Abstract
trafficking proteinpartikler kompleks 4 (TRAPPC4) er innblandet i vesikkel-mediert transport, men tilknytningen til sykdom har sjelden blitt rapportert. Vi har utforsket dens potensielle interaksjoner med ERK2, en del av ERK1 /2-komplekset i det ekstracellulære signalregulerte Kinase /mitogenaktivert proteinkinase (ERK-MAPK) vei, ved et gjær to-hybrid skjerm og bekreftet ved ko-immunutfelling (Co -IP) og glutation S-transferase (GST) trekker ned. Videre undersøkelser funnet ut at når TRAPPC4 ble tømt, aktiveres ERK1 /2 spesielt redusert i kjernen, som ble akkompagnert med cellevekst undertrykkelse og apoptose i kolorektal kreft (CRC) celler. Overekspresjon av TRAPPC4 fremmet celle levedyktighet og forårsaket aktivert ERK1 /2 for å øke samlet, men spesielt i kjernen. TRAPPC4 ble uttrykt mer høyt i kjernen av CRC-celler enn i normal kolonepitelet eller adenomer som korresponderte med nukleær farging av pErk1 /2. Vi viser her at TRAPPC4 kan regulere celleproliferasjon og apoptose i CRC ved interaksjon med ERK2 og deretter fosforylere ERK1 /2, så vel som å modulere den subcellulære beliggenheten av pErk1 /2 for å aktivere den aktuelle signalveien
Citation:. Zhao SL, Hong J, Xie ZQ, Tang JT, Su WY, Du W, et al. (2011) TRAPPC4-ERK2 Interaksjon Aktiverer ERK1 /2, modulerer sine kjernefysiske lokalisering og Regulerer spredning og apoptose av tykktarmskreftceller. PLoS ONE 6 (8): e23262. doi: 10,1371 /journal.pone.0023262
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 12. mai 2011; Godkjent: 10 juli 2011; Publisert: 03.08.2011
Copyright: © 2011 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of Key Program (nr 30830055) til J-YF National (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm) og ved tilskudd fra National Natural Science Foundation of Youth Program til S-LZ (nr 31000634) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Shanghai Kommisjonen for vitenskap og teknologi til S-LZ (nr 10ZR1419000) (http : //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm), Shanghai Helse Bureau for ungdom til S-LZ (nr 2009032) (https://wsj.sh.gov.cn/website/), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Foundation for Science and Technology til S-LZ (09XJ21065) (https://www.shsmu.edu.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
TRAPPC4, den humane ortolog av gjær Trs23p, også kjent som synbindin, er generelt kjent som en neuronal cytoplasmatisk protein som opprinnelig ble identifisert av gjær to-hybrid screening ved hjelp av syndecan-2 (som hører til en familie av celleoverflate heparan sulfat proteoglykaner som regulerer cellefunksjoner via signaltransduksjonsveier [1], [2], [3]) cytoplasmatiske domene som agn [4]. Det regnes som en fysiologisk ligand av syndecan-2 på dendrittutløperne som er involvert i syndecan-2 indusert ryggrad formasjon ved å rekruttere intracellulære vesikler mot postsynaptiske steder i rotte hippocampus nevroner. TRAPPC4 er påvist i CD34 + hematopoetiske stilk /stamceller (HSPCs) og dermed er også kjent som HSPC172.
TRAPPC4 som et medlem av menneskehandel proteinpartikler (TRAPP) familie av proteiner er innblandet i vesikkel-mediert transport , en prosess utført av praktisk talt hver celle, og er nødvendig for riktig målretting og sekresjon av proteiner. I dag er det 10 kjente gjær Trapp subenheter (Bet5p, 3p, Trs20p, 23p, 31p, 33p, 65p, 85p, 120 p, 130p), og høyere eukaryoter har ortologer for åtte av disse (TRAPPC1~5,6a, 6b, 8,9) [5]. Sammen danner de to typer mutisubunit komplekser: TRAPP I og TRAPP II. I gjær, disse komplekser funksjon i en rekke prosesser, inkludert endoplasmatiske retikulum til Golgi-transport (TRAPP I) og en dårlig definert trinn ved trans-Golgi-nettet (TRAPP II) [6], [7], [8] . Studier i normal rottenyre (NRK) celler og HeLa-celler viste også at TRAPP komplekset spiller en rolle i løpet av ER-Golgi transport [9], [10]. Den PDZL domene i TRAPPC4 er en av de mest unike funksjonene i virveldyr kompleks sammenlignet med gjær TRAPP I. dysfunksjon av Trapp subenheter har vært innblandet i menneskelige sykdommer. Mutasjoner i TRAPPC1 (MUM-2) ble rapportert å gi uttrykk for antigene peptider i melanom [11], og mutasjoner i TRAPPC2 (sedlin) har vært knyttet til Spondyloepiphyseal dysplasi tarda (SEDT) [12]. Imidlertid har rollen som TRAPPC4 i sykdommen sjelden studert.
Tykktarmskreft (CRC) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i hele verden [13]. Kolorektal kreftutvikling er en kompleks multi-trinns prosess som involverer progressiv forstyrrelse av tarm epitel-celleproliferasjon, apoptose, differensiering og overlevelse mekanismer [14]. Det ekstracellulære signalregulerte Kinase /mitogenaktivert proteinkinase (ERK-MAPK) reaksjonsveien er en av de viktigste signaltransduksjonsveier for cellulær fysiologi, og flere viktige vekstfaktorer og proto-onkogener fremme vekst og differensiering gjennom denne kaskade [15] . Ved aktivering migrerer ERK1 /2-komplekset til kjernen hvor den fosforylerer forskjellige transkripsjonsfaktorer som regulerer genene for å øke celleformering og modulere celle apoptose [16]. Men de detaljerte mekanismer for aktivering og kjernefysisk translokasjon av ERK1 /2 er ikke fullstendig klarlagt.
I denne studien ble en gjær to-hybrid skjerm utført for å identifisere ERK1 og ERK2 bindende proteiner. TRAPPC4 ble funnet å binde med ERK2. Vi bekreftet samspillet og videre undersøkt rollen til TRAPPC4-ERK2 samhandling i CRC.
Resultater
TRAPPC4 ble identifisert som en ERK2-samspill faktor ved to-hybrid screening
Fosforylering og atom oppføring av ERK1 /2 er kritisk for aktivering av ERK-MAPK-reaksjonsveien. Å identifisere faktorer knyttet til prosessen, ble en gjær to-hybrid skjerm utføres med ERK1 og ERK2 som agn (full lengde) i forbindelse med et menneskelig HeLa matchmaker cDNA bibliotek. Av de kolonier som vokser på Leu-Trp-His platene som ble screenet, 57/61 var positive for ERK2 og 12/32 for ERK1 i en ß-galaktosidase-assay. Plasmider fra disse positive kolonier ble trukket ut, forsterkes i bakterier og co-transformert tilbake i gjær sammen med agn plasmider for videre testing av ß-galaktosidase assay. Elleve kloner ble bekreftet å ha et positivt samspill med ERK2 og tolv med ERK1. Blant disse plasmider som var positive hits for ERK2 og ERK1, ble TRAPPC4 identifisert i fem og seks av sekvensene, henholdsvis, etter sekvensering. Dette var første gang at TRAPPC4 ble identifisert som en potensiell samspill protein av ERK2.
Validering av TRAPPC4-ERK2 interaksjon
For ytterligere å bekrefte samspillet mellom TRAPPC4 og ERK2, co-immunoprecipitation og GST pull-down eksperimenter ble utført. For co-immunoprecipitation ble full-lengde TRAPPC4 cDNA innhentet og klonet inn pCDEF-Myc, mens ERK2 sekvensen ble klonet inn pCDEF-Flag. De resulterende pCDEF-Myc-TRAPPC4 og pCDEF-Flag-ERK2 vektorer ble validert ved sekvensering og co-transfektert inn i 293T cellelinje. Western blot-analyse (Fig. 1A) viste at plasmider kunne uttrykke signifikante nivåer av proteinene. Etter å ha brukt et anti-myc antistoffet for co-immunoprecipitation, både TRAPPC4-myc band og ERK2-flagg bandet ble oppdaget fra pCDEF-Myc-TRAPPC4 og pCDEF-Flag-ERK2 kotransfiserte celler, indikerer at det er en interaksjon mellom TRAPPC4 og ERK2. I den positive kontrollprøven med co-transfektert pCDEF-Myc-p16 og pCDEF-Flag-TSSK1 vektorer, både p16-Myc band og TSSK-flagg bandet ble oppdaget, noe som indikerer at proteinene kan være co-immunopresipitert av vår protokoll basert på den kjente samspillet mellom p16 og TSSK1. Bare TRAPPC4-myc bandet ble oppdaget da pCDEF-Myc-TRAPPC4 var co-transfektert med en tom flagg vektor, mens ingen band ble oppdaget da pCDEF-Flag-ERK2 var co-transfektert med tom Myc vektor, noe som tyder på at interaksjoner observert ovenfor er spesifikke og ikke formidles av protein tags
A:. Samtidig immunoprecipitation av TRAPPC4 og ERK2. 293T celler ble transfektert med tom pcDNA vektor eller pcDNA vektor for å uttrykke Flag merket ERK2 (42 kD), eller Myc merket TRAPPC4 (26 kD). Cellelysater ble underkastet immunoutfelling med anti-Flag-HRP-antistoff eller anti-Myc-HRP-antistoff. Tilstedeværelsen av ERK2-Flag og TRAPPC4-Myc i celle ekstrakter før immunoprecipitation ble kontrollert ved hjelp av anti-Flag og anti-myc antistoffer (Input). Co-transfeksjon av ekspresjonsvektorer for p16-Myc og TSSK1-Flag ble anvendt for den positive kontroll (kolonne 1). B: Representative resultatene av GST pulldown valideringsforsøk. (A) Immunoblot-analyse av GST og GST-ERK2-proteiner anvendt som negativ kontroll (kolonne 2) og agn (Lane3) for nedtrekk analysen. Proteiner ble påvist ved anvendelse av anti-6 x HIS-antistoff etter SDS-PAGE og membranoverføring. Lane 1 viste blank kontroll uten GST eller GST-ERK2. (B) ERK2 uttrykt som et GST fusjonsprotein fra bakterier var bundet til kulene og inkubert med TRAPPC4 uttrykt som 6 x His-TRAPPC4 fusjonsprotein for en rullegardin eksperiment. GST-ERK2 protein (lane1), GST-protein (lane2) og TRAPPC4 protein (lane4) ble detektert ved Coomassie-farging. Lane3 viste markør.
Da det er mulig at den TRAPPC4 og ERK2 interaksjon kan være indirekte fordi andre proteinfaktorer i hele celleekstrakt kan være involvert i mediering av interaksjonen, f.eks som virker som «bygge bro» faktorer, vi neste undersøkt en mulig direkte interaksjon mellom de to proteiner ved anvendelse av GST-pull-down-analyser. TRAPPC4 ble revet med GST-fusjonsproteiner ERK2 (fig. 1B, felt c), men ikke med GST alene (Fig. 1B, felt b), noe som indikerer at TRAPPC4 og ERK2 spesifikt og direkte interaksjon
in vitro
.
TRAPPC4 regulerer ERK1 /2 fosforylering i SW1116 cellelinje
fosforylering av ERK1 /2 er et kritisk punkt i ERK signalveien. Nå som vi hadde vist at TRAPPC4 samhandlet med ERK2, neste undersøkte vi den relative bidraget av TRAPPC4 i ERK1 /2 fosforylering. Etter å redusere ekspresjonsnivået av TRAPPC4 i SW1116 celler ved RNAi eller overekspresjon det ved transfeksjon av et plasmid som koder for full-lengde-genet, har vi fastslått at endringen i ekstra fordel nivåer ved Western blotting. Påvisning av GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Mens det ble ikke observert forskjeller i protein nivåene av total ERK1 /2 i samtlige grupper (Fig. 2), fosforylering nivået av ERK1 /2 ble nedregulert etter siRNA-formidlet nedbrytning av TRAPPC4 (Fig. 2A) og opptil -regulated etter dets overekspresjon (fig. 2B). Videre, behandlet vi begge grupper av celler med blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), en av de aktivatorer av den ERK-MAPK veien, og fant at nivået av ERK1 /2 fosforylering etter behandling var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene, til tross for sine forskjeller i TRAPPC4 nivåer (fig. 2).
Celler ble lysert, og like mengder protein ble analysert ved Western blot analyse ved hjelp av antistoffer mot fosfor-ERK1 /2 (pErk1 /2), eller ERK1 /2, eller TRAPPC4. Tettheten av Western blot båndene ble normalisert til mengden GAPDH protein. Dataene som vises er representative for tre replikere eksperimenter. *,
p
0,05. A. Cellene ble transfektert med TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) til knockdown TRAPPC4 uttrykk eller med Negtive kontroll siRNA (siControl) som kontroll; Også celler ble behandlet med PDGF for å aktivere MAPK ERK-reaksjonsveien, eller med dens løsningsmiddel (PBS + 0,1 BSA) som kontroll. B. Cellene ble transfektert med pCDEF-myc-TRAPPC4 vektor å overuttrykker TRAPPC4 protein eller med pCDEF-myc vektor som kontroll; Også celler ble behandlet med PDGF for å aktivere MAPK ERK-reaksjonsveien, eller med dens løsningsmiddel (PBS + 0,1 BSA) som kontroll.
TRAPPC4 regulerer den romlige fordelingen av fosforylert ERK1 /2
Siden vi har vist at TRAPPC4 kan påvirke aktiveringsstatusen til ERK1 /2, vi ønsket å bestemme dens virkning på den subcellulære lokalisering av pErk1 /2. Deretter sammenlignet vi pErk1 /2 og ERK1 /2-ekspresjon i den separerte cytoplasmiske og kjernefraksjoner når TRAPPC4 ble utarmede eller overuttrykt som beskrevet ovenfor. Igjen, GAPDH ble brukt som en lasting kontroll for cytoplasma protein innspill, og TBP ble brukt som en kontroll for kjernefysisk protein innspill.
Etter Western blotting, fant vi at etter TRAPPC4 siRNA behandling, nivået av pErk1 /2 betydelig redusert i kjernen (fig. 3A). I mellomtiden var ingen signifikant forskjell i pErk1 /2 finnes i cytoplasma da kvantifisert, selv om en svak økning ble foreslått visuelt (Fig. 3B). På den annen side, når TRAPPC4 ble overuttrykt, ble pErk1 /2 ekspresjon oppregulert i betydelig grad i kjernen (fig. 4A). Mens i cytoplasma, viste resultatene en svak visuell økning uten signifikante forskjeller når kvantifisert (Fig. 4B).
SW1116 celler ble transfektert med TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) til knockdown TRAPPC4 uttrykk eller med Negtive kontroll siRNA (siControl ) som kontroll; Også celler ble behandlet med PDGF for å aktivere MAPK ERK-reaksjonsveien, eller med dens løsningsmiddel (PBS + 0,1% BSA) som kontroll. Cytoplasma og nukleære ekstrakter ble fremstilt som beskrevet i eksperimentelle prosedyrer, og like mengder av protein ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av antistoffer mot fosfo-ERK1 /2 (pErk1 /2), eller ERK1 /2, eller TRAPPC4. Tettheten av Western blot båndene ble normalisert til mengden GAPDH protein for cytoplasma-protein eller TBP for kjerneprotein. Dataene som vises er representative for tre replikere eksperimenter. *,
p
. 0,05
SW1116 celler ble transfektert med pCDEF-myc-TRAPPC4 vektor å overuttrykker TRAPPC4 protein eller med pCDEF-myc vektor som kontroll; Også celler ble behandlet med PDGF for å aktivere MAPK ERK-reaksjonsveien, eller med dens løsningsmiddel (PBS + 0,1% BSA) som kontroll. Nuclear (A) og cytoplasma (B) ekstrakter ble fremstilt som beskrevet i eksperimentelle prosedyrer, og like mengder av protein ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av antistoff mot fosfo-ERK1 /2 (pErk1 /2), eller ERK1 /2, eller TRAPPC4 . Tettheten av Western blot båndene ble normalisert til mengden av TBP for kjerneprotein eller GAPDH protein for cytoplasma-protein. Dataene som vises er representative for tre replikere eksperimenter. *,
p
. 0,05
PDGF kan aktivere ERK-MAPK vei gjennom reseptortyrosinkinaser [17]. Når SW1116 cellelinjen ble stimulert med PDGF, en liten nedgang på pErk1 /2 ble visuelt observert i atomfraksjonen etter TRAPPC4 knock-down, men var det ikke signifikant på kvantifisering. I mellomtiden var ingen signifikant endring i pErk1 /2 kvantifisert i den cytoplasmiske fraksjon, selv om en svak økning ble foreslått visuelt (fig. 3). Imidlertid PDGF stimulering av celler som overuttrykker TRAPPC4 resulterte i signifikant pErk1 /2 oppregulering i kjernen, men ikke i cytoplasma (fig. 4).
TRAPPC4 modulerer proliferasjon og uttømming av TRAPPC4 induserer apoptose i den SW1116 cellelinjen
aktivering av ERK-MAP-kinaser har vært knyttet til celleformering [16]. For ytterligere å studere funksjonen av TRAPPC4 i CRC celler, sammenlignet vi celleproliferasjon av SW1116 cellene når TRAPPC4 uttrykk ble redusert med siRNA eller over-uttrykt med full-lengde TRAPPC4 genet transfeksjon med at av mock-kontroll. Resultatene av celletelling Kit (CCK) -8-analyse viste en signifikant inhibering av vekst etter TRAPPC4 uttømming og en økning i cellelevedyktighet når TRAPPC4 ble overuttrykkes både å starte fra 24 timer etter transfeksjon (fig. 5A).
A: CCK-8 analysen. SW1116 celler ble sådd i en 96-brønns plate før Subkonfluente. Levedyktige celler ble bestemt ved CCK-8-analyse. Tre uavhengige tid ble utført in triplo. Celler ble behandlet med TRAPPC4 siRNA til knockdown TRAPPC4 ekspresjon eller med Negtive kontroll siRNA anvendt som kontroll (a), så vel som tranfered med pCDEF-myc-TRAPPC4 vektoren for å overuttrykke TRAPPC4 protein eller med pCDEF-myc vektor som kontroll (b). *,
p
0,05. B: Apoptose analyse. Etter SW1116 celler ble behandlet med TRAPPC4 siRNA eller Negtive kontroll siRNA anvendt som kontroll i 48 timer. Apoptose ble utført ved hjelp av Annexin V analysen med propidiumjodid kontra tillater kvantifisering av flowcytometri. Tre uavhengige tid ble utført in triplo. Dataene ble presentert som betyr ± standardavvik (SD). Det var signifikant forskjell mellom de to gruppene (
p
0,01)
TRAPPC4 opphopning i kjernen er assosiert med pErk1 /2 flekker i menneskelige kolorektal kreft
så lite var kjent om uttrykket og lokalisering av TRAPPC4 i kolorektal kreft
in vivo
, vi deretter sammenlignet sitt uttrykk i normale colonic epitel, adenom og adenokarsinom vev ved immunhistokjemi som beskrevet i Materialer og metoder. I normal kolonepitelet, ble TRAPPC4 fargingen begrenset til cytoplasma (fig. 6A). 4,55% av cellene i adenom prøvene viste nukleær farging, mens det var 55,89% i adencarcinoma prøver (
p
0,01). Ingen signifikante forskjeller ble vist totalt TRAPPC4 uttrykk mellom de tre gruppene (normal kolonepitelet gruppe = 85,7%; adenom gruppe = 72,7%, adenokarsinom gruppe = 79,4%;
p
0,05).. (Tab 1 )
(A), pErk1 /2 (B) og ERK1 /2 (C) i normal kolonepitelet (a), adenom (b), og adenokarsinom (c). Polygrams (d) viser ekspresjon av proteinene i cytoplasma (rosa), kjerne (gul), og total (blå). A: Ekspresjon av TRAPPC4 har ingen signifikant forskjell i de tre gruppene totalt, men øker i kjernen fra a til c. B: pErk1 /2 hovedsakelig lokalisert i kjernen, og nivået øker betydelig fra a til c. C: Ekspresjon av ERK1 /2 har ingen signifikant forskjell i de tre gruppene totalt, men øker i kjernen fra a til c. Original forstørrelse × 200.
Videre analyserte vi sammenhengen mellom TRAPPC4 og pErk1 /2 eller ERK1 /2 flekker i normal colonic epitel, adenom og adenokarsinom. Mens ERK1 /2-farging ble påvist både i cytoplasma og cellekjernen (fig. 6C), dens farging i kjernen har økt betydelig i adenokarsinom gruppen sammenlignet med de to andre gruppene. Videre pErk1 /2 aktiverte proteiner ble alle plassert i kjernen, og det var signifikante forskjeller mellom de tre gruppene (fig. 6B). Dermed våre resultater viser en signifikant sammenheng mellom kjernekraft TRAPPC4 uttrykk og pErk1 /2 nivåer (
r
= 0,996), og også mellom kjerne TRAPPC4 uttrykk og ERK1 /2 nivåer (
r
= 0.994 ).
Diskusjoner
de to komponentene i ERK1 /2-komplekset er alltid funnet å være samlokalisert med kolorektal karsinom [17], [18], [19], [20] og ERK1 og ERK2 MAPK har tiltrukket intens forskning interesse på grunn av deres kritisk involvert i regulering av celleproliferasjon og surviva [17]. Aktivert ERK fosforylere og regulere virksomheten til en stadig voksende liste av substrater som er anslått til å omfatte over 160 proteiner [21]. Derfor ble ERK1 og ERK2 anvendes som agn for to-hybrid-gjær screening i et humant cDNA-bibliotek Hela i det første trinnet i denne studien. Som et resultat, blant de 23-bindende proteiner (11 med ERK2 og 12 med ERK1), den mulige interaksjon av TRAPPC4 og ERK2, men ikke med ERK1 ble avslørt for første gang. Vår co-immunoprecipitation og GST-pulldown eksperimenter ytterligere bekreftet TRAPPC4 som ERK2 interaksjon partner.
Siden lite bevis for Trapp proteiner i CRC har blitt rapportert, og rollen til TRAPPC4-ERK2 interaksjonen er fortsatt ukjent, vi først analysert virkningen av TRAPPC4 på fosforylert ERK1 /2, den aktiverte form av ERK1 /2. Vi har funnet at, som en helhet, overekspresjon av TRAPPC4 aktivert ERK1 /2, mens dens uttømming redusert pErk1 /2 nivåer i tykktarmskreft-avledede cellelinje SW1116. Således TRAPPC4 fungerer som en positiv regulator for pErk1 /2.
Selv om noen finnes i cytoplasma, de fleste av ERK-substrater er kjerneproteiner [22]. Aktiverte ERK kan translocate til kjernen hvor de fosforylerer og regulerer forskjellige transkripsjonsfaktorer, slik som Ets familie transkripsjonsfaktorer, til syvende og sist fører til endringer i genekspresjon [23]. Ytterligere vurdering av cytoplasmiske og kjernefraksjoner viste at plasseringen av pErk1 /2 også endres sammen med TRAPPC4 ekspresjonsnivåer. Når TRAPPC4 ble slått ned, atom pErk1 /2 plan var spesielt nedregulert, men ingen signifikant forskjell ble vist i cytoplasma. Når overuttrykt, pErk1 /2 ekspresjon økt både i kjernen og cytoplasmaet, men mer bemerkelsesverdig i kjernen. Således blir TRAPPC4 involvert i ikke bare fosforyleringen av ERK1 /2, men også dens romlige fordeling i kolorektale epitelceller. Trapp proteiner er kjent for å være en del av et stort multiproteinkompleks som er involvert i ER-til-Golgi og intra-Golgi-handel [5], [7], [8]. De presenterer som flere isoformer som varierer i subenheter, funksjon og plassering. For eksempel er TRAPPCI involvert i rekruttering av ER-avledet vesikler til cis-Golgi [8], og TRAPPCII [7] er nødvendig for retrograd transport fra endosomer. Eva Loh
mfl.
Avslørte at Bet3, den mest bevarte del av TRAPP komplekse, er uttrykt i åtte forskjellige muse vev, finnes i to forskjellige bassenger i cytosol og funksjoner under ER-Golgi transport [10] . Derfor kan TRAPPC4 spille en rolle i nucleocytoplasmic transport i kolorektal cancer, men denne mekanismen vil kreve ytterligere studier.
PDGF kan signalisere via ERK-reaksjonsveien MAPK og aktiverer ERK kaskade gjennom reseptor-tyrosin-kinaser. Vi har funnet at etter behandling med PDGF, effekten av TRAPPC4 på pErk1 /2 var helt eller delvis skjult. Resultatene ga oss en indikasjon på at TRAPPC4 kan være involvert i visse trinn på PDFG-mediert aktivering av ERK1 /2 kaskade. Som for ERK1 /2 fosforylering, kan effekten av TRAPPC4 ikke være så kraftig som for PDGF. Men fortsatt er detaljert mekanisme for å bli grundig undersøkt.
Videre fant vi at TRAPPC4 påvirket celledeling samt celledød. Uttømming av TRAPPC4 hemmet cellevekst og induserte apoptose, mens dets overekspresjon bidratt til cellevekst. Det ble rapportert at aktivert ERK1 /2 samvirker med noen substrater, slik som fosfoprotein anriket i astrocytter 15 (PEA-15), og død tilknyttet protein kinase (DAPK), og blir sekvestrert i cytoplasma [24]. Sletting av PEA-15 stimulerer markert ERK-avhengige spredning og gentranskripsjon; mens PEA-15 overekspresjon blokkerer spredning via sin evne til å binde og binder ERK1 /2 i cytoplasma [25]. DAPK sequesters ERK1 /2 i cytoplasma ved å samhandle med ERK gjennom en D-domene innenfor sin død domene. og samspillet fremmer proapoptotiske funksjon DAPK [26]. Derfor er inhibering av ERK1 /2 nukleære lokaliserings svekker ERK1 /2-mediert overlevelsessignaler og i tillegg forsterker apoptosiske signaler. I vår studie, etter knockdown av TRAPPC4, nedgangen i aktivering av ERK1 /2 korresponderte med mindre kjernefysiske lokalisering, som kan til slutt føre til vekst surpression og apoptose. Mens flere kjernefysiske lokalisering når TRAPPC4 overexpressed kan fremme cellevekst.
Det meste av tidligere forskning på Trapp Family var fokusert på gjær og normale pattedyrceller eller vev [4], [5], [8] , [10]. Så vidt vi vet, har bare uttrykk for TRAPPC2 blitt undersøkt i sykdommen SEDL [27]. Til dags dato har plasseringen av TRAPP subenheter hovedsakelig blitt rapportert i cytoplasma i pattedyrceller [9], [10]. TRAPPC4 ble angivelig ligger i spines av dyrkede hippocampus nevroner [4], men lite informasjon om sin rolle i sykdommen er oppnådd. Her, analyserte vi TRAPPC4 uttrykk i menneskelig normal colonic epitel, adenom, og adenokarsinom vev ved immunhistokjemi. Resultatene viste at kjernefysisk TRAPPC4 vises etter normal epitel vev utvikler seg til adenom og adenokarsinom. Således kan endring i lokaliseringen av TRAPPC4 være relatert til tykktarmskreftutvikling. Spørsmålet er om det kan oppstå noen genmutasjoner eller strukturelle endringer som oppstår i TRAPPC4 under kolorektal kreftutvikling. I mellomtiden, pErk1 /2, som var lokalisert i kjernen i vårt studium, økte i adenocarcinom i forhold til adenom vev og normale epitelvev. Som nevnt ovenfor, er den viktigste funksjonen til TRAPP familien er i reguleringen av vesikulært transport, og TRAPPC4 er involvert i membran trafficking i post-synaptiske områder i nerveceller. Man kan spørre om mekanismen for nukleær lokalisering av TRAPPC4 i CRC er relevant for transport av pErk1 /2 fra cytoplasma til kjernen. Faktisk ble TRAPP kompleks vist seg å fungere som guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) for Ypt1 og Ypt31 /32 GTPases både
in vitro Hotell og
in vivo product: [28], [29 ]. Mens Ypt1 GTPase kreves ved cis-Golgi for målretting og fusjon av ER-avledede vesikler [30], [31], funksjonene til de Ypt31 /32 GTPases er også viktig for dannelsen av trans-Golgi-vesikler [32] . Det gjenstår å se om en tilsvarende molekylære mekanismen finnes for TRAPPC4 i CRC inn enda videre studier.
I konklusjonen, vår studie viste samspillet av TRAPPC4 med ERK2. I tykktarmskreft, er det ikke bare regulerer aktiveringen av ERK1 /2, men også påvirker fordelingen av aktivert ERK1 /2. Den modulerer celleproliferasjon og apoptose i CRC-celler. I betraktning sammen med tidligere studier, spekulere vi at i CRC, binder TRAPPC4 og aktiverer ERK1 /2 så vel som deltar i den kjernefysiske transport av pErk1 /2. Når TRAPPC4 er oppbrukt, mindre ERK1 /2 er fosforylert, og relativt mer pErk1 /2 forblir i cytoplasma, noe som fører til undertrykkelse av celleproliferasjon og apoptose. Når TRAPPC4 blir overuttrykt, blir mer ERK1 /2 aktivert, og enda mer transporteres inn i kjernen, og til slutt fører til økt cellevekst (fig. 7). Fremtidige studier vil være nødvendig for å avklare denne foreslåtte molekylære mekanismen.
ekstracellulære signaler, slik som PDGF, aktiverer ERK kaskader (RAS /RAF /MER /ERK) gjennom reseptor tyrosin kinaser (RTK) og utimately regulere celledeling og apoptose. TRAPPC4 binder og aktiverer ERK1 /2 så vel som deltar i den kjernefysiske transport av pErk1 /2. Når TRAPPC4 er oppbrukt, mindre ERK1 /2 er fosforylert, og relativt mer pErk1 /2 forblir i cytoplasma, noe som fører til undertrykkelse av celleproliferasjon og apoptose. Når TRAPPC4 er overuttrykt, er mer ERK1 /2 aktivert, og enda mer blir transportert inn i kjernen, til slutt fører til økt cellevekst.
Materialer og metoder
plasmider og transfections
full-lengde ERK1, ERK2, og TRAPPC4 cDNA ble oppnådd ved PCR fra et humant cDNA bibliotek. For gjær to-hybrid-analyser ble det full lengde fragmenter av ERK1 og ERK2 cDNA klonet både i ramme med
Sfi
setet i PGB plasmid. For bindingsanalyser, ble det full-lengde TRAPPC4 cDNA klonet i pCDEF-Myc, og full-lengde ERK2 cDNA ble klonet i pCDEF-Flag. ERK2 ble subklonet i pGEX-5x å produsere glutation
S
-transferase (GST) fusjonsproteiner, og TRAPPC4 ble subklonet i Dyre 28a for å produsere sine fusjonsproteiner.
For co-immunoprecipitation eksperimenter under, 1,6 × 10
6 celler /brønn på 6-cm retter ble ko-transfektert med vektorer pCDEF-Myc-TRAPPC4 og pCDEF-Flag-ERK2 uttrykke TRAPPC og ERK2, henholdsvis ved hjelp av et plasmid: transfeksjon reagens forhold på 1:4 (4 mikrogram hver plasmid). Tomme vektor kontroller var pCDEF-Myc eller pCDEF-Flag (begge fra Shanghai Genomics).
Gjær to-hybrid analyser
Gjær to-hybrid screening ble utført for å identifisere ERK1 og ERK2 samspill proteiner ved bruker Clontech Matchmaker To-hybridsystem (Kat. nr K1612-1) i henhold til produsentens instruksjoner. Agn plasmider PGB-ERK1-G og PGB-ERK2-G ble transformert inn i gjærstamme Y190. Giftvirkninger og selvaktiveringstester ble utført ved anvendelse av en β-galaktosidase-assay. Gjær transformert med agn plasmider ble dyrket og screenet med det humane HeLa LIGHT cDNA-bibliotek (Clontech, CAT # HL4048AH) og deretter dyrket på Leu-Trp-His plater for valget og valideringen ved hjelp av P-galaktosidase-assay. Plasmider fra positive kolonier ble trukket ut, forsterkes i bakterier og co-transformert tilbake i gjær sammen med agn plasmider for videre testing i ß-galaktosidase analyser. Plasmider positive treff ble sekvensert og analysert.
Co-immunoprecipitation (co-IP) og GST-pulldown analyse
Samtidig immunoprecipitation ble utført som beskrevet tidligere [33]. Både inn- og IP-prøver ble analysert ved Western blot ved anvendelse av forskjellige antistoffer i det følgende fortynninger: Flag antistoff (1:1000), Myc antistoff (1:1000) Flag-HRP-antistoff (1:4000), Myc-HRP-antistoff (1 :2000) (alle fra Shanghai Genomics, Shanghai, Kina), og geit anti-mus IgG-HRP antistoff (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Co-transfeksjon av ekspresjonsvektorer for p16 og TSSK1 (Shanghai Genomics, Shanghai, Kina) ble brukt til den positive kontrollen co-immunoprecipitation.
GST protein og GST-ERK2 fusjonsproteiner ble uttrykt og renset i henhold til produsentens instruksjoner (GE Healthcare, London, UK). For rullegardin analysen ble 1-5 mg av GST eller GST fusjonsproteiner blandet med 40 ml av en 50% suspensjon av glutation-Sepharose 4B kuler i 2 timer i bindingsbuffer [25 mM HEPES-NaOH (pH 7,5) , 12,5 mM MgCl
2 10% glycerol, 5 mM DTT, 0,1% NP-40, 150 mM KCI og 20 mM ZnCl2]. Deretter 1-5 mg 6 x His-TRAPPC4 fusjonsproteiner ble tilsatt etterfulgt av inkubasjon i ytterligere 2 timer. Pelletene ble vasket grundig, og ble identifisert ved western blotting med 6 × Hans antistoff (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK).
Cell kultur
kreft-avledet celle colon linjen SW1116 (kjøpt fra Celle Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences) ble opprettholdt ved serie passasjer i RPMI 1640 inneholder 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum (FCS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
