Abstract
Cell plastisitet regulert av balansen mellom mesenchymale til epitel overgang (MET) og det motsatte programmet EMT, er kritisk i metastatisk kaskade. Flere transkripsjonsfaktorer (TFS) er kjent for å regulere EMT, selv om mekanismene for MET uklare. Vi viser en ny funksjon av to TFS, OVOL1 og OVOL2, som kritiske induserer MET i kreft hos mennesker. Våre funn tyder på at OVOL-TFS kontroll møttes gjennom en regulerings feedback loop med EMT-induserende TF ZEB1, og regulering av mRNA spleising ved å fremkalle Epitelial skjøting Regulatory Protein 1 (ESRP1). Bruke musen prostata tumormodeller vi vise at uttrykket av OVOL-TFS i mesenkymale prostatakreftceller demper sin metastatiske potensial. Rollen OVOL-TFS som induserer MET er videre støttet av uttrykk analyser i 917 kreftcellelinjer, noe som tyder på sin rolle som viktige regulatorer av epitel-mesenkymale celle plastisitet i kreft
Citation. Roca H, Hernandez J , Weidner S, McEachin RC, Fuller D, Sud S, et al. (2013) transkripsjonsfaktorer OVOL1 og OVOL2 indusere Mesenchymale å Epitelial Overgang i Human Cancer. PLoS ONE 8 (10): e76773. doi: 10,1371 /journal.pone.0076773
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 12. april 2013, Godkjent: 28 august 2013; Publisert: 04.10.2013
Copyright: © 2013 Roca et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av U54-CA163124, U01-CA143055, P50-CA69568 og PA1-CA093900 fra National Institutes of Health. KJP støttes som en American Cancer Society klinisk forskning Professor og som et Taubman stipendiat ved Universitetet i Michigan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mer enn 90% av kreftrelaterte dødsfall skyldes metastaser [1]. Derfor må vi øke vår forståelse av mekanismene som driver kreft progresjon og metastasering. Epitelial til mesenchymale overgang (EMT), og det motsatte prosessen med MET, er avgjørende programmer involvert i sårheling og tidlig organutvikling [2]. EMT og MET kan også spille viktige roller i både kreft progresjon og etablering av metastatiske kolonier [3]. Når kreftceller gjennomgå EMT, de får muligheten til å ta avstand fra den primære svulsten og angi sirkulasjon. Disse sirkulerende celler er da i stand til å spre og gjennomgår MET, noe som resulterer i metastatiske svulster. Forstå denne fenotypisk plastisitet er en nøkkel for å hindre kreft progresjon [4].
EMT er knyttet til endringer i genekspresjon og morfologi og er assosiert med nedregulering av celle adhesjonsproteiner, slik som E-cadherin (E-cad ). Denne prosessen gjør at kreftceller til å distansere seg fra sine naboer samtidig øke bevegeligheten [5]. Det har blitt foreslått at EMT er regulert av gjensidig feedbacksløyfer mellom ZEB1 /ZEB2 TFS og medlemmer av mikroRNA MIR-200 familien [6,7]. Spesielt kan ZEB1 indusere EMT ved å undertrykke epitel proteiner og ved downregulating egne MIR-200 repressors. Samtidig, MIR-200s undertrykke ZEB1 samt stamcelle faktorer og epigenetiske regulatorer involvert i EMT. Det er antatt at disse gjensidige tilbakemeldinger looper er ansvarlig, delvis for fenotypisk plastisitet utstilt i kreft og metastase [4].
Andre proteiner kan tjene som regulatorer /indusere av EMT eller potensielle biomarkører for mesenchymale celler. Induksjon av EMT har vært forbundet med TGFp uttrykk [8]. Dels skjer dette via oppregulering av ZEB1 /2, som i sin tur, hemmer epitelial skjøte regulatoriske proteiner (ESRP) [9]. Nedregulering av ESRP, og den resulterende undertrykkelse av alternativ spleising, har vist seg å være avgjørende i EMT. For eksempel i brystkreft, undertrykkelse av ESRP resulterer i en bryter i CD44 isoform uttrykk som er kritisk i induksjon av EMT og kreft progresjon [10].
Til tross for vår voksende kunnskap om EMT, mekanismer medier MET er langt mindre forstått. Ved hjelp av to modeller av prostata og brystkreft mesenchymalceller, oppdaget vi at TFS OVOL1 (OVO-lignende en, Entrez Gene ID 5017) og OVOL2 (Gene ID 58495) er forbundet med MET i våre modeller, så vel som i andre kreftformer. OVOLs er sink-finger TFS som fungerer som regulatorer av embryogenese [11-13]. Vi først analysert hvordan OVOLs kontrollere uttrykk for EMT-induserende TFS og ESRPs. Vi studerte hvordan MET, indusert av OVOL-TFS, korrelerer med sentrale faktorer av epitelceller utvikling i 917 kreftcellelinjer som er i samsvar Human Cancer Cell Encyclopedia [14], og undersøkt konsekvensene av MET i reguleringen av kreftcelle invasjon og metastasering.
Resultater
stabil mesenchymale celler isolert fra stabile epithelial prostatakreftceller co-dyrket med makrofager
for å studere mekanismene for EMT i prostata kreft metastase vi først generert en epitelial modell cellelinje avledet fra luciferasepreparater positive prostatakreft epithelial PC3 celler. Vi har isolert en subpopulasjon av celler som uttrykte luciferase som viste en stabil epitelial fenotype i kultur og betegnet dem PC3-Epi. Disse cellene ble valgt basert på to kriterier: bioluminescent intensitet og epitelial celle morfologi. I samsvar med den epiteliale staten, PC3-Epi celler opprettholdt høy E-cad, lav vimentin, og umulig å oppdage uttrykk for EMT-aktivator ZEB1 (figur 1A og 1B)
(A) Bright-fase mikroskopi. Morfologi endringer i mesenchymale celler PC3-EMT1, PC3-EMT12 og PC3-EMT14 sammenlignet med epithelial PC3-epi prostatakreftceller. Skala barer er 200 mikrometer
(B) Immun:.. Uttrykk av EMT markører i mesenchymale kreftcellelinjer PC3-EMT1, -EMT2, -EMT12, -EMT14 og -EMT17 forhold til epitelial PC3-Epi
(C) Mikromatrise: Gene uttrykk analyser sammenligne mesenchymale til epitelial kreft cellelinjer. Venn-diagram-I (VD-I) viser en felles EMT-assosiert signatur uttrykt i mesenchymale kreft linjene PC3-EMT1, -EMT12 og -EMT14 forhold til epitelial PC3-Epi. VD-II -. Gene signatur fra VD-jeg krysses med signaturen til ZEB1 forstummet celler PC3-EMT1 og -EMT14 bruker shRNA-SH4, i forhold til å rykke ut (SCR) kontroll shRNA
(D) Bright fase mikroskopi: PC3-EMT14 celler transfektert med ZEB1-shRNAs: sh2, SH4 eller Scr. Skala barer er 100 mikrometer
(E) Immun:.. Uttrykk av EMT markører i PC3-EMT1 og -EMT14 transfektert med ZEB1-shRNAs forhold til Scr eller ikke-transfektert kontroller
(F ) Heat kartet: 50 gener signatur identifisert i VD-II (panel C). Oppregulert gener er i rødt, nedregulert i blått. Brett endringer i mesenchymale kreftcellene står i forhold til epitelial PC3-Epi, og i SH4-transfekterte celler står i forhold til den Scr kontroll.
immunoblotter vises er representative for to uavhengige eksperimenter med lignende resultater. Se også figur S1 og tabell S1.
neste utviklet en mesenchymale modell fra PC3-Epi celler, gjennom samhandling med makrofager. Vi antok at dette ville være mulig fordi makrofager representerer en av de viktigste inflammatoriske celle-infiltrater i svulsten mikromiljøet, og de har vært implisert i metastase [15,16]. Co-kulturen i IL4-behandlede CD14 + monocytter (M2-makrofager) med PC3-Epi for fire dager indusert sterke morfologiske endringer i samsvar med EMT, med samtidig nedgang i uttrykket av E-cad og økning i vimentin (Tall S1A og S1B). Fra disse cellene vi isolert mesenchymale subpopulasjoner utpekt som PC3-EMT1, PC3-EMT2, PC3-EMT12, PC3-EMT14 og PC3-EMT17. Disse mesenchymale celler viste en slående fenotypisk endring og ekspresjon av ZEB1, som ble stabilt opprettholdt i kultur (figur 1A og 1B). Sammenlignet med de paren epiteliale PC3-epi de mesenchymale celler uttrykte lave nivåer av epithelial cell adhesion molecule EpCAM; imidlertid fortsatt ca 45% av cellene uttrykte EpCAM i celleoverflaten som demonstrert av flowcytometri (figur S1C).
For å vurdere genuttrykk endringer knyttet til EMT vi gjennomført tre microarray analyser, sammenligne PC3-EMT1, PC3-EMT12 og PC3-EMT14 til PC3-Epi. Vi identifiserte en signatur av 867 gener som viser endringer i uttrykket (ved 2 ganger eller mer) i alle tre sammenligninger, (VD-I, figur 1C). Vi brukte Oppfinnsomhet Pathway Analysis (Oppfinnsomhet Systems, www.ingenuity.com) for å fastslå de betydelig beriket molekylære funksjoner knyttet til denne signaturen: «cellulær bevegelse», «cellevekst og spredning «,» celle-til-celle signalisering og samspill » og «celledød «er alle i tråd med EMT (tabell S1). ZEB1, som er oppregulert i alle tre sammenligninger, har vært mye brukt i EMT og vedlikehold av mesenchymale tilstand [2,7]. Andre EMT-induserende transkripsjonsfaktorer som sneglen, Slug eller Twist1, ofte innblandet i tumorigenesis og metastase [2], ble ikke identifisert blant de vanligste EMT underskrift av 867 gener som er beskrevet ovenfor. Derfor å forstå hvilken rolle ZEB1 i EMT celle program, transfektert vi to mesenchymale linjer (PC3-EMT1 og PC3-EMT14) med en av to lentiviral ZEB1-shRNAs vektorer: sh2 og SH4, pluss egge kontroll (SCR). I samsvar med ZEB1 rolle i EMT og vedlikehold av mesenchymale staten, stanse av ZEB1 indusert MET i PC3-EMT1 og PC3-EMT14, med tilsvarende endringer i cellen morfologi (figur 1D). Videre sh2 og SH4 indusert en slående nedgang i ZEB1, tilsvarende oppregulering av E-cad (figur 1E). Disse eksperimentene sterkt at en vesentlig rolle ZEB1 i EMT tilstand av disse cellene. Når det sett av differensielt uttrykte gener i SH4-transfekterte celler ble matchet til EMT signatur (VD-I), fant vi uttrykk endringer i 50 gener som korrelerer med MET transformasjon (VD-II, figur 1C). Denne signaturen viste motsatt regulering når cellene ble transfektert med ZEB1-shRNA SH4, i forhold til det forvrengte kontroll (figur 1F). Denne tilnærmingen også identifisert et sett med 4 TFS betydelig nedregulert i mesenchymale celler og oppregulert ved ZEB1-shRNA. IRF6, ANKRD22, EHF og OVOL2
OVOL1 og OVOL2 regulere MET i prostatakreft modell
Gitt de observerte endringene i uttrykket av IRF6, ANKRD22, EHF og OVOL2 i EMT, samt den observerte tilbakemeldinger mellom ZEB1 og disse TFS, spekulerte vi at de stabile EMT egenskapene opprettholdes under overføring av PC3-EMT1 og PC3-EMT14 celler er et resultat av en regulerende feedback-loop. Like, siden disse genene ble nedregulert i EMT, overekspresjon dem kan indusere MET. Vi vurderte rollen til hver av de 4 oppreguleres TF’er enkeltvis ved transduse PC3-celler EMT14 med lentiviral overuttrykker konstruksjoner. Uttrykket av disse 4 TFS i EMT celler viste at OVOL2 syntes å regulere MET, som observert av en endring i celle morfologi. Gitt de sterke paralleller mellom OVOL2 og OVOL1, samt OVOL2 tilsynelatende rolle i MET, vi videre vurderes om OVOL1 kan ha en rolle i MET. Selv OVOL1 ikke oppfyller to ganger terskel for å bli inkludert i microarray genet signaturen til ZEB1 knockdown-celler, qPCR analyse viste at det er sterkt oppregulert i epiteliale PC3-Epi celler og følge ZEB1 lyddemping i forhold til mesenchymale PC3- EMT14 (Figur 2A og figur S2A). Derfor har vi også undersøkt uttrykk for OVOL1 i mesenkymale PC3-EMT14 celler. Overekspresjon av både OVOL1 og OVOL2 induserte en markert forandring av cellemorfologi og en parallell økning i E-CAD uttrykket (figur 2B og 2C). Videre begge OVOLs økt uttrykk av ESRP1 (figur 2C, venstre panel) [17]. Ved qPCR vi deretter analysert endringer i uttrykket av flere EMT-induserende transkripsjonsfaktorer: ZEB1, ZEB2, snegle, Slug og Twist1 (figur 2C, panel høyre). Blant disse faktorene ZEB1, ZEB2 og Slug viste en betydelig nedgang i ekspresjon, som korrelerer med MET. Vi bekreftet at uttrykket endringer sett i OVOL1 og OVOL2 tilsvare endringer i protein nivåer av Western blot (figur 2D). Vi deretter sammenlignet cellelysater fra OVOL1 og OVOL2-overekspresjon celler til PC3-Epi, PC3-EMT14-EV, og celler som overuttrykker TFS IRF6 og ANKRD22, også regulert av ZEB1 (figur 1F). Redning av E-cad og tap av vimentin ble indusert i begge OVOL-overekspresjon celler, mens ingen signifikant endring ble observert i cellene uttrykker annet TFS (IRF6 og ANKRD22) (figur 2E). Selv qPCR reflekterte en betydelig endring i Slug uttrykk, gjorde den vestlige ikke viser en endring på proteinnivået i OVOL overekspresjon celler, noe som tyder på at translasjonsforskning regulering kan spille en rolle i Slug nivåer. Av de fem TFS testet disse resultatene indikerer at OVOL1 og OVOL2 er sentrale indusere av MET i disse cellene
(A) qPCR.. MRNA uttrykk i PC3-EMT14-SH4 forhold til PC3-EMT14-Scr
(B) Bright-fase mikroskopi: PC3-EMT14 celler som uttrykker OVOL1 og OVOL2 utstillings en epitelial fenotype i forhold til foreldre PC3-EMT14. Skala barer er 100 mikrometer
(C) qPCR. Uttrykk for de epiteliale cellemarkører E-cad og ESRP1, og EMT-induserende TFS ZEB1, ZEB2, Slug, sneglen, og Twist1 i PC3-EMT14 celler uttrykke OVOL1 og OVOL2 forhold til tom-vektor (EV) kontroll
(D) Immun:.. OVOL1 og OVOL2 protein uttrykk i transfekterte celler ble bekreftet ved hjelp OVOL1 eller V5-spesifikke antistoffer, henholdsvis
(E) Immun: uttrykk for epitelial markør E-cad og mesenchymale markører ZEB1 og vimentin. Endringer i Slug uttrykk var minimal og ikke korrelerer med MET. PC3-EMT14 celler som uttrykker IRF6 eller ANKRD22, EV og epitel PC3-Epi er kontroller
(F) Invasion /migrasjon analysen. Representative bilder og grafer av kreftcelle invasjon ved hjelp av en Boyden kammer analysen. Søylediagrammer av OVOL1 og OVOL2 uttrykker PC3-EMT14 celler relative EV. Prosent invasjonen representerer forholdet invaderende /trekkende celler. Grafen er representant for en av tre uavhengige forsøk
(G) qPCR. Uttrykk for PC3-Epi celler transfektert med OVOL1-shRNAs (a, b, c) eller OVOL2-shRNAs (d, e, f), i forhold til den ikke-lyddemping kontroll PC3-Epi-NS (representert ved den stiplede linje)
(H) Immunoblot:. PC3-epi-celler transfektert med både OVOL1 og OVOL2 shRNAs (sh-OVOL1 /2) viser en nedgang i E-cad og økning i vimentin, noe som antyder en delvis EMT transformasjon
(i) Skjematisk. den ZEB1 arrangøren med potensielle OVOL2 bindingsseter (oransje trekanter) i henhold til den generelle konsensus: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A). Designet TAQMAN primer-par er vist som svarte piler. Nummerering er i forhold til transkripsjonsstartsetet (1). Sekvensen av en antatt OVOL2 bindingssete som tilsvarer chip DNA i OVOL2 uttrykker cellene er på 320
(J) ChIP qPCR. (Venstre) viser inngangs kromatin av PC3-EMT14-OVOL2 forhold til EV, og viser at tilsvarende mengder DNA ble brukt (høyre). skildrer chip DNA ved hjelp OVOL2 antistoff. Grunning er oppkalt etter deres fremover primer (se panel I). Resultater ble normalisert til inngangskontroll. Grafen viser en representant eksperiment av tre med lignende resultater.
qPCR resultatene ble normalisert til p aktin. Grafene viser gjennomsnittet +/- sem; p-verdier er representert som * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. De qPCRs og immunoblotter er representative for to uavhengige eksperimenter med lignende resultater. Se også Figur S2.
For å forstå implikasjonen av OVOL-mediert MET i invasiv potensialet i mesenchymale PC3-EMT14 celler, brukte vi Boyden kammeret analysen på celler som overuttrykker OVOL1 /2. Begge OVOLs påvirket betydelig invasjonen kapasitet på PC3-EMT14. I tilfelle av OVOL1, observerte vi redusert cellemigrering, som påvirkes av forholdet mellom invasjon vs. migrasjon (invasjon index) (figur 2F). OVOL2 overekspresjon celler viser en signifikant nedgang i både invasjon og migrasjon, med en svært redusert invasjon indeksen. Disse resultatene støtter rollen OVOL1 og OVOL2 i å redusere migrasjon og invasjon, som forventet for MET omprogrammeres celler.
neste brukte shRNAs for OVOL1 (shOVOL1-a-b, -c) og OVOL2 (shOVOL2- d, -e, -f), for å redusere deres uttrykk i epitelceller PC3-Epi celler (figur 2G). Ingen av shRNAs påvirket E-cad uttrykk. Men i celler med nedsatt OVOL2 uttrykk, observerte vi en signifikant oppregulering (opptil tre ganger) av ZEB1 mRNA. Disse resultater antyder at et 3-gangers forandring i ZEB1 uttrykk er ikke tilstrekkelig til å indusere EMT i PC3-epi-celler. Videre, som observert av qPCR, er et uttrykk for ZEB1 over 20 ganger høyere i PC3-EMT14 sammenlignet med PC3-epi-celler (Figur S2A). Videre gis det tilsvarende funksjon av OVOL1 og OVOL2 i induksjon av MET det er fristende å spekulere i at de kunne erstatte hverandre. Dette kan forklare hvorfor en knockdown av bare én av OVOL er ikke tilstrekkelig til å indusere en betydelig endring i E-cad. For å teste denne muligheten vi utført en dobbel knockdown med shRNAs for hver av de OVOL-TFS. Selv om ingen utvalg av transfekterte celler var mulig (både shRNA konstruerer uttrykt GFP), en total populasjon av celler transfektert med shOVOL1-en og shOVOL2-d (shOVOL1 /2-a /d) viser en signifikant oppregulering av vimentin og en delvis reduksjon i E-cad sammenlignet med kontroll PC3-Epi-NS-celler (Figur 2 H). Samlet disse funnene tyder på en avgjørende rolle både OVOLs i å opprettholde den epiteliale tilstand av disse cellene, og derfor vil en dobbel knockdown være nødvendig for å indusere og opprettholde den mesenchymale tilstand. Følgelig ville en større knockdown av OVOL1 og OVOL2 indusere en mer komplett EMT transformasjon i kreftceller.
Andre eksperimenter i prostatakreftceller indusert til å gjennomgå EMT førte til lignende resultater angående regulering av OVOL og ZEB1 TFS. For eksempel ble den transmembranprotein Tetraspanin-8 (TSPAN8) identifisert i signaturen vist i figur 1F som et gen oppregulert i EMT-celler og nedregulert ved ZEB1-shRNA. Overekspresjon av TSPAN8 i epiteliale PC3-Epi og DU145 cellene ført til delvis EMT transformasjon preget av oppregulering av ZEB1 og nedregulering av OVOL TFS i begge cellelinjer (figur S2B-E).
En transkripsjonen repressor funksjon av OVOL2 ble tidligere vist i keratinocytter, hvor OVOL2 trykt c-myc og Notch1 [18]. Siden ZEB1 uttrykk betydelig økt i celler med redusert OVOL2 (figur 2G), testet vi om OVOL2 direkte samhandler med ZEB1 promoter. Vi utførte kromatin immunoprecipitation (chip) rettet mot ZEB1 promoter i PC3-EMT14-OVOL2 og kontrollceller med to antistoffer, anti-OVOL2 og anti-V5-tag. Vi har utformet 7 TAQMAN primere og prober som spenner arrangøren -4848 til 530 bp (figur 2I) og funnet flere potensielle OVOL2 bindingsseter: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A) [18]. Med begge antistoffer, vi observert over 50 gangers anrikning for den samme primer /probe-stilling (+ 382 /+ 530) ved sammenligning OVOL2-uttrykkende og kontrollceller (figur 2J, og Figur S2B). I kontrast, inngangs kromatin av begge celletyper viste lignende forsterkning med alle primer-par. Disse resultatene indikerer spesifikk binding av OVOL2 til ZEB1 arrangøren på 325-regionen, hvor man OVOL2 konsensus nettstedet ble identifisert (figur 2I). I tillegg, siden ingen spesifikk kromatin fragment ble amplifisert med -115 /+ 29 primere, er det usannsynlig at OVOL2 binder seg til 115 området, en annen potensiell område i den proksimale regionen (figur 2I). Fragment 123 – (- 115) = 238 bp er betydelig mindre enn 530 – (115) = 415 bp; men omtrent samme størrelse som + 530 – (325) = + 205 bp. Derfor er en binding til 115 området ville innebære en bestemt rullegardin av en kromatin fragment som skal bli detektert med -115 /+ 29 primere. Sammen med shRNA og uttrykk data, disse funnene tyder på at OVOL2 fungerer som en direkte transcriptional repressor av ZEB1.
mesenchymalceller danne mesenchymale tumorer in vivo
For å bestemme tumorigent potensialet i PC3-EMT12 og PC3-EMT14, vi subkutant inokulert immunsupprimerte NSG mus. Begge mesenchymale kreft cellelinjer dannet overveiende mesenchymale-type tumorer preget av lav E-cad og høy ZEB1, mens PC3-Epi svulster viste høy E-cad og lav ZEB1 uttrykk (figur S3A). Vi så ingen signifikante forskjeller i kreftvekstrater mellom gruppene (figur S3b). For å vurdere den metastatisk potensial av mesenchymale celler, vi brukte intrakardial injeksjon (ICI) musemodell for kreft metastase [19]. Vi observerte flere mus med spredning i flere områder i gruppene injisert med PC3-EMT12 eller PC3-EMT14 celler (figur 3A). De viste også en høyere samlet tumorbelastning (omtrent en størrelsesorden) og redusert overlevelse mus, sammenlignet med mus injisert med foreldre PC3-epi-celler (figur 3b og figur S3C). Samtidig farging med E-cad og ZEB1 antistoffer vist at metastatisk PC3-EMT12 og PC3-EMT14 svulster vises typiske mesenchymale egenskaper (lav E-cad og høy ZEB1), mens metastatiske svulster fra PC3-Epi celler vises hovedsakelig epitelceller egenskaper (høy E- cad og lav ZEB1) (Figur 3C og Figur S3D-E). Våre funn tyder på at mesenchymale celler (PC3-EMT12 og PC3-EMT14) til andre organer som opprettholder mesenchymale fenotype. Spesielt, noen metastatiske svulster fra PC3-epi-celler oppviste både mesenchymale og epitel-egenskaper, selv om et flertall av PC3-tumorer Epi viste epiteliale fenotypen (figur 3C). Figur 3C viser en mus injisert med PC3-epi-celler, hvor en tumor i venstre femur var overveiende mesenchymale typen, mens svulsten i den høyre viste et høyt epitelial fenotype. Viktigere, har vi funnet lignende mesenchymale-epitelceller plastisitet i en metastatisk svulst isolert fra femur av en pasient med avansert prostatakreft. IHC farging av tumorsnitt med E-cad og ZEB1 antistoffer viste regioner med både høyt epitel (høy E-cad, lav ZEB1) og med mesenchymale egenskaper (lav E-cad og høy ZEB1) (Figur 3D).
(A) Metastase. andelen ICI-inokulert mus med flere luciferasepreparater signaler på 21 og 35 dager
(B) Tumor byrde: mus fikk ICI og ble fotografert ukentlig i 35 dager. Luciferase uttrykk er representert som områder av interesse (ROI-fotoner /s)
(C) IHC. Samtidig ZEB1 og E-cad farging av metastaser påvist i femur og lever av PC3-Epi eller PC3-EMT14 injisert mus. Legg merke til mesenchymale (ZEB1
høy /E-cad
Lav) (svarte piler) og epitelceller (ZEB1
lav /E-cad
høy) (grønne piler) kreftceller, som skildrer den EMT /MET plastisitet i subpopulasjoner av PC3-Epi og PC3-EMT14. Skala barer er 100 mikrometer (sort) og 20 mikrometer (rød)
(D) IHC. ZEB1 eller E-cad farging av metastaser fra femur av en pasient med avansert prostatakreft. Legg merke til mesenchymale-lignende (ZEB1
høye (svarte piler) /E-cad
lav (gule piler)) og epitel (ZEB1
lav /E-cad
høy (grønne piler)) kreft celler. Skala barer vist representerer 100 mikrometer (sort strek) og 50 mikrometer (rød strek)
(E) Metastase:.. Andelen ICI-inokulert mus med flere luciferasepreparater signaler på 21 og 35 dager
(F) Tumor byrde: Mus fikk ICI og ble fotografert ukentlig i 35 dager. Luciferaseekspresjon er avbildet som områder av interesse (ROI-fotoner /s)
(G) IHC. ZEB1 eller E-cad farging av metastaser i ICI-mus. Legg merke til høyere E-cad og lavere ZEB1 uttrykk i de metastatiske celler uttrykker OVOL1 eller ZEB1-shRNA (SH4). Scale bar representerer 100 mikrometer
Grafer viser gjennomsnittet +/- sem.; p-verdier ble beregnet og representert som * p 0,05; ** P 0,01. Alle IHC bildene er representant for en av tre seksjoner som viser lignende resultater. Se også figur S3.
I henhold til resultatene som er vist i Figur 2B-E, effekten av OVOL1 overekspresjon er lik OVOL2. Begge indusere MET og ZEB1 downregulation. I tillegg ZEB1-shRNA induserer uttrykk for både OVOL1 og OVOL2 og MET i mesenkymale PC3-EMT14 celler (figur 2A). Å belyse rollen OVOL TFS i metastatisk potensial av cellene, podet vi mus via ICI med epitelceller overekspresjon OVOL1 (PC3-EMT14-OVOL1), ZEB1-shRNA (PC3-EMT14-SH4) eller egge kontroll (PC3- EMT14-Scr). Vi vurderte tumorprogresjon ved bioluminescence og observerte at indusert MET i PC3-EMT14 cellene betydelig redusert metastatisk potensial. Både ZEB1-shRNA og OVOL1 uttrykk redusert antall mus med metastase i flere områder (Figur 3E). Videre er den totale tumorbyrde falt betydelig sammenlignet med mus injisert med PC3-EMT14-Scr kontrollceller (Figur 3F). IHC farging av metastatiske svulster med E-cad og ZEB1 avslørte at MET hadde oppstått i tumorceller som uttrykker OVOL1 eller ZEB1-shRNA, som indikert av positive E-cad og senket ZEB1 uttrykk i kontrast til de mesenchymale kontrollcellene (Figur 3G).
OVOL-indusert MET reduserer metastatisk potensial av mesenchymale kreftceller
for ytterligere å undersøke metastatisk potensialet i OVOL-uttrykke celler, vi brukte en orthotopic musemodell for prostatakreft [20]. I bioluminesens analyse, så vi en tilsvarende total tumorbyrde (Rois) i alle grupper (figur 4A). Tjueåtte dager etter inokulering, antall mus med metastaser var signifikant lavere i gruppen injisert med OVOL-uttrykkende celler (figur 4B og 4C). Vi resected primære svulster 42 dager etter vaksinasjonen, innspilt deres vekter, og analysert tumorsnitt av IHC. Ortotopiske prostata tumorvekt var signifikant høyere i mus inokulert med PC3-EMT14-OVOL2, mens mus injisert med kontroll PC3-EMT14 celler viste de laveste vektene (figur 4D). Den observerte nedgangen i metastatisk potensial for OVOL-uttrykke celler i vår modell korrelerer med en tidligere rapport som viser at mus med større ortotopiske prostatakreft hadde en redusert metastatisk belastning [20]
(A) Tumor byrde. Luciferaseekspresjon er avbildet som områder av interesse (ROI-fotoner /s) i mus med ortotopiske injeksjoner
(B) Metastase:. (Venstre) andelen orthotopically inokulert mus med flere luciferasepreparater signaler på 21 og 28 dager (Høyre ). viser det totale antall metastaser per gruppe dividert med antall mus (n) i hver gruppe på 28 dager
(C) Imaging:. Representative bilder av luciferase-ekspresjon i mus 28 dager etter å ha mottatt ortotopiske injeksjoner. . Metastaser for hver gruppe er markert med rødt i enten ventral eller ryggbilder og unntatt de som mistenkes for å tilsvare samme svulst
(D) Tumor Vekt: De gjennomsnittlige vektene til ortotopiske (prostata) svulster resected på 42 dager (n = 4)
(E) IHC. E-cad, og ZEB1 farging av metastatiske svulster hos mus som fikk ortotopiske injeksjoner fra hver gruppe inokulert med OVOL uttrykker celler eller kontroll PC3-EMT14. Legg merke til høyere E-cad og lavere ZEB1 uttrykk i OVOL-uttrykke kreftceller. Scale bar representerer 100 mikrometer. IHC viser en representant farging av én av tre seksjoner med lignende resultater
Grafer viser gjennomsnittet +/- sem.; p-verdier ble beregnet og representert som ** p 0,01. Se også Figur S4.
IHC farging av svulstene viste at PC3-EMT14 tumorer (ortotopiske og metastaser) er overveiende mesenchymale og er stort sett negative for E-cad uttrykk og positivt for ZEB1 (Figur 4E og Figur S4A). Disse mesenchymale celler kan spre seg og danne metastaser. Dette ble ytterligere demonstrert ved Ki67-positiv farging av E-DAK-negative celler i metastatiske tumorsnitt av PC3-EMT14 mus (figur S4B). Selv om vi ikke kan utelukke muligheten for forbigående MET fulgt av EMT, disse funnene tyder på at mesenchymalceller ikke trenger å gjennomgå MET å kolonisere svulsten. I motsetning til dette OVOL-uttrykkende celler som dannes ortotopiske tumorer og metastaser med sterk epitelial fenotype, som kjennetegnes ved høy ekspresjon av E-cad og senkes ZEB1; som sterkt antyder at OVOL-TFS indusere og stabilisere MET i disse cellene (Figur 4E og Figur S4A).
OVOL TFS orkestrere en transkripsjonen og spleising regulerende program som induserer MET i humane kreftceller
neste sett for konsistente resultater ved bruk av vev-cDNA arrays fra deler av menneskelige prostata kreftsvulster (n = 40), ved å evaluere uttrykk for E-cad, OVOL1, og OVOL2. For å demonstrere korrelasjonen mellom E-cad og OVOL-uttrykk vi normalisert hver prøve verdien til gjennomsnittsverdien for alle tumorprøver. Vi observerte sterk sammenheng mellom E-cad og OVOL1 (r = 0,66) og OVOL2 (r = 0,7) i alle testede prostata tumorvev (figur 5A)
(A) qPCR. CDNA fra human primær prostatakreft vev (n = 40; Origene) ble analysert for ekspresjon av E-CAD, OVOL1 og OVOL2. Resultatene ble normalisert til p-aktin og vist i forhold til gjennomsnittet av alle kreftprøver for hvert gen som:.
log ((verdi av Gene (X) for en prøve) /(Verdien av Gene (X ) for Gjennomsnittlig Cancer)). Prøve verdier er vist i prikkplotter og korrelasjonen av OVOL1 eller OVOL2 uttrykk med E-cad ble beregnet (r). Grafen viser et representativt eksperiment ut av to med samme resultat
(B) Venn-diagram. Skildrer RNA-seq resultatene av forskjellig uttrykt gener felles i OVOL uttrykker celler og PC3-Epi, i forhold til PC3- EMT14. Skjæringspunktet mellom A og B representerer en felles epitelial transcriptional signatur av 277 gener. RNA-seq data ble analysert fra minst to biologiske replikater for hver cellelinje
(C) Dot plottet.: Ekspresjon korrelasjonsanalyser av 277 genene som er identifisert i den epiteliale signatur fra panel (B). Korrelasjonen er avbildet mellom PC3-Epi, PC3-EMT14-OVOL1 eller PC3-EMT14-OVOL2
(D) Venn-diagram. Sammenligner resultatene fra panelet (B) med gener som korrelerer med uttrykket av OVOLs i 917 humane kreftcellelinjer. Fra de 129 genene som korrelerte (r 0,5) med OVOLs uttrykk i de 917 kreftcellelinjer, er 67 gener indusert av uttrykket av både OVOL1 og OVOL2 i PC3-EMT14 (C krysset D)
(E) Heat kartet: ConceptGen analyse av 67 gen-signatur fra panel (D) viste en liste over 18 kommenterte gener med funksjoner relatert til epithelial tilstand av cellene
(F) Tabell:. 45 gener negativt korrelert med OVOL2 uttrykk (r -0,5) over 917 cancercellelinjer. §§2.086.13/4.812.91/2.31+NM_016351ADAM221.000.400.4+NM_014324AMACR5.292.350.45+NR_036556ANKRD540.9900+NM_001010986ATP11C4.321.500.35+NM_174957ATP2A30.2600+NR_024597C11orf7300.46INF+NM_001001389CD440.395.1313.20+NM_001185177CES300.31INF+NM_203356CTAGE50.550.130.24+NM_001085460CTNND112.895.420.42+NM_133375DIS3L1.5000+NM_004432ELAVL21.450.370.26+NM_001135023ELMOD3*0.352.497.06+NM_001135022ELMOD3*3.761.850.49+NM_203343EPB4100.97INF+NM_001184939EPB41L5*1.493.662.47+NM_020909EPB41L5*1.740.620.36+NM_017848FAM120C1.860.920.5+NM_001015045FAM13A3.331.560.47+NM_001134456FAM55C5.552.650.48+NM_000802FOLR10.060.325.44+NM_001018100GCOM11.144.523.96+NM_001193322IKBKE0.9000+NM_016291IP6K26.1000+NM_177535_1MAGED4B9.113.070.34+NM_145687MAP4K422.7410.810.48+NM_001042453MST400.31INF+NM_022764MTHFSD1.670.750.45+NM_203318MYO18A2.385.782.43+NM_001098623OBSCN0.220.673+NM_001128629PAK63.016.252.07+NM_001166109PALLD1.846.803.69+NM_001146105PARP95.5311.412.06+NM_001184917PCYT21.103.142.85+NM_153321PMP2213.015.040.39+NM_182948PRKACB3.740.900.24+NM_001164758PRKAR1B*1.404.293.06+NM_001164759PRKAR1B*5.132.190.42+NM_002840PTPRF1.696.523.85+NM_144489RGS35.161.430.28+NM_138484SGOL100.41INF+NM_001135054SIGIRR15.506.130.4+NM_020428SLC44A2*5.8922.833.88+NM_001145056SLC44A2*28.715.320.19+NM_001104590SLFN111.800.600.33+NM_001184749SLITRK40.280.090.32+NM_001128210SPRED24.300.370.09+NM_001198531TCF7L22.050.740.36+NM_001167912VEPH14.4100+NM_014667VGLL42.556.172.41+NM_139119YY1AP12.084.912.36+NM_001145448ZNF2000.500.150.3+Table
