Abstract
biomarkører ved hjelp av massespektrometri (MS) har nylig sett en betydelig økning i søknader, hovedsakelig drevet av raskt fremme innen metabolomics. Instrumental og datahåndterings fremskritt har tillatt for vilkårlige metabolitt analyser som samtidig avhøre flere biokjemiske mekanismer for å belyse sykdoms fenotyper og terapeutiske mekanismer. Selv om de fleste MS-baserte metabolomic tilnærminger er kombinert med væskekromatografi, noen nylig publiserte studier brukt matrix-assistert laser desorpsjon (MALDI), slik at for rask og direkte analyse av prøver med minimal prøveopparbeidelse. Vi og andre har rapportert at prostaglandin E
3 (PGE
3), avledet fra COX-2 metabolismen av omega-3-fettsyre eikosapentaensyre (EPA), inhiberte proliferasjon av human lunge, tykktarm og kreft i bukspyttkjertelen celler. Men hvor PGE
3 metabolismen reguleres i kreftceller, spesielt humane ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler, er ikke fullt ut forstått. Her har vi med hell brukt MALDI for å identifisere forskjeller i lipidmetabolisme mellom to human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer, A549 og H596, som kan bidra til deres differensial respons på EPA behandling. Analyse ved hjelp av MALDI-MS viste at nivået av EPA inkorporeres i fosfolipider i H596-celler var fire ganger høyere enn A549-celler. Intriguingly, H596-celler produserte mye mindre PGE
3 enn A549-celler, selv om ekspresjon av COX-2 var lik i de to cellelinjene. Dette synes å være på grunn av den relativt lavere ekspresjon av cytosolisk fosfolipase A
2 (CPLA
2) i H596-celler enn for A549 celler. I tillegg er MALDI-MS tilnærmingen ble med hell brukt på tumor vevsekstrakter fra en K-ras-transgene musemodell for lungekreft for å forbedre forståelsen av virkningsmekanismen av EPA i
in vivo
modell. Disse resultatene markere nytten av å kombinere en metabolomics arbeidsflyt med MALDI-MS for å identifisere biomarkører som kan regulere metabolismen av omega-3 fettsyrer og dermed påvirke deres terapeutiske potensialer
Citation. Pirman DA, Efuet E, Ding XP, Pan Y, Tan L, Fischer SM, et al. (2013) Endringer i Cancer Cell Metabolism avslørt ved Direkte Sample Analysis med MALDI massespektrometri. PLoS ONE 8 (4): e61379. doi: 10,1371 /journal.pone.0061379
Redaktør: Julio Francisco Turrens, University of South Alabama, USA
mottatt: 20 november 2012; Godkjent: 08.03.2013; Publisert: 26 april 2013
Copyright: © 2013 Pirman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend CA144053-01A1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om mye innsats har vært viet til genomisk profilering fører til identifisering av visse gener komponenter av kreft, informasjon om metabolomics og lipidomics i kreftceller eller vev er begrenset. Selv om metabolomics og lipidomics posere teknologiske utfordringer i form av instrument evne, reproduserbarhet, og databehandling, disse fagene viser store løftet i å gi en helhetlig oversikt over en kreftcelle metabolisme, og dermed fører til nye og potensielt personlig terapi.
nye fremskritt i matrix-assistert laser desorpsjon /ionisering (MALDI) massespektrometri (MS), [1] – [7] har økt MALDI nytte over et bredt spekter av nye applikasjoner. Fremskritt i kommersielt tilgjengelige instrumenter, blant annet MALDI koplet til den lineære ionefelle Orbitrap instrument eller kvadrupol-time-of-flight (QTOF) massespektrometrene er tillatt for den vellykkede dannelse av massespektra i de lavere masse områder ( 1000 Dalton), og dermed gir for MALDI-MS profilering av metabolitter inkludert lipider, vanligvis ikke felles med MALDI instrumentering grunn matrix effekter og kilde fragmentering [7] – [9]. Disse fremskritt i MS og ionisering instrumentering har beveget MALDI-MS inn i en rekke nye forsknings områder, blant annet lipidomics [7], [10] – [12], peptid [2], medikament [13] – [16], og metabolitten [17 ] analyser direkte fra biologiske prøver, inkludert vev.
MALDI-MS har nylig blitt brukt med hell til direkte analysere biologiske prøver kombinert med statistiske data håndtering. Disse metodene kan brukes til å skille mellom vevstyper eller identifisere differensielt regulert metabolismeveier. For eksempel, idet den intra-kirurgiske prober som er utviklet av Balgo,
et al
., I hvilken vev blir samplet i løpet av kirurgisk reseksjon, analysert ved MS, kan deretter bli kategorisert med statistisk programvare [18]. Denne tilnærmingen har åpnet for hurtig, objektiv diskriminering av syke og friske vev og kan potensielt brukes til å erstatte tradisjonelle histologisk klassifikasjon under kirurgisk fjerning av en tumor. Nylig har MALDI-MS også blitt brukt til å klassifisere tumor karakterer, så vel som tumor-opprinnelse, men ikke intrasurgically [5], [19] – [21]. Disse nylig publiserte studier markere utvidet bruk av MALDI-MS for direkte vev analyse for å karakterisere vev på grunnlag av deres metabolitt, lipid, peptid og protein profiler.
I denne studien brukte vi MALDI koblet til en QTOF massespektrometer for rask avlesning av to NSCLC-cellelinjer for å vise forskjeller i den cellulære metabolismen av fiskeolje-avledede poly-umettede fettsyrer (PUFA) eikosapentaensyre (EPA). Vi har også tilpasset teknikken til direkte analysere og karakterisere vev lipid metabolismen av EPA fra EPA-behandlede K-ras transgen muselungesvulster med både væskekromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC-MS /MS) og MALDI-MS for å verifisere
in vitro
MALDI data ved hjelp av en komplementær tilnærming.
Mange prekliniske studier har støttet tanken om at fiskeolje-avledet omega-3 fettsyrene EPA og dokosaheksaensyre (DHA) har muligheten til å forebygge kreft celle spredning, migrasjon og invasjon i ulike krefttyper, inkludert NSCLC [22]. Vi og andre forskere har rapportert at effekten av EPA kan være mediert gjennom cyklooksygenase (COX) metabolitten prostaglandin E
3 (PGE
3) i human lunge, tykktarm, og kreft i bukspyttkjertelen celler [23] – [25 ]. I motsetning til DHA, kan EPA også virke som et substrat av COX, spesielt COX-2, som fører til en økning i PGE
3, i motsetning til arakidonsyre (AA), som gir opphav til pro-inflammatoriske metabolitt prostaglandin E
2 (PGE
2) (fig. 1) [22]. Høye nivåer av COX-2-aktivitet, og dermed PGE
2, er kjent for å være assosiert med økt celleproliferasjon og metastatiske potensiale i tumorer [26] – [28]. EPA har tidligere vist seg å være effektiv i å redusere A549 celleformering ved å øke produksjonen av PGE
3 og dermed øker PGE
3 /PGE
2-forhold [22]. Men hvordan andre faktorer assosiert med prostaglandinsyntesen påvirke anti-kreft effekt av EPA i NSCLC celler er ikke fullstendig evaluert.
Heri, ved hjelp av MALDI-MS på to NSCLC cellelinjer som uttrykker tilsvarende nivåer av COX-2, vi lykkes å identifisere forskjeller i den cellulære metabolismen av EPA. Med denne teknikken, kunne vi direkte og raskt (analyse tid 30 sekunder) avhøre differensial metabolisme, spesielt lipidmetabolismen, i hver celle linje i en reproduserbar måte. Ulike EPA-avledet lipid metabolisme ble også observert i lunge tumorvev avledet fra
K-ras
mutant mus. Tidligere studier har vist at vellykket protein profilering av humane lungekreft subtyper ved hjelp av MALDI-MS [29], men her viste vi potensialet av MALDI for ikke bare å skille cancer subtyper av deres distinkte lipidprofil men også for sporing biologisk effekt av behandling gjennom identifisering tilstrekkelige biomarkører. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten til direkte analysere kreftceller ved MALDI-MS, avslører forskjeller i cellenes stoffskifte, noe som kan være avgjørende for EPA-fremkalte kreft aktiviteter i NSCLC celler.
Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og A549-H596-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og holdt i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. A549 og H596-celler ble rutinemessig dyrket i DMEM /F12 media (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) supplert med henholdsvis 5% og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Hyclon Laboratories, Logan, UT, USA), og Penicillin -Streptomycin 100 x Løsning og 2 mM L-glutamin fra GIBCO (Invitrogen).
Immunoblotting
For Western blot, celler ved 70% konfluens ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) , trypsinert og cellepelletene ble oppsamlet. Pelleten ble vasket to ganger med kald PBS, og den resulterende pellet ble resuspendert i lyseringsbuffer (Invitrogen), ultralydbehandlet umiddelbart eller lagret ved -80 ° C. Cellelysater ble sonikert på is i 3 min (Misonix sonikator 3000, Farmingdale, NY, USA), og sentrifugert ved 14000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Proteinnivåer ble kvantifisert med en BioRad Dc proteinanalysen (BioRad, Inc., Hercules, CA). Like nivåer av protein (50 ug) ble løst på 7% (CPLA
2) og 10% (COX-2) SDS-PAGE-geler, og deretter overført til polyvinylidendifluorid-membraner, i henhold til standardmetoder. Etter en to-timers inkubasjon i 5% fettfri tørrmelk blokkeringsbuffer utarbeidet i Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween 20 (TBST), ble membraner undersøkt med CPLA
2 primær antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) eller COX-2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) ved 1:1000 fortynning i 2 timer, vasket i TBST, inkubert i sekundære antistoffer i 1 time, etterfulgt av 3 x 10 min vask hver i TBST. Proteinbånd ble visualisert via chemiluminesence hjelp av ECL-påvisning + kit og hyper-film (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Lik belastning av prøvene ble illustrert ved Western blotting av nærværet av β-aktin.
CPLA
2 aktivitetsanalyse
Aktiviteten av CPLA
2 ble bestemt ved anvendelse av en CPLA
2 testsettet (Cayman Chemical Company). I korthet, A549 og H596 (5 x 10
6) celler ble sådd ut i 100 mm skåler og tillatt å vokse over natten for å nå ~70% konfluens. Cellene ble vasket to ganger med kald buffer (50 mM Hepes, pH 7,4; 1 mM EDTA), skrapet med en celle løfter (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) og overført til et Eppendorf-rør på is. Etter ultralydbehandling i 3 minutter, ble lysatene sentrifugert ved 14000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble fjernet og konsentrasjonen av proteiner ble bestemt ved BioRad Dc proteinanalyse. For aktivitetsanalysen, ble volumet tilsvarende 1 ug protein som brukes. Absorbansen ble avlest ved 414 nm på en Spectra Max M5 plateleser (Molecular Devices Corp, Sunnyville, CA, USA). Den CPLA
2 aktivitet ble uttrykt i mikromol /min /ml som bestemt av formelen gitt i produsentens protokoll.
K-ras transgen muse
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center. For å vurdere lipid metabolismen av EPA i mus lungevev, fem uker gamle
K-rasLA
C57BL6 /129 /sv F1 mutante mus ble anvendt som en spontan lungetumor modellen og foret med en diett inneholdende soyabønneolje eller EPA (1% og 2%) i 9 uker. Ved slutten av den niende uke ble musene avlivet, lunge vev ble fjernet, flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil videre analyse ved hjelp av MALDI-MS.
Analyse ved MALDI- MS
Cells (1 × 10
6) ble sådd i 6-brønners plater og dyrket over natten. Cellene ble deretter behandlet med EPA (25, 50, eller 100 pM) i serum-fritt medium inneholdende 1% BSA i 24 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble intakte celler oppsamlet ved trypsinering, sentrifugert ved 3000 rpm i 2 minutter ved 4 ° C, vasket i PBS, og cellepelleten ble resuspendert i 20 mL PBS. Cellene ble enten lagret ved -80 ° C eller umiddelbart behandlet for MALDI-MS-analyse.
For MALDI-MS-analyse av cellene ble cellepelletene opptint og 1 mL av suspensjonen ble flekket på en polylysin-belagt glass-slide (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) brukt som en MALDI mål. For MALDI-MS analyser av vevsprøver, ble 10-30 mg vev homogenisert i 500 mL PBS ved hjelp av en Precellys vevshomogenisator (Bertin Technologies, Paris, Frankrike). En porsjon av 1 mL av homogenatet ble oppdaget på en polylysin belagt glass lysbilde. Cellesuspensjoner og vev homogenat ble tørket i en vakuum-eksikator ved romtemperatur i 10 min. Dihydroksybenzosyre (DHB) (20 mg /ml) i kloroform /etanol (09:01;
v /v
) ble påført på prøvene ved spray-maling gjennom en Meinhard forstøver (Meinhard, Golden, CO, USA). Den kloroform /etanolblanding tillates hurtig krystalldannelse i løpet av cellene mens hindre sammenslåing av matriksen løsningsmiddel. Massespektra ble samlet på et Waters Synapt G1 QTOF massespektrometer (Milford, MA, USA). For lipid identifikasjon, ble nøyaktig masse og MALDI-MS /MS-data samlet inn på en Thermo Scientific MALDI LTQ Orbitrap massespektrometer (San Jose, CA, USA).
LC-MS /MS
prostaglandiner E
2 og E
3 (PGE
2 og PGE
3), ble ekstrahert i henhold til den tidligere publiserte fremgangsmåten fra Yang
et al
. [30], [31]. I korte trekk ble en delmengde av 0,5 ml PBS-buffer tilsatt til det frosne vev eller cellepellets, etterfulgt av homogenisering i 1,5 ml rør med keramiske kuler ved hjelp av Precellys vevshomogenisator (Bertin Technologies) og 400 pl aliquoter ble anvendt for prostaglandin ekstraksjon. Alle prosedyrer ble ekstraksjon utført under minimalt lys. Prøvene ble deretter rekonstituert i 100 ul metanol /0,1% eddiksyre (50:50,
v /v
) før analyse ved LC-MS /MS [31].
Det ekstracellulære nivåer av PGE
2 og PGE
3 i A549 og H596 celler ble hentet ifølge Yang
et al product: [22]. PGE
2 og PGE ble kvantifisert
3 ved LC-MS /MS ved hjelp av en Agilent 6460 trippel kvadrupol (qqq) massespektrometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) utstyrt med en Agilent HP 1200 binær pumpe HPLC innløp (Agilent). PGE
2 og PGE
3 ble separert ved anvendelse av en 2 x 100 mm Kinetex 3 μ C18 analytisk kolonne (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Den mobile fase besto av 0,1% maursyre og acetonitril med 0,1% maursyre. Kolonnetemperaturen ble holdt ved 40 ° C, og prøvene ble holdt ved 4 ° C i løpet av analysen. Individuelle analytter ble oppdaget ved hjelp av electrospray ionisering og flere reaksjon overvåking, og følgende
m /z
overganger ble overvåket i negativ ionisering modus med:
m /z
351 → 271 for PGE
2,
m /z
349 → 269 for PGE
3, og
m /z
355 → 275 for PGE
2-d
4. Nivåene av PGE
2 og PGE
3 ble kvantifisert ved anvendelse av autentiske standardkurver og normalisert til enten antall celler (intracellulært eller ekstracellulært) eller mengden av protein bestemt ved en Bradford-analyse (Bio-Rad).
Statistisk analyse
Hver biologisk replikat ble observert to ganger og analysert to ganger ved MALDI-MS og forsøkene ble gjentatt tre ganger. Eksportert spektra fra hver gruppe ble lastet inn i Metaboanalyst online programvare (Metaboanalysis 2.0, Tilgjengelig:. https://www.metaboanalyst.ca/nås mai 2012) [32], [33]. Dette online programvare tilbyr en rekke statistiske verktøy for å redusere komplekse spektra og identifisere vesentlig endring
m /z
verdier. Hovedkomponentanalyse (PCA), partiell minste kvadraters diskriminere analyse, t-tester, og analyse av varians ble benyttet for å analysere de resulterende MS-data både for å identifisere endringer i topper og for å bestemme hvorvidt de celletyper eller vev kan skjelnes fra hverandre . Betydelig ulike funksjoner ble deretter sammenlignet med de fra både Human metabolomet Databank (HMDB, Tilgjengelig: https://www.hmdb.ca nås mai 2012.) Og METLIN (Tilgjengelig: https://metlin.scripps.edu/. nås mai 2012) database for sammensatte karakterisering.
Resultater
EPA metabolisme ble forskjellig regulert i NSCLC A549 og H596 celler
Som vi rapporterte tidligere, anti-proliferativ effekt EPA i humane NSCLC-celler ble formidlet gjennom deres ekspresjon av COX-2 og dannelsen av anti-proliferativ metabolitt, PGE
3 [22]. Men når vi har behandlet to NSCLC A549 og H596 celler med EPA, EPA hemmet spredning av A549 celler (IC
50 6,25 mm) mer effektivt enn det gjorde de H596-celler (IC
50 50 M) ( fig. 2A), selv om disse to cellelinjene viste lignende COX-2 ekspresjon (fig. 2B). For å avgrense de mekanismer som formidler de differensielle effekter observert med EPA behandling, vi har evaluert forskjellige massespektrale profiler av disse cellelinjer ved hjelp av MALDI-MS, etterfulgt av PCA-analyse (fig. 3). Til å begynne med denne analysen ble bare brukt til å bestemme om den oppsamlede MS-spektrene kan faktisk brukes for å diskriminere mellom celletype og behandlede versus ubehandlede prøver. Betydelig endring topper identifisert av p-verdier og 0,05 ble undersøkt og identifikasjon forsøkt inkludert PC lipider videre diskutert. Den MALDI-MS spektra av ubehandlede A549 og H596 celler viste svært like metabolske /lipidomiske signaturer (fig. S1 A og S1B) bortsett fra noen små variasjoner i signalintensitet og dermed ikke differensiert etter PCA analyse, EPA-behandlede A549 og H596 celler avvek i det vesentlige i deres metabolske /lipidomiske-profiler (fig. 4). Etter EPA behandling ble metabolitten mønster i de to cellelinjene lett differensieres ved å observere nye og opp-regulert topper, noe som tyder på at cellulær metabolisme av EPA i disse to cellelinjene er differensielt regulert (fig. S1C og S1D).
(A). Den anti-proliferative effekt av EPA i human ikke-småcellet lungecancer A549 og H596-celler (B). Eksponering av A549-celler til EPA i 72 timer ga en ti-ganger sterkere inhibering av celleproliferasjon i A549-celler enn det i H596-celler.
Celler ble ubehandlet (A) og behandlet med 50 uM EPA ( B). Ubehandlede A549 og H596-celler hadde lignende massespektra (A). Imidlertid, etter EPA behandling førte til en tydelig differensiert metabolsk mønster mellom disse to cellelinjer (B). Dataene er representative for to biologiske replikater med gjentatt analyse. Et gjennomsnitt på 25 massespektra ble samlet og gjennomsnitt fra hver celle sted. Mengden av tid for hver analyse var mindre enn ett minutt. Dataene ble representert fra tre eksperimenter replikert.
En betydelig økning ble observert i
m /z
802,5, noe som tilsvarer en PC (36:5) fettsyre. MS /MS bekreftet at PC (16:00 /20:05) var en komponent av den observerte
m /z
verdi (data ikke vist). Spektra er vist i (C) og (D), som korresponderer med A549 cellene linje ubehandlet og behandlet EPA; henholdsvis også viser en økning i
m /z
802,5 etter behandling med EPA. Dette er imidlertid øke betydelig mindre enn økningen som ble observert for H596-cellelinjen.
Høyere nivå av EPA inkorporering i fosfatidylcholin (PC) i H596 enn i A549-celler
Ytterligere inspeksjon av den oppsamlede spektrene gir innsikt i differensielt regulert EPA metabolisme i disse to spesielle cellelinjer, som er vist i fig. 4. Toppene som vises i denne figur representere fettarter med både varierende acyl-kjedelengde og grad av umettethet. For eksempel
m /z
804,5 representerer sodiated PC som inneholder to acyl-kjedene til sammen 36 karboner med 4 dobbeltbindinger (36:4). Fra tidligere publiserte resultater, kan en rimelig antagelse gjøres som en acyl-kjeden inneholder 16 karboner med null dobbeltbindinger, og at den andre kjeden inneholder 20 karbonatomer og fire dobbeltbindinger (AA moiety) [7]. Mest vanlig, opptar den umettede del SN2-posisjonen på phosphoglycerol ryggraden; imidlertid, som lipid nedbrytning og regenerering er kontinuerlig i bevegelse, strukturene er i kontinuerlig endring, slik at absolutt lipid-strukturbestemmelser vanskelig til enhver tid. Fig. 4B viser også en femdobling i
m /z
802,5 [M + Na]
+ av PC i H596-celler etter behandling med EPA sammenlignet med celler behandlet med bilen alene. Videre MALDI-MS /MS-analyse identifiserte denne massen til faktisk bestå av en PC mest sannsynlig avledet fra EPA som PC (36:5) (fig. S2). Den observerte økningen av PC (36:5) er knyttet til inkorporering av EPA fettsyre på PC’en, eventuelt i sn2-stillingen. Til sammenligning var tilsvarende metabolitt fra A549-celler (fig. 4C og 4D) viser kun en marginal økning i
m /z
802,5. Derfor kan disse forskjellene i cellenes stoffskifte spesielt være korrelert til H596 celler ved EPA behandling. Sammenligning av den ubehandlede celle spektra for PC (36:4) intensiteter i begge cellelinjene resulterte i tilsvarende verdier, som angir disse to cellelinjene har lignende evne til å danne slike PC-arter. Dette resultatet tyder på at A549 og H596 celler avvike minimalt i biosyntesen av PC, men kan ha ulike evner til å regulere utnyttelsen av EPA fra PC.
For å generere sammenlignbare beregninger mellom de to cellelinjer og tar høyde for eventuelle MALDI signalintensitetsvariasjoner, hver fettsyre PC (
m /z
802 og 804) var normalisert til signalstyrken for PC hodet gruppe (
m /z
184), som i hovedsak former via kilde fragmentering. Forutsatt at det totale PC-innhold mellom de to cellelinjer er like, tjener dette ion som et passende normaliserende ion, så det kan bli brukt til å representere hele PC-arter. Denne tilnærmingen ble begrenset til PC-arter med en 16:00 acyl-kjede ved posisjon SN1 og PUFA substitusjon i sn2-stilling for å forenkle sammenlikning. Liknende beregninger kan gjøres med økende SN1 acyl-kjedelengde. Fra beregningene, en betydelig økning i PC (36:5) og PC (36:4) er observert i H596-celler etter behandling med EPA (tabell 1). Økningen i PC (36:5) kan tilskrives dannelsen av PC-arter med en EPA rest tilsettes ved SN2-posisjonen til PC-gruppene. Økningen i PC (36:4) er et tegn på skifte bort fra AA inn i COX-2 vei mot det av EPA. En økning i både PC-arter er også observert i A549-cellelinjen; Men er denne effekten ikke så dyp som den som ble observert i H596 cellelinje.
H596 generert lavere nivåer av PGE
3 enn gjorde A549 celler
Siden MALDI- MS-data antyder at EPA var primært observert i et fosfolipid form i H596-celler, men ikke i A549-celler, og begge disse cellene har lignende fosfolipid-biosyntetiske evner, er vår nåværende hypotese at det kan være forskjeller i enten ekspresjonen eller aktiviteten av fosfolipase A
2 (CPLA
2), et enzym som frigjør fettsyrer fra SN2-posisjonen av glycerol ryggraden. Denne endring kan føre til de forskjellige egenskaper av H596 og A549-celler til å danne PGE
3 på substratet ledig, og dermed begrense den anti-proliferative virkninger av EPA i H596-celler.
Vi først sammen den intracellulære og ekstracellulære nivåer av PGE
3 i H596 og A549-celler behandlet med EPA (50 uM). Som vist på fig. 5, det intracellulære nivået av PGE
3 var nesten to til fire ganger høyere, ved tidspunkter opp til 20 timer i A549-celler enn i H596-celler, mens en større mengde av ekstracellulært PGE
3 var observert i A549-celler enn i H596-celler etter 4 timers behandling. For ytterligere å teste vår hypotese, vi kommet frem til proteinnivået av CPLA
2 så vel som dens aktivitet i disse cellene. Som vist i figur 6, protein ekspresjon av CPLA
2 var betydelig høyere i A549-celler enn den for H596-celler (Fig. 6A). På samme måte aktiviteten av CPLA
2 var fire ganger høyere hos A549-celler enn den for H596-celler (fig. 6B). Sammen utgjør disse data tyder på at utgivelsen av EPA i H596 celler fra EPA-innlemmet PC var mye mindre enn i A549 celler på grunn av begrenset uttrykk og aktivitet av CPLA
2 i H596-celler, som støtter hypotesen om at EPA metabolisme er forskjellig regulert , som foreslått av MALDI-MS-analyse.
(A) celler ble behandlet med EPA i forskjellige tidsrom som angitt og intakte celler ble oppsamlet ved trypsinering og underkastet analyse ved hjelp av LC-MS /MS. Intracellulære nivåer av PGE
3 i A549-celler var minst dobbelt høyere enn i H596-celler. (B) cellekulturmedier ble samlet ved forskjellige tidspunkter som vist og underkastet fastfase-ekstraksjon. Ekstracellulære nivåer av PGE
3 ble så analysert ved LC-MS /MS. Dataene er representative for to adskilte eksperimenter
(A) Protein uttrykk for cPLA2 i A549 og H596 cellen ble bestemt ved Western blotting.; (B) Aktivitet av cPLA2 i A549 og H596-celler ble målt som beskrevet tidligere. Både protein nivå og aktivitet av cPLA2 var signifikant lavere i H596 celler sammenlignet med A549 celler.
EPA endret fettmetabolismen i K-ras mus lunge tumorvev
For å avgjøre om MALDI-MS kunne brukes til å observere forandringer i vev metabolisme
in vivo
, etter at kosten forbruk av EPA, ble forsøk også utført på lunge vevsekstrakter fra genetiske K-ras mutante mus. Massespektrene samlet inn direkte fra lungevev som strekker seg fra
m /z
800-840 er vist i fig. 7. Fra den direkte vev analyse med MALDI, kan virkningen av hver diett observeres fra lipid profiler av svulsten. Etter fôring EPA (Fig. 7A), tilsvarende PC-arter med EPA (
m /z
802 og 830) acyl-gruppen ble oppregulert sammenlignet med det i soyabønner diett gruppen. Intriguingly, forholdet mellom PGE
3 over PGE
2 ble signifikant øket fra 0,011 ± 0,004 i vev fra soyabønne-matet mus til 0,063 ± 0,03 (1% EPA) og 0,42 ± 0,11 (2% EPA) av lunge vev avledet fra mus tilføres EPA (fig. 7B). Observasjonen av EPA inkorporering i PC-artene korrelerte godt med forholdet av PGE
3 /PGE
2 detektert fra de samme vevsprøver ved LC-MS /MS, noe som tyder på at EPA førte til svulstens skifte i metabolisme fra produsere den proliferative metabolitten PGE
2 til anti-proliferativ metabolitt PGE
3 gjennom COX-2 pathway.
A). MALDI massespektra samlet inn direkte fra tumorvev lysatene av K-ras mutant lungesvulster, enten ubehandlet eller behandlet med EPA. Observerte endringer i lipid katabolisme fra AA til EPA er innrammet, viser betydelige endringer i tumor stoffskiftet. B). Forhold av PGE
3 /PGE
2 hentet fra svulstvev avledet fra K-ras transgen musemodell. PGE
2 og PGE
3 ble kvantifisert ved LC-MS /MS. Disse dataene representerer svulst stoffskifte skiftet fra å produsere AA avledet PGE
2 til PGE
3 fra EPA og dermed utløse en anti-proliferativ effekt.
Diskusjoner
Den innledende målet med denne studien var å bestemme hvorvidt differensial responsen av NSCLC-cellelinjer til EPA behandling kunne måles ved direkte analyse med MALDI-MS. Selv om de statistiske verktøy ansatt kan ikke direkte diskriminere mellom de to cellelinjene før behandling, kan vi med hell skille cellelinjer basert på deres massespektra profiler følgende EPA behandling. Disse data har ført til en økt forståelse av den biologiske mekanismen som er ansvarlig for H596-celler «forholdsvis lavere følsomhet for EPA behandling enn den til A549 celler, til tross for at ekspresjon av COX-2-protein var lik i begge cellelinjer. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten til direkte analysere kreftceller ved MALDI-MS, avslører forskjeller i cellenes stoffskifte, som kan være en indeks for EPA-fremkalt kreft aktiviteter i NSCLC celler. Denne enkle MALDI-MS tilnærming tillatt for avhør av lipid signalveier som opererer i NSCLC cellelinjer.
Når du bruker MALDI-MS uten analytisk separasjon har mange ulemper, blant annet ion undertrykkelse, MALDI matrise-forstyrrende ioner, og manglende evne til å skille isobariske endogene art, har teknikken fremdeles et stort potensial i sin evne til direkte målinger fra biologiske prøver. Dette har blitt eksemplifisert ved den nylige veksten i MALDI bildebehandling MS applikasjoner [34]. Ytterligere fremskritt i direkte biologisk analyse av MS teknikker, slik som matrix-free ioniseringsteknikker eller atmosfæriske desorpsjon teknikker, vil gi rom for en større bredde av metabolomic og lipidomiske dekning.
Disse teknikkene kan være spesielt nyttig når du kombinerer klassisk kvantitativ målrettede metabolomic tilnærminger. Som rapportert her, ved hjelp av MALDI-MS for å undersøke forskjeller i fettmetabolismen etter behandling celler med EPA har ført til en mulig karakterisering av fenotype av NSCLC A549 og H596 celler. I tillegg er lignende metabolske skift i H596 og A549-celler ble også observert i cellene blir behandlet med arachidonsyre, dvs. toppintensitet av PC (36:4), AA-innlemmet PC, var høyere i H596-celler enn i A549 cellene (data ikke vist). Dermed disse resultatene tyder på at differensial metabolske mønstre som genereres i cellene ikke ble substratet avhengig, heller mest sannsynlig var avhengig av fenotypen til disse to cellelinjer. De MALDI-MS resultater ble begrunnet med ytterligere avhør av COX-2 sti og dens EPA metabolitt PGE
3 ved hjelp av kvantitativ LC-MS /MS. Gitt at fettsyrer, slik som EPA eller AA, må frigjøres fra fosfolipider i membranen ved CPLA
2 for å få dem til å bli utnyttet av COX eller lipoksygenaser, tyder disse data på at CPLA
to differensielt regulert i disse to NSCLC-celler. Faktisk, observerte vi både lavere uttrykk og aktivitet av CPLA
2 i H596 enn for A549 celler. Vi er for tiden vurdere om CPLA
2 er kritisk for EPA-fremkalte anti-proliferativ aktivitet gjennom sin COX-2-metabolitten PGE
3 i NSCLC celler.
De statistiske verktøy som brukes guidet oss i å skille mellom disse cellelinjer og hjalp oss med å identifisere en forskjell i metabolitter mellom behandlingsgruppene. PCA og diskriminere analyse (data ikke vist) ble anvendt som en preliminær verktøy for enkelt å identifisere forskjeller i massespektra av celler eller vev med eller uten behandling av EPA. Vi var i stand til å identifisere noen av funksjonene som tilsvarer disse forskjellene, men direkte masse spektral tolkning ble til slutt utnyttet.
