Abstract
Bakgrunn
Epitelceller i maligne tilstander utgivelsen DNA inn i ekstracellulære kupé. Cell free DNA av svulst opprinnelse kan fungere som en ligand av DNA-sensing mekanismer og formidle endringer i epitel-stroma interaksjoner.
Mål
For å evaluere og sammenligne potensialet autokrint og parakrint regulerende effekt av normal og ondartet epitelcelledifferensiering relaterte DNA på TLR9 og STING mediert trasé i HT-29 menneskelige kolorektal adenokarcinomceller og normale fibroblaster.
Materialer og metoder
DNA isolert fra normal og tumorous colonic epitel av frisk frosne kirurgisk fjernet vevsprøver ble anvendt for 24 og seks-timers behandling av HT-29 colon-karsinom og HDF-a-fibroblastceller. ble utført hele genomet mRNA uttrykk analyse og QRT-PCR for elementene /medlemmer av TLR9 signalveien. Immunocytochemistry ble utført for epiteliale markører (dvs. CK20 og E-cadherin), DNA metyltransferase 3a (DNMT3a) og NFkB (for behandlede HDFα celler).
Resultater
Administrasjon av svulst avledet DNA på HT29 celler resulterte i signifikant (p 0,05) mRNA nivå endring i 118 gener (logFc≥1, p≤0.05), inkludert overekspresjon av metalltioneinsystemene gener (dvs.
MT1H
,
MT1X
,
MT1P2
,
MT2A
), metastaseassosierte gener (dvs.
TACSTD2
,
MACC1
,
MALAT1
), tumor biomarkør (CEACAM5 ), metabolske gener (dvs.
INSIG1
,
LIPG
), messenger molekyl gener (dvs.
Dapp
,
CREB3L2
).
Økt
protein nivåer av CK20, E-cadherin og DNMT3a ble observert etter svulst DNA-behandling i HT-29 celler. Sunn DNA behandling påvirket mRNA uttrykk av 613 gener (logFc≥1, p≤0.05), herunder økt uttrykk av viktige adapter molekyler av TLR9 pathway (f.eks
MyD88
,
IRAK2
,
NFkB
,
IL8
,
IL-1β
), STING pathway (aDAR, IRF7, CXCL10, CASP1) og
FGF2
genet.
Konklusjoner
DNA fra tumorous tykktarm epitel, men ikke fra de normale epitelceller virker som en pro-metastatisk faktor til HT-29-celler ved overekspresjon av pro-metastatiske gener gjennom TLR9 /MyD88 uavhengig reaksjonsvei. I motsetning til DNA stammer fra sunn kolonepitelet indusert TLR9 og STING signalveien i normale fibroblaster
Citation. Furi jeg, Kalmar A, Wichmann B, Spisak S, Schöller A, Bartak B, et al. (2015) Cell Gratis DNA av Tumor Origin induserer en «metastatisk» Expression profil i HT-29 Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0131699. doi: 10,1371 /journal.pone.0131699
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 8 april 2015; Godkjent: 05.06.2015; Publisert: 02.07.2015
Copyright: © 2015 Furi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelig via Gene Expression Omnibus (GEO) under tiltredelse antall GSE67557
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av forskning og teknologi Innovation Fund, Ungarn, KMR_12-1-2012-0216 til BM og ungarsk Scientific Research Fund (OTKA-K111743 stipend) til ZT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endrede epitel-stromal samhandling er grunnleggende i kreftdannelse. Blant de kjente regulatoriske ligander (f.eks vekstfaktorer, cytokiner, kjemokiner, kjønnshormoner) svulstvev-avledet DNA er også involvert i denne kommunikasjonen via cellulære reseptorer sensing DNA [1] Ifølge flere studier [2-4] DNA-fragmenter av tumor opprinnelse (dvs. 21 til 500 baser korte sekvenser av human opprinnelse) spiller en rolle i dannelsen av en tumor støttende mikromiljø (dvs. fremme tumorinvasjon og omgåelse av immunovervåkning) [5-8] den cellefrie DNA stammer fra nekrotisk /apoptotiske kreftceller, og kan aktivt utgitt av levende celler til interrommet [9-12]. Dette tumorvev stammer DNA kan påvises i plasma og serum, og kunne tjene et nyttig biomarkør for diagnose av kreft [11]. Den inneholder en rekke kreftspesifikke enheter, herunder onkogener, tumorsuppressorgener avvikende mikrosatellitter, avvikende DNA metylering gener, og bearbeidet kromosomalt DNA [12]. Nyere studier bekreftet opptak og oppbevaring av onkogener stimulerende celleproliferasjon i ikke-maligne celler etter integrering (oncometastasis) inn mottakerne cellens genom [13].
I den grad de blir forstått, DNA sensing mekanismer i målcellene omfatter to primære adapter trasé, dvs. toll-like receptor (TLR9) og stimulator av interferon gener (STING) veier. [14] Cytoplasmatiske TLR9 gjenkjenner endogene ligander, som for eksempel fare assosiert molekylære mønstre (demper) som unmethylated DNA-sekvenser [7, 8, 15] den totale mengden av unmethylated DNA øker parallelt med global DNA hypometylering i svulstvev i forhold til normalt vev [16]. Den økte ekspresjon av TLR9 ble påvist i flere tumortyper. [1, 17-20] Økt TLR9-ekspresjon i carcinoma celler var assosiert med høyere metastatisk potensial, mens høyere TLR9 ekspresjon av fibroblast-lignende celler var assosiert med en lav sannsynlighet for metastase [ ,,,0],21]
STING signalveien er en adapter for DNA via binding av sykliske dinukleotider generert av enzymet syklisk GMP-AMP (cGAMP) syntase (CGAS). [22-24]
Sterk synergisme har blitt observert blant samarbeider STING og TLR9 signalering. Disse to signalveier er ulikt regulert av avgjørende adapter molekyler (IRF3 /7, STING, og MyD88) [25]. Videre Deng et al. (2014) og Woo et al. (2014) gitt bevis som tyder på dendrittiske celler påvise DNA fra kreftceller via STING-mediert, cytosolic DNA sensing veien. [22, 26, 27]
Basert på våre tidligere resultater, HT-29 menneskelige kolon adenokarcinomceller reflektert endret DNA metylering nivå (via forhøyet DNMT3a methyltranferase aktivitet) og CK20 epitelial markør uttrykk etter ny behandling med selv DNA . [28] i denne studien vi analyserte autokrine og parakrine effekter av DNA fra svulsten og friskt vev på HT-29 kreftceller og fibroblaster fra hele genomisk mRNA uttrykk analyse og QRT PCR for validering av gener fra TLR9 veien. Videre ble utført immunocytokjemisk analyse for utvalgte differensiering markører, celle- adhesjonsmolekyler og metyltransferaser, for verifikasjon på proteinnivå etter behandling med DNA fra friske og tumorvev.
Materialer og metoder
HT -29 celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=TRUNC
HT-29 humane tykktarm adenokarsinomceller ble anskaffet fra LGC Standards (katt nr. ATCC HTB-38) og dyrket i et bestemt patogen-fri cellekultur laboratorium ved 37 ° C i 5% CO
2. HT-29 celler ble opprettholdt i McCoys 5a-medium modifisert (Cat No. M8403-500 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) supplert med 10% (vol /vol) fetalt bovint serum (FBS; Vanlig kvalitet; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike), 160 mikrogram /ml gentamycin (Sandoz, Sandoz GmbH, Østerrike), og 125 mikrogram /ml amfotericin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
HDFα cellekultur
HDFα-celler ble anskaffet fra Life Technologies (katalog nr. C0135C) og dyrket i et bestemt patogen-fri cellekultur laboratorium ved 37 ° C i 5% CO2. HDFα celler ble opprettholdt i Medium 106 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) supplert med LSGS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) og amfotericin B (Sigma). 160 mikrogram /ml gentamycin (Sandoz, Sandoz GmbH, Østerrike).
DNA
Genomisk DNA ble isolert fra makroskopisk normale områder nær kolorektal kreft (CRC) og fra tumorvevet områder av kirurgisk fjernet macrodissected ferskt frosset CRC-prøver (trinn II, moderat differensierte tumorer fra sigmoid kolon, og rektum (25-50 mg vev) ved høy Pure PCR-templat preparat sett (Roche GmbH, Tyskland). Disse CRC-pasienter ble alle bekreftet ved histologisk definitiv diagnose og mottok ingen preoperativ kjemoterapi eller radioterapi. Det isolerte, proteinfritt DNA ble behandlet med 20 ul RNase A /T1 blanding ved 37 ° C i 1 time (Thermo Scientific, Tyskland). konsentrasjonen av isolert og renset DNA ble bestemt ved Nanodrop- 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Tyskland).
Etikk uttalelse
studien ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen deklarasjonen~~POS=HEADCOMP og godkjent av Semmelweis universitet etiske komité og den statlige regionale and Institutional Committee of Science and forskningsetikk (TUKEB), Nr: 23970-2 /2011). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter inkludert i studien.
DNA behandling av HT-29 og HDFα celler
HT-29 og HDFα celler ble sådd (i en tetthet på 0.5×10
6 og 0.1×10
6) i 6 vel Corning CellBIND cellekulturmultibrønnplater i RPMI 1640 supplert med gentamycin, amfotericin B og FBS. Da monosjikt nådde 80-90% av konfluens, 15 ug av normal eller tumor-DNA (oppløst i 200 ul sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) ble satt til brønnene. De negative kontroll består hensiktsmessige volumer av PBS. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktighet 5% CO2 atmosfære og 95%.
Isolering av total RNA for Affymetrix HGU133 Plus 2,0 microarray og QRT-PCR-analyser genekspresjon
etter 24 timer ble cellene vasket to ganger i 5 ml sterilt PBS. etter den andre vask ble cellene resuspendert i 5 ml PBS. 2,5 ml av cellesuspensjonen ble benyttet for total RNA isolering. Total RNA fra de isolerte HT-29-celler ble ekstrahert med RNeasy Mini kit (Qiagen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. den isolerte RNA ble lagret ved -80 ° C.
mRNA uttrykk microarray analyse
kvantitet og kvalitet av den isolerte RNA ble testet ved å måle absorbans og ved kapillær gelelektroforese bruke 2100 Bioanalyzer og RNA 6000 Pico Kit (Agilent Inc, Santa Clara, USA). Biotinylated Crna prober ble syntetisert fra 4,82 ± 0,60 mikrogram total RNA og fragmentert hjelp av One-Cycle Target Merking og kontroll Kit henhold til Affymetrix beskrivelse. Ti ug av hver fragmentert cRNA prøve ble hybridisert til HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) ved 45 ° C i 16 timer. Mikromatriser ble vasket og farget ved hjelp av lufthåndtering Station 450 (Affymetrix) og et antistoff forsterkning farging metode i henhold til produsentens instruksjoner. De fluoriserende signaler ble oppdaget av en Genechip Scanner 3000 (Affymetrix).
Statistisk evaluering av mRNA uttrykk profiler
Pre-prosessering og kvalitetskontroll analyser ble utført i henhold til forslag til The Tumor Analysis Best Practices Working Group (Tumor Analyse Best Practices Working Group, 2004). Skannede bilder ble inspisert etter gjenstander; prosentandelen av tilstedeværende anrop ( 25%) og graden av RNA-degradering ble undersøkt. På grunnlag av evalueringskriterier, alle målinger oppfylte de minimale krav til kvalitet. I tilfelle av HT29 og HDFα celleforsøk, ble likheten av 2-2 replikater biologiske er angitt ved hjelp av den euklidske avstand metoden. Affymetrix uttrykk arrays ble pre-behandlet av gcRMA med quantile normalisering og median polsk samandrag.
Videre analyser for å identifisere forskjellig uttrykt funksjoner ble utført med betydning analyse av mikromatriser (SAM). Den nærmeste krympet Tyngdepunktet metode (prediksjon analyse av mikromatriser = PAM) ble brukt for prøve klassifisering fra genuttrykk data. Prediksjon analyse av mikromatriser benytter myk terskelverdier for å frembringe en krympet tyngdepunkt, som tillater valg av karakteristiske gener med høy prediktiv potensial (Tibshirani et al, 2002). Pre-prosessering, datagraving og statistiske trinn ble utført ved bruk av Bioconductor biblioteker i R-miljø. Stempler og funksjonell klassifisering av diskriminerende gener ble utført ved hjelp av Affymetrix NetAffx system.
revers transkripsjon og kvantitativ real time polymerase chain reaction
Etter kvantitativ (Nanodrop) og kvalitativ analyse (BioAnalyzer RNA 6000 Pico Kit chip kit RNA program; RIN 8 i alle tilfeller), ble revers transkripsjon utført ved hjelp av en mikrogram av total RNA (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, USA)
Kvantitativ sanntid (QRT. ) PCR ble utført ved anvendelse av prober Master og SYBR grønn (Roche GmbH, Tyskland). Genuttrykk nivåer for hver enkelt prøve ble normalisert til GAPDH uttrykket. Mean relativ genekspresjon ble bestemt og forskjeller ble beregnet ved bruk av to-A C (t) -metoden. Oligonukleotid primere av TLR 9 (MyD88 avhengig) signalveien er oppført i Tabell 1.
Celleviabilitet analyser
0.1×10
6 HT-29 celler ble sådd på en tettheten av 0.1×10
6 i Corning CellBIND cellekultur multibrønnplater i RPMI 1640, supplert med gentamycin og FCS. Etter 24 timer ble mediet forandret; og, 15 ug av tumor og normal DNA [oppløst i 200 pl sterilt fosfatbufret saltvann (PBS)] ble tilsatt til brønnene. Den negative kontroll består av et passende volum av PBS. Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktighets 5% CO2-atmosfære, og 95% i 72 t.
Etter 72 timers behandling, ble cellene høstet, vasket to ganger i 0,5 ml steril PBS, resuspendert i 1,0 ml av iskald 70% etanol og lagret ved -20 ° C. Målingen ble utført i tre paralleller for hver behandlingsgruppe.
Prøvene ble sentrifugert i 3 min ved 1300 rpm. Deretter ble cellene resuspendert i 300 μ1 ekstraksjonsbuffer; og 3 pl RNase (RNase A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Vilnius, Litauen) tilsatt. Etter 15 min inkubasjon ved romtemperatur ble 3 pl av propidium jodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat. No. 81845) ble tilsatt. FACS-målingen ble utført på BD FACSCalibur (New Jersey, USA).
trypanblått eksklusjons tester ble utført for å vurdere cellelevedyktigheten etter eksponering overfor tumor og normal cellefrie DNA. HT-29 cellens levedyktighet ble deretter kvantifisert ved å telle antall levende og døde celler ved hjelp av en hemocytometer på tidspunktet 72h post tumor og normal DNA administrasjon.
immunocytokjemisk analyse
Fra HT-29 cellesuspensjonen 2,5 ml ble brukt for immunocytokjemisk (ICC) analyser. HT-29 celler ble CYTO-sentrifugert på et dekkglass og fiksert i metanol ved -20 ° C i 10 minutter, og deretter inkubert i TBS inneholdende 1% bovint serumalbumin, 10% normalt geiteserum, 0,3 M glycin og 0,1% Tween 20 for 1 time til permeabilize cellene og blokkerer ikke-spesifikke protein-protein interaksjoner.
2×10
5 HDFα fibroblaster ble sådd til en Lab-Tek 8-brønn kammer lysbilder i 500 mL media (Thermo Scientific, Rochester, NY) og dyrket inntil 80-90% samløpet. Etter DNA-behandling ble cellene fiksert i iskald metanol ved -20 ° C i 10 minutter, og deretter inkubert i PBS inneholdende 1% bovint serum albumin, /10% normalt geiteserum, /0.3 M glycin og i 0,1% Tween 20, . TBS-Tween i 1 time for å permeabilisere cellene og blokkere ikke-spesifikke protein-protein interaksjoner
for farging ble cellene behandlet med muse-anti-humant monoklonalt anti-TLR9 IgG (1: 300; ab85860, Abcam, Cambridge, MA, USA), og anti-DNMT3a IgG (1: 300; ab13888, Abcam, Cambridge, MA, USA) ved 4 ° C natten over, ved hjelp av HeLa-celler som en positiv kontroll; anti-cytokeratin 20 (1: 200, klone: PCK-26, Dako, Glostrup, Danmark), E-cadherin (1: 2, klone: ECH6, Histopatologi Ltd, Pecs, Ungarn) ved hjelp av menneskelige colonic slimhinnen som en positiv kontroll; og kanin anti-NFkB IgG (1: 100, GTX102090, Genetex, San Antonio, Texas, USA) ved anvendelse av HepG2-celler som en positiv kontroll
Seksjoner ble inkubert i 30 minutter med peroksidase-merket polymer-pepperrot peroksydase. (HRP) konjugert til geite anti-muse /kanin immunoglobuliner (Envision + System-HRP-DAB, Dako, Glostrup, Danmark). Farging ble gjennomført ved inkubasjon med 3,3’diaminobenzidine kromogenløsning (kromogenløsning er en del av Envision kit). Seksjonene ble kontra med hematoksylin.
ICC evaluering
Lysbilder ble digitalisert ved hjelp av en høy oppløsning Panoramic Scan instrument (3DHistech Ltd, Ungarn) og analysert med Panoramic Viewer Histoquant Module programvare (3DHistech Ltd ., Ungarn). 1000 celler /lysbilde ble evaluert. I tilfelle av E-cadherin, CK20, ble cytoplasmatiske immunreaksjoner scoret som negativ (-), svak (+), moderat (++) og sterk (+++). NFkB, DNMT3a atom /cytoplasma uttrykk ble scoret som negativ (-), svak (+), moderat (++) og sterke (+++) immunreaksjoner. Tettheten av negative (-)., Svak (+), moderat (++) og sterk positiv (+++) piksler i immunreaktive celler ble evaluert
Resultater
Effekt av normal og ondartet epithelial DNA til HT-29 celler
Først behandles vi HT-29 celler med DNA isolert fra normal eller svulstvev. Begge behandlingene indusert mRNA overekspresjon av metalltioneinsystemene gener (dvs. MT1H, MT1G, MT1X, MT1P2 og MT2A) (metallothionein 1H, -1G, 1x, -1P2, 2a) (Fig 1A og 1B). Tumorvev avledet DNA-behandlingen resulterte i signifikant overekspresjon av n = 118 gener (på mRNA-nivå). Blant disse genene, observerte vi metastase forbundet gener f.eks tumor biomarkør CEACAM5 (carcinoembryonic antigen relaterte celleadhesjonsmolekyl 5), metabolske gener f.eks INSIG1 (insulin indusert gen 1) LIPG (endothelial lipase) og budbringer molekylet gener DAPP1 (dual adapter for fosfotyrosin og 3-phosphoinositides), CREB3L2 (cAMP responsive element binding protein tre-lignende 2) (tabell 2)
Heat kart som representerer RNA uttrykk endringer i kontroll HT-29 celler og HT-29 celler behandlet med DNA isolert fra friske (A) og tumorous (B) kolonepitelet.
En fullstendig liste over regulerte gener er tilgjengelig på (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) med tiltredelse antall GSE67557.
Analyse av 12 elementer av TLR9 sti i HT-29 celler ved QRT-PCR
i HT-29 celler enten svulsten og sunn kolon vev avledet DNA påvirkes i betydelig grad uttrykk for IL-1β gen knyttet til PBS behandlede kontroller. Overekspresjon av dette genet var høyere etter tumorvevet avledet DNA-behandling (log Fc 2,33; p≤0.05), enn i prøvene som er behandlet med normal DNA (log Fc 1,59; p≤0.05) knyttet til ubehandlede kontroller (Figur 2A og 2B).
Expression endringer av TLR9 MyD88 avhengig pathway gener på Affymetrix U 133 2,0 microarray i kontroll, prøver normale og tumor DNA-behandlet (A) figur og q RT-PCR analyse av TLR9 MyD88 avhengig sti HT-29 celler ( B).
celleviabilitet analyser
resultatene av trypanblått eksklusjon test reflektert at tumorcelle gratis DNA behandling betydelig økt levende celle nummer i forhold til kontrollgruppen (av. 54.22 ± 3,03 vs. 42,00 ± 3,78 p≤0.05). Vi har oppdaget også betydelig redusert antall levende celler i normal DNA behandlet gruppe relatert til kontrollgruppen (av 28,67 ± 3,08 vs. 42,00 ± 3,78. P≤0.05); (Fig 3A og 3B)
Antall levende (A) og død (B) HT-29-celler bestemt ved trypan blå eksklusjon test.; PI celle-syklus analyse av HT-29 tykktarm kreft celler (C).
PI cellesyklusanalyse viste signifikant høyere levende celle befolkning (G1 + S + G2 + M fase) i tumor-DNA behandlet gruppe vs. kontrollgruppen (av 39,11 ± 0,57 vs. 32,00 ± 2,50;. p≤0.05). Normal DNA behandling ikke påvirket cellesyklusen telles celler, men vi har observert en lavere celletall i normale DNA-behandlede prøver (figur 3C).
Effekt av normal og ondartet epitel DNA på fibroblast celler
Behandling av HDFα fibroblaster med normal-DNA førte til overekspresjon av mange gener i TLR9 MyD88 reaksjonsveien, cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, apoptose-relaterte gener, og prostaglandiner. I alt DNA fra normal tykktarm vev resulterte i en betydelig endring uttrykk for n = 613 gener (figur 4A). I motsetning til behandling med svulstvev-avledet DNA berørt uttrykk for bare n = 12 gener (figur 4B).
Heat kartet representerer RNA uttrykk endringer i kontroll HDFα celler og HDF-a celler behandlet med DNA isolert fra sunn (A) og tumorous (B) kolonepitelet.
Viktige genekspresjon endringer indusert av friskt vev opprinnelse DNA-behandling i HDFα-celler er oppsummert i tabell 3. den cellefrie DNA-indusert oppregulering av chemokine ligander som kjemotaktiske faktorer, prostaglandiner og prostaglandin reseptorer for, i tillegg til DNA-føler trasé.
Ved å følge svulst-DNA behandling av HDFα fibroblaster, observerte vi ikke overekspresjon av elementene i TLR9 vei, kjemokiner, vekstfaktorer , apoptose relaterte gener, prostaglandin og reseptorer for prostaglandin.
En komplett liste over regulerte gener er tilgjengelig på (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) med tiltredelse antall GSE67557.
Analyse av 12 elementer av TLR9 sti i fibroblaster ved QRT-PCR
Fem gener av kanoniske TLR9 pathway (IRAK2, MyD88, NFkB, IL-8, IL-1β) viste signifikant overekspresjon etter behandlingen med normalt vev avledet celle gratis DNA knyttet til kontrollceller. Svulstvev avledet DNA behandling ikke påvirket genene til TLR9 MyD88 veien. (Logg Fc ≥1; p≤0.05); (Fig 5A og 5B).
Expression endringer av TLR9 MyD88 avhengig pathway gener på Affymetrix U 133 2,0 microarray i kontroll, prøver normale og tumor DNA-behandlet (A) og q RT-PCR analyse av TLR9 MyD88 avhengige sti på HDF alfaceller (B).
ICC analyse av epithelial differensiering, vedheft og metylering markører
Her har vi plukket ut tre epiteliale markører dvs. CK20. E-cadherin, DNMT3a basert på våre tidligere resultater. [28] PBS behandlet HT-29 celler viste svak membran CK20 (Fig 6A), E-cadherin (Fig 6D) og svak /moderat cytoplasma DNMT3a (Fig 6G) protein uttrykk. Svulst-DNA behandling induserte økningen i ekspresjon av CK20 sterkt positiv (+++) piksler, (figur 6C) E-cadherin svak (+) og moderate (++) positive piksler (fig 6F) og DNMT3a svak (+) positiv piksler ( fig 6I). (P≤0.05). Tumor DNA fremmet CK20 og E-cadherin uttrykk i de ikke-differensiert, HT-29 colon adenokarcinomceller både mRNA og proteinnivå (Tabell 4, Fig 6C og 6F) (p≤0.05). DNMT3a protein overekspresjon korrelert med de tidligere resultater [28].
CK20 ekspresjon i HT-29 colon cancerceller etter behandling med steril PBS (A), ved hjelp av DNA fra normal tykktarm epitel (B), ved hjelp av DNA fra tumorous kolon epitel (C) E-cadherin uttrykk etter behandlingen med steril PBS (D), ved hjelp av DNA fra normal tykktarm epitel (E), ved hjelp av DNA fra tumorous tykktarm epitel (F) DNMT3a uttrykk etter behandlingen med steril PBS (G) , ved hjelp av DNA fra normal tykktarm epitel (h), ved hjelp av DNA fra tumorous kolon epitel (i).
ICC analyse av transkripsjonsfaktorer og metylering markører i fibroblaster
NF-kB (p65 subenhet) preget av svak cytoplasma /nucleolic uttrykk i PBS behandlet kontroll fibroblaster (fig 7D). Ved virkningen av normalt vev DNA (figur 7E), men ikke tumorvev stammer DNA, (figur 7F) fibroblastene reflektert økning i ekspresjon av NFkB svake positive bildeelementer (+).
DNMT3a ekspresjon i HDF alfa-fibroblaster etter behandlingen med steril PBS (A), ved hjelp av DNA fra normal tykktarm epitel (B), ved hjelp av DNA fra tumorous tykktarm epitel (C), NFKB uttrykk etter behandlingen med steril PBS (D), ved hjelp av DNA fra normal tykktarm epitel (E ), ved hjelp av DNA fra tumorous tykktarm epitel (F).
cytoplasmisk DNMT3a ekspresjon var på en svak (+), moderat (++) nivå i normale fibroblaster (figur 7A). Forholdet mellom svak (+) positive bildeelementer ble noe øket etter normale og tumor DNA-behandling (figur 7B og 7C).
Vårt immunocytokjemiske resultatene på HT-29 celler og fibroblaster HDFα er oppsummert i figur 8A, 8B , 8C, 8D og 8E.
ICC evaluering av CK20 (A), E-cadherin (B) og DNMT3a (C) på HT-29 tykktarm kreft celler og NFkB (D) og DNMT3a (E) i HDF alfa fibroblaster.
Diskusjoner
hoved~~POS=TRUNC med vårt arbeid var å undersøke endringer i genuttrykk etter administrasjon av cellefritt DNA isolert fra friske og tumorous colonic vev på HT-29 epitelceller og fibroblaster. Vi kjenner ikke til noen studier som har undersøkt uttrykk endringer i de to forskjellige celletyper samarbeid under tumorigenesis eller effekten av cellefrie DNA fra forskjellige opprinnelse. Ifølge nyere publiserte studier, aktiverer bakterielt DNA DNA følereseptorer, muligens på grunn av hyppigheten av unmethylated CpG sekvenser i bakteriegenomet, som er 20 ganger høyere enn i vertebrater «genom. [35] Fra flere studier ble det klart at DNA fra sykdomsfremkallende bakterier oppregulere ekspresjonen TLR9 [15], i den foreliggende undersøkelse har vi undersøkt genekspresjonen endringer indusert av DNA av tumor opprinnelse i kreftceller, etter hele genomet array. Denne fremgangsmåten er lik den som er rapportert av Lee et. al. (2014) som viste opptak, innlemmelse og effekten av dette svulstvev stammer DNA på celleproliferasjon. [13]
Vår genuttrykk resultatene blir bekreftet sluttar med observasjoner i nyere publikasjoner som viser at intakt svulst DNA binder som en ligand til TLR9, men resulterer ikke i nedstrøms aktivering av TLR9 veien [36]. I vår studie, våre hel-genom resultatene gitt bevis for at tumor DNA fungerer som en pro-metastatisk faktor uavhengig av TLR9 og STING trasé ved å fremkalle overekspresjon av metastaseassosierte gener (MACC1, MALAT1, TACSTD2), tumor markør (CEA) , metabolske gener (INSIG1, LIPG) og messenger molekylet gener (Dapp, CREB3L2). MACC1 er et viktig pro-metastatisk faktor som viste signifikant overekspresjon etter behandling med svulst DNA. Dette genet er nært knyttet til endringer av uttrykk for celle cycle- og invasjonsrelaterte proteiner. [37] Våre resultater reflekterer overekspresjon av andre viktige pro-metastaserende gener (MACC1, MALAT1, TACSTD2) er bekreftet av tidligere data som gjenspeiler stor rolle av disse genene i metastase og deres tilknytning til dårlig prognose i ulike menneskelige epiteliale kreftformer. [29, 37, 38]
svulstvev avledet DNA behandling påvirket INSIG en og LIPG uttrykk. Disse to viktige elementer av endothelial lipidmetabolisme er også kjent for å være assosiert med kreft progresjon. [31, 32] Økt LIPG uttrykk ble rapportert som en mulig urinveiskreft biomarkør. [32] Studier beskrevet økt uttrykk av sekundære budbringermolekyler (Dapp, CREB3L2) i tykktarmskreft med vekst og invasjon av tykktarmskreftceller via PI3K /AKT sti aktivering. [33]
Vi observerte at behandling med tumor-DNA også resulterer i overekspresjon av cytokeratin 20, og E-cadherin, som ble bekreftet både ved RNA (tabell 4) og proteinnivå (figur 6C og 6F ). E-cadherin som en meget viktig faktor som regulerer celle-celle-interaksjon viste også høyere ekspresjon i HT-29 celler behandlet med tumor-DNA. E-cadherin overekspresjon fører til undertrykkelse av β-catenin-Tcf /Lef avhengig transkripsjon og sannsynligvis hemmer celle-apoptose. [39]
DNA metylering endringer mediert av DNMT3a er karakteristisk for tykktarm kreft. Re-uttrykk faktorer rettet mot DNMT3a uttrykk betydelig redusert tumorvekst. DNMT3a overekspresjon etter behandling med tumor-DNA trekker slutninger en mulig forbindelse mellom metylering status av tumorvev avledet DNA og virkningsmekanismen av tumorvev avledet DNA-sekvenser som virker gjennom DNA-sensing receptors. Tidligere studier markere en viktig rolle i dette enzymet i tykktarmskreft formasjon. [40]
Tykktarmskreft vev er ikke isolert, men med sin cellulære miljøet gjennom chemokiner, cytokiner, vekst og apoptose signaler kommuniserer med andre vev. Studier har undersøkt hvilken rolle de normale og kreft assosiert fibroblaster (kafeer) i kolorektal kreft og viste at kafeer co-dyrket med epitelceller øker tumorvekst [41], men de trenger ikke bestemme hvilken rolle normale fibroblaster separat i tumorigenesis. Vårt mål var å bestemme reaksjonen av normale fibroblaster rundt epithelial krypter til den frigitte DNA og for å screene de veier som inngår i denne prosessen.
I normal fibroblast behandling med DNA fra normale vev forårsaket aktivering av TLR9 canonic pathway , som QRT-PCR viste overekspresjon av mange gener involvert i TLR9 MyD88 avhengig pathway (MyD88, IRAK2, NFkB, IL-8, IL-1β).
fra hele genomet microarray analyseresultater kan vi konkludere med at sunn DNA i fibroblast er ikke bare anerkjent av TLR9 MYD 88 avhengig vei, men vi fant ut at elementer av STING-avhengige cytosolic veien viste også betydelig overuttrykk, som initierer IFN produksjon. Bruke pathway kartet KEGG (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04623+340061) 4 gener (Adar, IRF7, CXCL10, CASP1) fra STING veien viste signifikant overekspresjon etter behandlingen med sunn DNA i HDF-a fibroblaster. Denne aktiveres CGAS /STING-avhengig DNA sensing vei indusert overekspresjon av interferon regulatoriske forhold IRF1, IRF2, IRF7, IRF9. og indusert økt uttrykk av interferon reseptorgenene (IFNAR2, IFNGR2). (Log FC≥1, p≤0.05) overekspresjon av CASP1 og NLRC 5 foreslå NLRC5 avhengig aktivering av inflammasome. Davis et. al. publisert som NLRC5 samarbeider med NLRP3and RNA interferens-mediert knockdown av NLRC5 nesten eliminert caspase en aktivitet. [42]
NFkB som en transkripsjonsreguleringsfaktor viste signifikant overekspresjon i fibroblaster behandlet av normal DNA. (Fig 7E) Det viser at cellefritt DNA indusert NFkB trans regulerer frigjøring av proinflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer.
Hele genomet microarray analyse viste en påfallende forskjellig antall gener som regulerer sunn og svulstvev avledet DNA administrasjon (613 og 12 gener, henholdsvis). Mens sunt DNA aktivert DNA sensing systemer og oppregulert mange gener for cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, apoptose relaterte gener, prostaglandiner, svulst DNA berørt bare noen få gener, som ikke involverer i denne reguleringsprosesser. Vi tror at normale fibroblaster ikke reagerer på svulst DNA og en langsiktig kreft-fibroblast interaksjon kan initiere en transformasjon av normale fibroblaster til carcinoma-assosiert fibroblaster støtte «metastatisk» fenotype.
Vår studie peker mulig metastase
