mRNA-ekspresjon i tre NSCLC-cellelinjer beregnes basert på Ct-verdiene for både mål- og referanse-gen (D). Stolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra tre forskjellige eksperimenter. **
p
0,05 for PG-BE1 versus PG-LH7. *
p
. 0,05 for PG-LH7 versus PAA
Western blot analyse ble utført for å påvise RANKL, RANK, og OPG proteinnivået i PG-BE1, PG-LH7 og PAA celler. Båndintensitetene ble normalisert til p-aktin (A-C). Deretter forholdet RANKL: OPG-protein-ekspresjon ble beregnet i tre NSCLC-cellelinjer (D). Stolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra tre forskjellige eksperimenter. **
p
0,05 for PG-BE1 versus PG-LH7. *
p
0,05 for PG-LH7 versus PAA
Rekombinant RANKL stimulert PAA migrasjon og invasjon
In vitro
Med. laveste metastatisk potensial og minst RANKL uttrykk, lavt antall migrerte PAA celler ble økt med tre ganger i nærvær av rekombinant humant RANKL (
p
0,05). Denne effekten ble blokkert ved tilsetning av rekombinant human-OPG på en doseavhengig måte (figur 4B). Stimulert invasjon også økt med to ganger da rekombinant RANKL ble lagt til PAA celler. På samme måte, OPG produserte en doseavhengig reduksjon i PAA celle invasjon. Disse resultatene indikerte at RANKL /RANK /OPG-systemet var funksjonelt i lungecancerceller.
Western blot-analyse viste høyere RANKL protein ekspresjon i PAA-RANKL-celler sammenlignet med PAA og PAA-Mock celler (A). Rekombinant RANKL stimulert Paa cellemigrering, og effekten av RANKL administrasjonen ble blokkert ved tilsetning av OPG til kulturmediet på en doseavhengig måte. *
p
0,05 til 300 ng /ml rekombinant RANKL versus kontroll og 200 ng /ml OPG-behandlede prøver (B). Økt migrering av PAA-RANKL-celler in vitro ble demonstrert, og kan bli blokkert ved tilsetning av OPG til kulturmediet. *
p
0,05 for PAA-RANKL versus PAA, PAA-Mock og 200 ng /ml OPG-behandlede prøver (C). Resultatene er rapportert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) av tredoble analyser.
RANKL cDNA transfeksjon stimulert PAA migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og
vivo
for ytterligere å belyse de biologiske funksjonene til RANKL /RANK /OPG system i NSCLC, brukte vi transfeksjon teknikk for å spesifikt regulere RANKL genuttrykk i PAA celler. PAA-celler ble transfektert med plasmid-DNA som koder for full-lengde RANKL genet. Etter G418 screening i flere uker, ble den stabil transfektant-cellelinjen PAA-RANKL etablert. RANKL uttrykk var signifikant oppregulert i denne cellelinjen sammenlignet med den opprinnelige PAA linjen og mock transfektant med pCMV6-XL5 vektor (PAA-Mock) (
p
0,05, figur 4A).
Deretter undersøkte vi effekten av oppregulering av ekspresjon RANKL på den metastatiske adferd av tumorceller ved transwell-analyse. Antallet migrerte celler var over to ganger høyere hos PAA-RANKL celler enn i PAA og PAA-Mock celler; antallet invaderte celler var også to ganger høyere. Begge disse effektene ble blokkert ved å legge OPG til kultur medium på en doseavhengig måte (figur 4C).
For å undersøke hvilken rolle RANKL i NSCLC in vivo videre, vi etablert xenograft mus modell av intratibial injeksjon av PAA celler eller PAA-RANKL celler inn i SCID-mus. Etter 8 uker, ble det observert at volumet av tumor avledet fra PAA-RANKL cellene var betydelig større enn det som er avledet fra PAA-celler (tabell 3). Micro PET analyse avslørte også signifikant forskjell på skjelettlesjon størrelse mellom Group (PAA) og Gruppe (PAA-RANKL) (tabell 3, figur 5). I tillegg, med OPG subkutant tre ganger i uken, både tumorvolumet og
18F-FDG skjelettlesjon størrelsen Group (PAA-RANKL + OPG) var betydelig mindre enn Group (PAA-RANKL) og Gruppe (PAA-RANKL + PBS) (tabell 3;. Figur 5)
A-Plain røntgenbilde; B-micro CT (tverrstilt visning); C-micro PET /CT overlegg (tverrstilt visning). Vanlig røntgen og mikro PET /CT demonstrert økt bein ødeleggelse (hvite piler) og
18F-FDG opptak i gruppe (PAA-RANKL) og gruppe (PAA-RANKL + PBS) 8-uker etter intratibial injeksjon av tumorceller, mens økningen ble hemmet i gruppen (PAA-RANKL + OPG).
samlet utgjør disse dataene ovenfor vist at RANKL /RANK /OPG system spiller en avgjørende rolle i benmetastaser av NSCLC in vivo. Disse funnene er i overensstemmelse med in vitro studier og clinicopathologic data.
Protein uttrykk for RANKL, RANK, og OPG i primær NSCLC lesjoner og metastaser
Neste, vi brukte farging å undersøke RANKL, RANK og OPG protein nivåer i humane NSCLC vevsprøver. 75 NSCLC metastaser til bein inkludert i studien, 60 tilfeller (80%) og 54 tilfeller (72%) viste uttrykk for henholdsvis RANKL og RANK, mens 62 tilfeller (82,7%) viste OPG uttrykk (tabell 4). RANKL og RANK farging ble hovedsakelig observert i cellemembranen og cytoplasma av kreftceller. Ikke-neoplastiske benvev viste svak og focal RANKL, RANK, og OPG flekker, og fargeintensitet for alle tre proteiner var sterkere på kreftcelle /bein grensesnitt enn i sentrum av kreftcellen reir (Figur 6A). Til sammenligning i 52 primære kreft bare 53,8% og 59,6% av tilfellene viste RANKL og RANK uttrykk, henholdsvis, og 63,5% av tilfellene viste OPG uttrykk (
p
0,05, tabell 4). Betydelig sterkere farging for alle tre proteiner ble observert i skjelettmetastaser enn i tumorceller på det primære området. Dette funnet ble bekreftet av kvantitativ analyse av farging tetthet av proteiner i hver gruppe.
Immunocytochemistry for RANKL, RANK, og OPG ble utført i vevssnitt fra primær NSCLC lesjoner og skjelettmetastaser som stammer fra NSCLC, og fargeintensitet ble evaluert (A). Deretter forholdet RANKL: ble OPG farging tetthet regnes i primær NSCLC lesjoner og skjelettmetastaser som stammer fra NSCLC (B). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra tre separate eksperimenter. *
p
0,05
Neste, for å vurdere farging resultatene mer nøyaktig beregnet vi RANKL. OPG prosenter ved å måle den optiske tettheten av vev fra primær NSCLC og NSCLC skjelettmetastaser. Analysen avdekket betydelig høyere RANKL. OPG prosenter i benmetastaser sammenlignet med primær NSCLC vev (Figur 6b)
Korrelasjonen av RANKL, RANK, og OPG uttrykk med clinicopathological parametre for lungekreft
Diverse clinicopathological funksjoner i primær NSCLC pasienter ble sammenlignet basert på uttrykket nivåer av RANKL, RANK, og OPG. Som vist i tabell 1, RANKL, RANK, og OPG uttrykk var ikke forbundet med alder, biologisk kjønn, røyking historie, eller histotype. Men klare sammenhenger ble etablert mellom RANKL og OPG uttrykk og tumorstadium, lymfeknutemetastase, og fjernmetastaser. Derfor ble høyere RANKL (78,6%, 71,4% og 88,9%) og OPG uttrykk (64,3%, 76,2% og 77,8%) enn hos mer avanserte metastatiske tumorer (
p
0,05; Tabell 1 ). Nesten tre fjerdedeler (71,4%) av scenen T3 /4 tumorprøver farget positivt for RANK, sammenlignet med 39,5% av scene T1 /2 tumorprøver (
p
0,05, tabell 1). Det var ingen signifikant sammenheng mellom RANK ekspresjon og lymfeknutemetastase eller fjern metastase. Til slutt, pasienter med dårlig differensiert histologisk grad stilt mye høyere RANKL uttrykk enn de med godt differensiert histologisk grad (90,9% vs. 43,9%,
p
0,05); ingen signifikant assosiasjon ble observert om RANK eller OPG.
Diskusjoner
benmetastaser som stammer fra lungekreft og andre kreftformer er forbundet med alvorlige skjelettkomplikasjoner, og lungekreft metastase til ben er fortsatt en betydelig kilde av sykelighet, med få vellykkede behandlingstilbud. De fleste NSCLC-metastaser i ben er vanligvis karakterisert som osteolytisk i henhold til radiografisk utseende [20], [33], [34]. Ved normal ben, er det en dynamisk balanse mellom osteoklast-regulert benresorpsjon og osteoblast-regulert bendannelse [4].
