Abstract
Cisplatin er vanligvis brukes i eggstokkreft kjemoterapi, men chemoresistance til cisplatin er fortsatt en stor klinisk utfordring. Onkogene Transkripsjonsfaktor FOXM1 har blitt rapportert å være overuttrykt i eggstokkreft. I denne studien ønsket vi å undersøke potensialet rolle FOXM1 i eggstokkreft med chemoresistance til cisplatin. Våre resultater indikerer at FOXM1 er oppregulert i kjemoresistent eggstokkreft prøver, og forsvarer eggstokkreft celler mot cytotoksisitet av cisplatin. FOXM1 forenkler DNA-reparasjon gjennom å regulere direkte transkripsjonen mål EXO1 å beskytte eggstokkreft celler fra cisplatin-mediert apoptose. Demping FOXM1 og EXO1 uttrykk av små interfererende RNA, forsterker kjemoterapi effekt mot kreft i eggstokkene. Våre funn tyder på at målretting FOXM1 og målet genet EXO1 kan forbedre cisplatin effekt på kreft i eggstokkene, som bekrefter deres rolle i moduler cisplatin følsomhet
Citation. Zhou J, Wang Y, Wang Y, Yin X, han Y, chen L, et al. (2014) FOXM1 modulerer Cisplatin Følsomhet ved å regulere EXO1 i eggstokkreft. PLoS ONE 9 (5): e96989. doi: 10,1371 /journal.pone.0096989
Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center i San Antonio, USA
mottatt: 31 oktober 2013; Godkjent: 14 april 2014; Publisert: 13. mai 2014
Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. I utrette av dette manuskriptet, har forfatterne fått støtte fra Natural Science Foundation National of China (Grant No. 81272882,81302275, 81072137) og Shanghai Committee of Science and Technology (Grant nr 12411950200). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreftform i verden, med 225,500 nye tilfeller og 140,200 dødsfall anslått for 2008 [1]. De fleste kvinner med ovarialcancer (EOC) til stede med avansert sykdom (stadium III eller IV) ved diagnosetidspunktet. Nåværende standard behandling av ovarialcancer, både tidlige og avanserte stadier, består av fullstendig cytoreduktiv kirurgi etterfulgt av kjemoterapi, vanligvis basert på et platina og taksan dublett [2]. Men utviklingen av chemoresistance fortsatt presenterer et stort hinder for vellykket behandling. De fleste pasientene bukke under for chemoresistance og tilbakefall, og den samlede fem års overlevelse er ca 31% [3]. En bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for cisplatin motstand kan føre til nye antitumor strategier som vil sensitize svarer eggstokkreft til cisplatin-basert kjemoterapi.
Pattedyr transkripsjonsfaktor gaffelhode Box M1 (FOXM1) tilhører en stor familie av gaffelhode transkripsjonsfaktorer. Gaffelhodefamiliemedlemmer er involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert embryogenese, proliferasjon, differensiering, apoptose, transformasjon, tumorgenese, lang levetid, og metabolsk homeostase [4]. I motsetning til de andre FOX-transkripsjonsfaktorer, er FOXM1 assosiert med celleproliferasjon og er overuttrykt i kreft. For eksempel, genekspresjonsprofiler i karsinomer, inkludert prostata, bryst, lunge, eggstokk, tarm, bukspyttkjertel, mage, blære, eggstokk, lever og nyre, avslørte at FOXM1 blir overuttrykt på alle karsinomer [5] – [9]. Overekspresjon av FOXM1 i forskjellige tumorer indikerer en sterk avhengighet av tumorcellene på FOXM1 [10]. Videre, i eggstokkreft, den integrerte pathway analyse viste at FOXM1 transkripsjonsfaktor nettverk er vesentlig endret i 87% av høyverdig serøs eggstokkreft [11]. FOXM1 fremmer celle proliferasjon, migrering og invasjon i eggstokk-kreft [12]. FOXM1 har også vist seg å spille en avgjørende rolle i narkotika respons og motstand. For eksempel har det blitt vist at deregulert FOXM1 uttrykket kan gi resistens mot kjemoterapeutiske medikamenter, såsom cisplatin og epirubicin [13], og beskytte cancerceller mot DNA-skade indusert celledød i brystkreft [14]. Imidlertid gjenstår det unnvikende om FOXM1 spille en tilsvarende rolle ansvarlig for givende cisplatin motstand i eggstokkreft.
EXO1 er et protein med 5 «til 3» eksonuklease aktivitet samt en RNase H aktivitet, som interagerer med MSH2 og som er involvert i mismatch reparasjon og rekombinasjon [15], [16]. Fersk undersøkelse viser at EXO1 bidrar til induksjon av DNA-skader sjekkpunkter og deltar i DNA-skade reparasjon [17], [18].
I denne studien, gir vi bevisene som FOXM1 og dens direkte nedstrøms DNA-reparasjon gen EXO1 kan spille i å øke overlevelsen av eggstokkreft celler etter cisplatin behandling, og målretting FOXM1 /EXO1 akse kan bevisstgjøre eggstokkreft celle til cisplatin behandling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
de protokoller for håndtering parafininnstøpte ovarialcancer prøver og analysere pasientdata ble godkjent av de etiske komiteer av Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Skriftlig informert samtykke ble undertegnet av hver registrerte pasient om hun fortsatt var i live eller hennes første-graders slektning om hun er død. Alle vevsprøver ble registrert av et saksnummer i databasen uten pasientens navn eller personlig informasjon som er angitt.
Immunohistochemistry
parafininnstøpte vevsprøver ble samlet inn fra 20 kvinner med primær ovarialcancer , stagesIIto IV, som hadde gjennomgått innledende kirurgi ved avdelingen for obstetrikk og gynekologi, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University mellom 2005-2008. Glassene ble deparaffinized, rehydrert og plassert i sitronsyrebuffer (pH 6,0, 0,1 M) for oppvarming i 10 min. Den endogen peroksidase-aktivitet ble deretter blokkert ved inkubasjon med 3% H
2o
2 i 10 min. Etterpå seksjoner ble inkubert med blokkeringsbuffer (Beyotime, Kina) i 1 time og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med FOXM1 antistoff (1:50, Santa Cruz). Etter en 10-minutters inkubering av biotinylert sekundært antistoff, ble platene igjen inkubert med streptavidin-peroksidase under de samme betingelser. Immunoreaksjonen ble deretter synliggjort ved inkubering med diaminobenzidin kromogen (DAB, Maixin-Bio, Kina) i 5 minutter. Til slutt ble lysbilder kontra med hematoxylin, dehydrert, ryddet og montert. Negative kontroller ble inkubert i blokkering buffer alene. Disse resultatene ble bare vurdert dersom disse kontrollprøvene viste en negativ farging.
Cellelinjer og kultur
Den menneskelige eggstokkreft cellelinjer A2780 og SKOV3 ble kjøpt fra Cell Bank av den kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina). Begge cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 (Hyclone, USA) supplert med 10% (v /v) bovint føtalt, 100 enheter /ml penicillin og 100 g /ml streptomycin og cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære innehold 5% CO2 /95% luft.
siRNA og plasmid transfeksjon og kotransfeksjonen
siRNA tomannsboliger ble utarbeidet av RiboBio (Guangzhou, Kina). SiRNA Sekvensen av sirnas var som følger: FOXM1 siRNA-1: 5′-GCCAAUCGUUCUCUGACAGAATT-3 «, siRNA-2: 5′-GGACCACUUUCCCUACUUUUUTT-3′ [19]. EXO1 siRNA-1: 5»-CAAGCCUAUUCUCGUAUUUTT-3 «, siRNA-2: 5′-UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCU-3′ [18]. Sekvensen til negativ kontroll (NC), var: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «. Transfeksjon eller co-transfeksjon av siRNA og plasmid ble utført i henhold til produsentens protokoll fra lipofectamin (Invitrogen).
Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol (Invitrogen), og cDNA ble syntetisert ved hjelp PrimerScript RT reagent Kit (Takara). For sanntids kvantitativ PCR, ble lik mengde cDNA lagt til SYBR premix EX Taq II (Takara) og kjøre i Stepone real-time PCR system (Applied Biosystems). Den sykle programmet var 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek. Hver prøve ble analysert i tre paralleller, og β-aktin ble benyttet som en endogen kontroll. Forover- og reversprimerne som ble brukt var som følger: FOXM1: 5′- GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3 «og 5′- GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3′, EXO1: 5»- CCTCGTGGCTCCCTATGAAG-3 «og 5′- AGGAGATCCGAGTCCTCTGTAA-3». PLK4: 5′- AAGCTCGACACTTCATGCACC-3 «og 5′- GCATTTTCAGTTGAGTTGCCAG-3». XRCC1: 5′- CCTTTGGCTTGAGTTTTGTACG-3 «og 5′- CCTCCTTCACACGGAACTGG-3». BRCA2: 5’TGCCTGAAAACCAGATGACTATC-3 «og 5’AGGCCAGCAAACTTCCGTTTA-3». Rad51: 5′- CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3 «og 5′- TTCTTTGGCGCATAGGCAACA-3». β-aktin. 5’CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 «og 5’CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3»
klonogene analysen
Etter transfeksjon av NC eller gen-spesifikke siRNA, cellene ble utsatt for den angitte konsentrasjonen av cisplatin i 1 time. Deretter ble cellene på nytt oppslemmet i friskt komplett medium og sådd ut i 6-brønners cellekulturplate i en tetthet av 500 celler /brønn. Etter inkubasjon ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2 /95% luft i 8-10 dager, ble mediet skiftet hver 3. dag. Ved slutten av kulturen, ble cellene farget med 1% metylenblått i 50% metanol i 20 min, vasket med vann, og kolonier (≥50 celler) ble tellet.
Western blot
celler ble lysert i RIPA-buffer med tillegg på PMSF proteaseinhibitor, etterfulgt av sentrifugering ved 14000 g i 10 min. Ved utgangen av sentrifugering, ble cellelysater samlet og proteinkonsentrasjonen av cellelysatene ble målt. Lik mengde av proteiner (10-20 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE, og overført til PVDF-membran (Millipore). Blottene ble deretter inkubert med primære antistoffer i 5% bovint serumalbumin /Tris-bufret saltvann Tween-20 ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time. Protein signaler ble påvist ved Odessey skanner. Antistoffene som brukes i denne studien inkluderte: human FOXM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology), fosfor-histon H2A.X (γH2AX, 1:1000, Cell Signaling Technology), caspase-3 (1:1000, Cell Signaling Technology) , EXO1 (1:100, Thermo Fisher Scienfitic), β-aktin (1:2000, Abcam).
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble målt ved Cell Counting Kit-8-analysen ( Dojindo Molecular Technologies). I korthet ble cellene sådd ut i en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn på 96-brønners plater og underkastet annen behandling. Etter 48 timers inkubering ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2/95% luft, ble prøvene inkubert i ytterligere 2 timer med CCK8 reagens. Absorbansen ble bestemt ved 450 nm ved hjelp FLx800 Fluorescence Mikro Reader (Biotek).
γH2AX immunfluorescens farging
A2780 og SKOV3 celler ble transfektert med NC eller gen-spesifikke siRNA. Etter 48 timer ble cellene deretter behandlet med den angitte konsentrasjon av cisplatin i 1 time, og friskt medium ble endret. 24 timer senere ble cellene utsatt for anti-γH2AX (Ser139) farging. I korthet ble cellene fiksert med 10% formalin i 15 min, deretter permeabilisert med 0,1% Triton-100 i 10% FCS i 10 min. Prøvene ble blokkert med 5% geiteserum i 10% FCS i 1 time og deretter inkubert over natt med primært kanin-anti-γH2AX (Ser139, 1:400, Cell Signaling). Etter vaskinger med PBS, sekundært geite-anti-kanin-IgG-TRITC (1:400; Sigma-Aldrich) ble tilsatt til prøvene i 1 time. Celler ble kontra med DAPI før montering. Bilder ble tatt ved hjelp av en laserskanning Confocal mikroskop TCS SP5 (Leica). For kvantifisering foci ble celler med større enn 10 foci regnet som positiv i henhold til standard prosedyre [20]. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Flowcytometri
Apoptose ble exmamined av flowcytometrisk analyse av Annexin V og PI farging (BD) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, når den indikerte behandling ble cellene resuspendert ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml, ble deretter 5 ul av FITC-annexin V og 5 ul PI tilsatt til 1 x 10
5-celler (100 ul) og cellene ble inkubert ved romtemperatur i 15 min. Etter inkubasjon ble celler analysert ved flow-cytometer FC500 /FC500-MPL (Beckman Coulter). For cellesyklusanalyse, ble cellene trypsinert, pelletert, og deretter resuspendert i propidiumjodid-løsning (50 ug /ml propidiumjodid, 0,1 mg /ml RNaseA, og 0,05% Triton-X). Alle reagenser ble anskaffet fra Sigma. Etter 40 min inkubering ble celler analysert ved FC500 /FC500-MPL.
Chromatin immunoutfelling assay
Chromatin immunoutfellingsstudier (chip) Forsøkene ble utført som tidligere beskrevet [21]. 24 timer etter behandling med cisplatin, ble cellene fiksert i 1% formaldehyd i 10 min for å tillate tverrbinding, og deretter stoppet med glycin. Celler ble oppsamlet og lysert i SDS-lyseringsbuffer. Lysat ble ultralyd, pre-ryddet, inkuberes med antistoffer, og samlet med Protein-A + G agarose /laks Sperm DNA. DNA-protein-tverrbindinger ble snudd og kromatin DNA ble renset og underkastet PCR-analyse. Primerne 5′-AAA TCT GGC AAC CCT ACC TCA-3 «og 5» TTA AGT GTG CCT GTC AGT TCC-3 «ble brukt til å forsterke EXO1 FHRE1 holdige region (-1934 /-1575), og primere 5»-CAA TTT CGA TTT GTA GAG GCA AC-3 «og 5» CGG CTT CCA ACT CAT AGG GT-3 «ble brukt til å forsterke FHRE2 holdige region (-459 /-74). Etter amplifikasjon ble PCR produktene løst på agarosegel visualisert ved GelRed (Biotium).
Arrangør journalister og luciferase analysene
EXO1 promoter-regionen ble PCR-forsterket fra genomisk DNA ekstrahert fra A2780 celler ved hjelp forover og bakover primere som inneholder Nhel og Hindi restriksjonsseter (5′-CTA GCT AGC AGG ACC AAA GAG CCA TCA CA-3 «og 5» CCC AAG CTT CAC GGG TAA CTT GCC TAC ACA 3 «). Etter restriksjonsspaltning ble fragmentet klonet i den PGL-tre grunnleggende reporter-gen vektor for å genererte EXO1 promoteren konstruksjon, pGL3-promoter FHER2 konstruere -490 /-148 ble klonet ved hjelp av PCR (primere: 5»-CTA GCT AGC AAA GAA CCC AGC GTG AAC TGA-3 «, 5’CCC AAG CTT CAC GGG TAA CTT GCC TAC ACA 3»). Antatte gaffelhode nettstedet mutagenese ble utført ved hjelp av en seterettet mutagenese kit (Excell biologi). pGL3-Basic, pGL3-EXO1, villtype pGL3-FHRE2, villtype pGL3-FHRE2 pluss FOXM1 siRNA og mutant pGL3-FHRE2 ble transfektert til cellene henholdsvis. Transfekterte celler ble behandlet med cisplatin i 24 timer og deres luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved luciferase assay system (Promega).
Statistisk analyse
Vi brukte SPSS19.0 programvare for å beregne standardavvik og statistisk signifikant forskjeller mellom prøvene. Stjernene i hver graf viser statistisk signifikante endringer, med
P
verdier beregnet av Student
t
test som følger: *,
P
0,05; **,
P
≤0.01; ***,
P
≤0.001.
P
verdier av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1.. FOXM1 ekspresjon ble oppregulert på cisplatin-resistente eggstokkreft vev og celler
Tidligere har det blitt vist at FOXM1 er overuttrykt i eggstokk-kreft, og at overekspresjon FOXM1 ble signifikant korrelert med høy grad av eggstokk-kreft, noe som indikerer at FOXM1 kan spille en rolle i onkogent eggstokkreft [12]. Hittil har rollen som FOXM1 i cisplatin motstand av eggstokkreft ikke klarlagt. For å undersøke uttrykket av FOXM1 i cisplatin følsomme eller resistente eggstokkreft, ble eggstokkreft vevsprøver hentet fra 10 kvinner med tilbakevendende ovarialcancer i 6 måneder etter standardbehandling, og andre 10 kvinner som var kjemosensitiv. Alle pasientene fikk optimal cytoreduktiv kirurgi etterfulgt av 6 sykluser av systemisk kjemoterapi med en kombinasjon av cisplatin og paclitaxel. Blant de 10 kjemosensitiv pasienter, 7 av dem dukket opp igjen etter 12 måneder og tre av dem hadde ikke gjenta seg så langt. Alle lysbildene var fra eggstokkreft vev resected i den første operasjonen. De parafininnstøpte lysbilder ble immunohistochemically farget med FOXM1 antistoff og representative fargede objektglass ble vist i Fig.1A og Fig.1B. Moderat til høy FOXM1 uttrykk ble påvist i så mye som åtte av ti resistente tilfeller, men bare i 4 av 10 sensitive saker (Fig.1C). Deretter vi sammenlignet cisplatin motstand og FOXM1 ekspresjon i tre cellelinjer. SKOV3 som viste høy ekspresjon av FOXM1, var også den mest motstandsdyktige mot cisplatin, mens ES2, som var den mest følsomme overfor cisplatin, uttrykt FOXM1 på det laveste nivå (Fig.1D). Disse resultatene indikerer at cisplatin resistente eggstokkreft utstillinger høyere FOXM1 uttrykk i forhold til cisplatin sensitive eggstokkreft.
(A) Representant FOXM1 immunostained delen er vist fra kjemosensitiv pasientgruppen, (B) Representant FOXM1 immunostained delen er vist fra kjemoresistent pasientgruppen. (C) antall tilfeller med det angitte nivået av FOXM1 uttrykk i kjemosensitiv og kjemoresistent gruppen vises. (D) IC
50 verdier av ulike cellelinjer ble vist i det øvre panelet, og uttrykk for FOXM1 i cellen linjer ble vist i nedre panel.
2. FOXM1 er oppregulert i eggstokkreft celler etter cisplatin behandling
For ytterligere å bestemme uttrykket mønster av FOXM1 i eggstokkreft celler, vi behandlet A2780 og SKOV3 med ulike konsentrasjoner av cisplatin, og oppdaget mRNA nivået av FOXM1 økt bare litt etter cisplatin behandling (Fig.2A). Vi fant imidlertid at FOXM1 protein merkbart øket i en konsentrasjon og tidsavhengig måte i begge cellelinjer, og samsvarer med nivået for γH2AX (Fig.2B og Fig.S1), som er gullstandarden for DNA-skade kvantifisering [22 ]. Vi har også utført på /av-behandling av cisplatin, ble forhøyet nivå av FOXM1 protein observert i begge cellelinjer ved 24 timer etter behandling, og effekten opprettholdes inntil 96 timer (Fig.2C). Siden økt nivå av FOXM1 protein ikke korresponderer med økt nivå av FOXM1 mRNA, var det mulig at forhøyet FOXM1 protein ble i stor grad formidlet av protein stabilisering [23].
(A) A2780 og SKOV3 celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av cisplatin i 24 timer. Etter behandling ble FOXM1 mRNA transkripsjonsnivåer bestemt ved sanntids-PCR og p-aktin ble benyttet som en endogen kontroll. Hver kolonne og bar representerer gjennomsnitt ± s.d. av tre bestemmelser. (B) Cellelysater ble fremstilt etter den samme behandling som i (A), er løst ved hjelp av SDS-PAGE og utsatt for immunblotting-analyse under anvendelse av anti-FOXM1, anti-γH2AX, eller anti-β-aktin, respektivt. (C) A2780 og SKOV3-celler ble behandlet med 2 ug /ml og 4 pg /ml cisplatin i 12 timer henholdsvis, og deretter ble dyrket i friskt komplett medium for angitte tidspunkter (den tid da komplett medium ble tilsatt, ble angitt som 0-h) . Western blot ble utført for å bestemme ekspresjon av FOXM1 og β-aktin.
3. Målrette FOXM1 øker cisplatin følsomhet i eggstokkreft
Gitt at FOXM1 ble overuttrykt i eggstokkreft, og var videre oppregulert i respons til cisplatin behandling, hypotese vi at målretting FOXM1 kunne bevisstgjøre eggstokkreft celle til cisplatin. Vi transient transfektert to sirnas målretting FOXM1 i A2780 og SKOV3, både sirnas bemerkelsesverdig redusert FOXM1 uttrykk og siRNA-2 har en større lyddemping effekt i de to cellelinjer (Fig.3A og 3B). 48 timer etter siRNA-2-transfeksjon, ble cellene behandlet med den angitte konsentrasjon av cisplatin. Klonogene Analysen ble utført ved 1 time etter cisplatinbehandling, og cellulær levedyktighet ble målt ved anvendelse av en CCK8 assay ved 48 timer etter cisplatinbehandling. Som forventet, FOXM1 siRNA transfeksjon i A2780 og SKOV3 celler gjengis begge cellelinjene mer følsomme for cisplatin toksisitet, noe som gjenspeiles av en sammenligning av IC
50 verdier mellom rykke siRNA og FOXM1 siRNA-behandlede celler (~1.7 mikrogram /ml vs ~ 4,1 ug /ml i A2780, ~2.5 ug /ml vs ~6.1 ug /ml i SKOV3) (Fig.3C). Behandling med FOXM1 siRNA og cisplatin også resultert i betydelig reduksjon i A2780 og SKOV3 celle tall målt ved klonogene analysen (~17% vs ~45% i A2780, ~16% vs ~37% i SKOV3) (Fig.3D). I tillegg undersøkte vi om knockdown av FOXM1 ført til økt apoptose etter cisplatin behandling. Som vist i Fig.3E, cisplatin kombinert med FOXM1 siRNA resulterte i økt apoptose priser i begge cellelinjer (~18% vs ~38% i A2780, ~ 20% vs ~40% i SKOV3). Tilsvarende med apoptose analysen, western blot analyse viste også forbedret kløyvde caspase-3 etter samtidig behandling med FOXM1 siRNA og cisplatin (Fig.4A). Sammen er disse resultatene indikerer at målretting FOXM1 gir en strategi for sensibiliserende eggstokkreft til cisplatin.
A2780 og SKOV3 celler ble transient transfektert med siRNA (100 nM) rettet mot FOXM1. Kontrollceller ble forlatt utransfekterte eller negativ kontroll siRNA (100 nM) -transfected. 48 timer etter transfeksjon, ble FOXM1 mRNA nivå (A) og proteinnivå (B) bestemt ved sanntids-PCR og western-blotting, respektivt. Hver kolonne og bar representerer gjennomsnitt ± s.d. av tre bestemmelser. (C) 48 timer etter transfeksjon, A2780 og SKOV3-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin for en annen 48 timer og deres forekomst av levedyktighet ble målt ved CCK8 og sammenlignet med celler uten cisplatin behandling. (D) 48 timer etter transfeksjon siRNA, A2780 og SKVO3-celler ble behandlet i 1 time med 1 ug /ml og 2 ug /ml cisplatin, respektivt. Deretter ble cellene sådd ut i 6-brønns plate ble kolonier farget og tellet etter inkubering i 8-10 d. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter. Grafene tilveie kvantifisering som en prosentandel av de ikke-behandlede brønner. Hver kolonne og bar representerer gjennomsnitt ± s.d. av tre bestemmelser. (E) 48 timer etter transfeksjon, A2780 og SKOV3-celler ble behandlet i ytterligere 48 timer med 1 ug /ml og 2 ug /ml cisplatin, respektivt. Etter behandling, ble apoptose bestemt ved strømningscytometrisk analyse av Annexin V og PI farging. Høyre panel viser gjennomsnitt ± s.d. av tre uavhengige eksperimenter.
(A) 48 timer etter transfeksjon, A2780 og SKOV3-celler ble behandlet i 24 timer med 2 ug /ml og 4 pg /ml cisplatin, respektivt. Etter behandling ble cellelysater fremstilt, er løst ved hjelp av SDS-PAGE og underkastet immunobloting analyse av FOXM1, γH2AX, spaltet caspase-3 og β-aktin. (B) A2780 og SKOV3-celler med eller uten lyddemping av FOXM1 ekspresjon, ble behandlet med 1 pg /ml og 2 ug /ml cisplatin i 1 time, respektivt. γH2AX foci av A2780 og SKOV3-celler ble kvantifisert ved forskjellig tidspunkt: 24, 48 og 72 timer etter behandling med cisplatin. Andel γH2AX positive celler ble plottet. Ubehandlede celler ble brukt som kontroll.
4. FOXM1 banket ned resulterer i DNA-reparasjon mangel
Det er blitt rapportert at FOXM1 regulerte flere gener i DNA-reparasjon veien [14], [24], vi neste undersøkt om FOXM1 knock-down-celler ble utsatt for DNA pauser i eggstokkreft. For dette formål ble FOXM1 siRNA-behandlede celler og krypterings-behandlede celler ble behandlet med cisplatin, og western blotting-analyse ble utført 24 timer etter behandling. Spesielt økte γH2AX ble oppdaget i FOXM1 siRNA-behandlede celler etter samme behandling med cisplatin (Fig.4A). Videre har vi farget for γH2AX 24, 48 og 72 timer etter behandling med cisplatin. γH2AX foci per kjerne ble regnet i mer enn 100 celler i hvert tidspunkt. Resultatene ble uttrykt som prosent av γH2AX positive celler i hvert tidspunkt. FOXM1 siRNA-behandlede celler viste høy andel av ubehandlet DNA-skader (γH2AX positive celler) ved 48 h og 72 timer etter cisplatin behandling i forhold til å rykke ut-behandlede celler (Fig.4B). Derfor er disse data støtter konklusjonen i DNA-reparasjon mangel på FOXM1 siRNA-behandlede celler.
5. Screening for FOXM1 target gen som er involvert i cisplatin-indusert DSB reparasjon i eggstokkreft
Flere målgener av FOXM1, for eksempel
BRCA2
,
XRCC1
,
Rad51
,
EXO1
,
PLK4
, har blitt rapportert å være involvert i DNA reparasjon etter DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) [14], [24]. Resultatene bedt oss å avgjøre hvorvidt disse FOXM1 målgener mekle FOXM1-avhengig DNA reparasjon i eggstokkreft. QPCR ble anvendt for å bestemme den ekspresjonsprofilen av de ovennevnte gener etter cisplatinbehandling.
EXO1
mRNA viste den mest robuste endring og korresponderte med endring av FOXM1 protein etter cisplatin behandling i A2780 og SKOV3 (Fig.5A). De andre gener, men ble svakt eller moderat indusert etter den samme behandling (data ikke vist). Interessant, fant vi også at EXO1 protein ble ikke bare høyt uttrykt i A2780 og SKOV3 forhold til ES2 celle (Fig.S2A), men var oppregulert i en dose og tidsavhengig mote i A2780 og SKOV3 ved behandling med cisplatin, akkurat som FOXM1 protein (Fig.5B og Fig.S2B). ON /OFF behandling av cisplatin også resultert i økt uttrykk av EXO1 til 96 h (Fig.5C). Det var ikke overraskende at knockdown av FOXM1 ble fulgt av 60-70% reduksjon i EXO1 mRNA uttrykk (Fig.5D). Men gjorde FOXM1 banket ned ikke resultere i dyp cellesyklus arrest (Fig.S2D), noe som tyder på at reduksjon av EXO1 var ikke en indirekte effekt av cellesyklus endring. I tillegg FOXM1 tie ikke bare svekket EXO1 protein ekspresjon som reaksjon på behandling cisplatin (Fig.S2C), men også etter at AV /PÅ-cisplatin treate (Fig.5E). Disse resultatene indikerer at EXO1 er en kandidat målgen av FOXM1 i DNA-reparasjon banen i eggstokkreft.
A2780 og SKOV3-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av cisplatin til 24-time PCR-analyse (A) og western-blotting (B). Resultatene er vist fra tre uavhengige eksperimenter i tre paralleller. Kolonner, mener; barer, SD. (C) A2780 og SKOV3-celler ble behandlet med 2 ug /ml og 4 pg /ml cisplatin i 12 timer henholdsvis, og deretter ble dyrket i friskt komplett medium for angitte tidspunkter (den tid da komplett medium ble tilsatt, ble angitt som 0-h) . Western blot ble utført for å bestemme ekspresjon av EXO1 og β-aktin. (D) A2780 og SKO3 celler ble transfektert med FOXM1 siRNA, 48 timer senere, ble EXO1 uttrykk bestemmes av real-time PCR-analyse. Resultatene er vist fra tre uavhengige eksperimenter i tre paralleller. Kolonner, mener; barer, SD. (E) 24 timer etter FOXM1 siRNA transfeksjon, A2780 og SKOV3-celler ble behandlet med 2 ug /ml og 4 pg /ml cisplatin i 12 timer henholdsvis, og deretter ble dyrket i friskt komplett medium for angitte tidspunkter (den tid da fullstendig medium var tilsatt var angitt som 0-h). Pilen (↓) indikerer transfeksjon og påfølgende cisplatin behandling. Western blot ble utført for å bestemme ekspresjon av FOXM1, EXO1 og β-aktin.
6. FOXM1 binder direkte til EXO1 arrangøren og regulerer sin aktivitet
Vi postulert at FOXM1 kunne forbedre EXO1 transkripsjon i respons til cisplatin behandling. Sekvensanalyse identifiserte to konsensusgaffelhoderesponselementer (FHREs) i promoterregionen (Fig.6A) [25], [26]. For å demonstrere at FOXM1 binder direkte til endogen EXO1 promotersekvensen etter cisplatin behandling, utførte vi chromotatin immunoutfellingsstudier analyser i A2780 og SKOV3 celler. Den anti-FOXM1-antistoff, men ikke av kontroll-antistoff (IgG), utfelles det FHRE2-inneholdende region (-459 /-74) (Fig.6B), men den FHRE1-inneholdende region (-1934 /-1575) var ikke utfelt (data ikke vist). For å vurdere den funksjonelle rollen til FHRE2 i EXO1 regulering, utførte vi stedsspesifikk mutagenese innen FHRE2 av EXO1 promoter pGL3-FHRE2 (Fig.6C). Som vist i Fig.6D, mutasjon av FHRE2 avskaffet evne FOXM1 å aktivere reporteren konstruere etter cisplatinbehandling på A2780 og SKVO3, i tillegg, ko-transfeksjon av FOXM1 siRNA og villtype pGL3-FHRE2 også ført til lav luciferase aktivitet. Interessant, har pGL3-FHRE2 sterkere transkripsjonen aktivitet enn full promotorsekvens. Disse resultatene tyder på at FHRE2 formidler transkripsjons effekten av FOXM1 på EXO1 arrangøren, og at det kan være noen andre nettsteder som kan gjenkjennes av transkripsjons hemme faktorer i oppstrøms regionen FHRE2.
(A) Sekvens og posisjon av konsensus FHRE sekvensen på EXO1 promoter. (B) chip analyser ble gjort i A2780 og SKOV3 celler. Kromatin fragmenter av cellene ble immunopresipitert med anti-FOXM1 antistoff og negativ kontroll IgG og utsatt for PCR. 1% av de totale cellelysatene ble underkastet PCR før immunoutfelling som innganger. (C) Skjematisk struktur av villtype (WT) og mutant (Mut) former av FHRE2-inneholdende promotor pressen. (D) Luciferase-aktivitet med eller uten mutasjon i EXO1 promoter. A2780 og SKOV3-celler ble transfektert med villtype eller mutant FRHE2-inneholdende reporter, eller ko-transfektert med FOXM1 siRNA og villtype-reporter (PGL-3-Basic og pGL3-EXO1 ble anvendt som negativ og positiv kontroll, henholdsvis), deretter behandlet med cisplatin i 24 timer. Etterpå ble luciferase aktivitet i cellene målt. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
7. DNA-reparasjon regulering av FOXM1 er delvis medieres av EXO1
EXO1 har vist seg å være direkte involvert i DNA-reparasjon mekanisme [18], [27], [28]. Dermed neste utforsket vi enten EXO1 står for FOXM1-mediert cisplatin motstand. Vi forbigående slått ned uttrykket av EXO1 i A2780 og SKOV3 celler ved siRNA transfeksjon. Begge sirnas målretting EXO1 effektivt redusert mRNA og protein uttrykk i A2780 og SKOV3 cellelinjer (figur 7a og 7b). Knockdown av EXO1 også sensibilisert celler til cisplatin, som dokumentert av en sammenligning av IC
50-verdier (~2.3 mikrogram /ml vs ~4.2 mikrogram /ml i A2780, ~4.1 mikrogram /ml vs ~6.4 mikrogram /ml i SKVO3) og klone tall (~23% vs ~42% i A2780, ~21% vs ~38% i SKOV3) mellom rykke siRNA og EXO1 spesifikke siRNA-behandlede celler (Fig.7C og 7D). I henhold til ovenstående, den samme behandling med cisplatin resulterte i mer apoptotiske celler i EXO1 bestemte siRNA-transfekterte celler (~18% vs ~27% i A2780, ~21% vs ~33% i SKVO3) sammenlignet for å rykke-behandlede celler (Fig.7E). Selv EXO1 knock-down påvirket ikke uttrykk for FOXM1, gjorde det delvis rekapitulere den cisplatin allergi effekten av FOXM1 stanse i eggstokkreft celler. EXO1 siRNA-behandlede celler viste også flere DNA-skader, økt apoptose signalveier og nedsatt DNA-reparasjon effekt, som oppdaget av immunblot for γH2AX og kløyvet caspase-3 (Fig.7F), og γH2AX kvantifisering (Fig.7G).
