Abstract
Tradisjonell kinesisk medisin har vunnet popularitet på grunn av sin evne til å drepe kreftceller. Nylig har de apoptotiske og antiangiogene effekter av Trametes robiniophila Murr (Huaier) undersøkt. Målet med denne studien var å undersøke dets effekt på cellemobilitet og tumorvekst i eggstokkreft. Celleviabilitet og bevegeligheten ble målt ved hjelp av SRB, skrape og migrasjon analyser. Celle apoptose ble analysert ved hjelp av annexin V /PI farging. Ved hjelp av en reversfase-protein array (RPPA) assay, analyserte vi nivåene av 153-proteiner og /eller phosphorylations i Huaier-behandlede og ubehandlede celler. Huaier inhiberte cellelevedyktighet og induserte både tidlig og sen apoptose i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hei-celler i en tids- og doseavhengig måte. Cell invasivitet og migrasjon ble også undertrykket betydelig. De RPPA Resultatene viste signifikante forskjeller (på minst 30%; p 0,05) i nivåene av 7 molekyler i SKOV3-celler og 10 i SKOV3.ip1 celler mellom de ubehandlede og behandlede celler. De fleste av molekylene identifisert spille roller i celle-proliferasjon, apoptose eller celleadhesjon /invasjon. Western blot-analyse ytterligere bekreftet at Huaier behandling resulterte i redusert AKT-fosforylering, økt ekspresjon av total GSK3P, inhibering av fosforylering av GSK3P på S9, reduksjon av både cytoplasmatisk β-catenin ekspresjon og nuclear β-catenin translokasjon, og transcriptional undertrykkelse av flere Wnt /β-catenin målgener (
DIXDC1, LRP6, WNT5A
, og cyclin D1). Etter banket ned GSK3p kan β-catenin uttrykk ikke bli hemmet av Huaier. Til slutt, Huaier hemmet veksten av eggstokkreft tumorxenografter in vivo. Disse studiene viser at Huaier hemmer tumorceller mobilitet i eggstokkreft via AKT /GSK3p /β-catenin signalveien
Citation. Yan X, Lyu T, Jia N, Yu Y, Hua K, Feng W ( 2013) Huaier Vandig ekstrakt Hemmer Eggstokkreft cellemotilitet via AKT /GSK3p /β-catenin Pathway. PLoS ONE 8 (5): e63731. doi: 10,1371 /journal.pone.0063731
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 9. oktober 2012; Godkjent: 05.04.2013; Publisert: 8. mai 2013
Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation of China, gi nummer 30973185 (https://www.nsfc.gov.cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er en ledende årsak til død av gynekologisk kreft i USA og den femte vanligste årsaken til kreftdødelighet hos kvinner [1]. Forekomsten av kreft i eggstokkene øker med alderen. Sytti prosent av pasientene stede med avansert sykdom, og mindre enn førti prosent kunne bli kurert. Den totale overlevelsen av avansert eggstokkreft har ikke vist seg å være lovende, selv etter operasjonen, kombinert med nye adjuvant strategier, for eksempel høydose kjemoterapi med perifert blod stamcelletransplantasjon, dose-tett ukentlig paclitaxel med carboplatin og målrettet behandling med carboplatin /paclitaxel. Nylig, resultater fra en randomisert fase III studie (GOG 0208) viste at bruk av bevacizumab (en endotelial vekstfaktor reseptor antistoff) under og opp til 10 måneder etter carboplatin og paclitaxel kjemoterapi forlenger median progresjonsfri overlevelse etter ca 4 måneder i pasienter med fremskreden ovarialcancer [2]. Imidlertid er den totale overlevelse lik konvensjonell behandling til tross for den høye kostnad. Fordi ingen av disse strategiene kan helt beskytte eggstokkreft pasienter fra tilbakefall og metastasering, nye medikamenter presserende behov.
Blant komplementær behandling, har tradisjonell kinesisk medisin (TCM) vunnet popularitet for sin evne til å drepe kreftceller med mindre skade på normale celler. I tillegg er TCM urte behandling relativt billig og har blitt rapportert å øke kjemoterapi effekt, å redusere toksisiteten, forlenge overlevelsestiden og forbedre livskvaliteten og immunfunksjoner [3]. Trametes robiniophila Murr (Huaier) er en type sopp fra Kina som er brukt i TCM for ca 1600 år. Imidlertid har sin anti-tumorvirkninger og mekanismer er kun undersøkt i de senere år. De effektive bestanddeler ble ekstrahert og analysert ved høy-ytelse væske chromatophy (HPLC) og natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse, som identifisert proteoglykaner som hovedkomponentene i den Huaier ekstrakt, som besto av 41,53% polysakkarider, 12,93 % aminosyrer og 8,72% vann [4], [5]. Stoffet, som er godkjent av den kinesiske Food and Drug Administration (FDA), har vært brukt i hepatocellulære kreftpasienter. In vitro-forsøk viste at Huaier kan hemme veksten av hepatokarsinom celler (HepG2, MHCC97H), human lunge adenokarsinom celler (A549) og humane brystkreftceller (MCF-7, MDA-MB-231) ved å indusere apoptose [6] – [8]. Nylig har Wang et al. rapporterte at Huaier ekstrakt kan tjene som et potent anti-angiogent og antitumormiddel [9]. Men om Huaier påvirker den biologiske oppførsel av ovarie-celler har ikke vært undersøkt. I denne studien, i tillegg til sin anti-proliferative og apoptotiske effekter, den nye muligheten for at Huaier utøver en anti-invasiv effekt i eggstokkreft celler via AKT /GSK3P /β-catenin signalveien ble undersøkt.
materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
RPMI-1640 medium ble kjøpt fra Jinuo Co., Ltd (Shanghai, Kina). Føtalt bovint serum (FBS) ble levert av Gibco-BRL (Rockville, IN, USA). Antistoffer mot AKT (1:1000), Pakt-Thr308 (1:1000), PS6-S235 (1:1000), PS6-S240 (1:1000), cyclin D1 (1:2000), cyclin A (1:2000 ), E-cadherin (1:1000), glykogen syntase kinase 3 beta (GSK3p, 1:1000), GSK3p fosfor S9 (1:500, Epitomics, CA, USA.) og β-catenin (1:1000) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Den anti-histon H1 (1:300) og anti-mus og anti-kanin-IgG-pepperrot-peroksidase (HRP) (1:5000) antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (1:3000) og anti-β-aktin (1:3000) ble kjøpt fra Biyuntian Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). Alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, USA) og Biyuntian Biotech Co., Ltd
Utarbeidelse av Huaier vandig ekstrakt
elektuar salve Huaier var en gave fra Gaitianli Medicine Co Ltd (Jiangsu, Kina). Fremstillingsfremgangsmåter for den Huaier ekstraktet og dets bestanddeler er blitt beskrevet andre steder [4], [5] totalt 2 g av latverge salve ble oppløst i 50 ml fullstendig medium og sterilisert med et 0,22 um filter for å oppnå 40 mg /ml stamløsning som ble lagret ved -20 ° C.
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
De tre typer av ovarie epiteliale kreftcellelinjer ble anvendt i denne studien. SKOV3 og Hey celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection. SKOV3.ip1 celler var gaver fra University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas) [10]. Cellelinjer ble rutinemessig opprettholdt i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2.
celleproliferasjonsanalyse
veksthemmende virkning av Huaier ble bestemt ved anvendelse av en sulforhodamin B (SRB) assay. I korthet SKOV3-celler (2,5 x 10
3), SKOV3.ip1 celler (2 x 10
3) og Hey-celler (1,5 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med den Huaier vandige ekstrakt ved forskjellige konsentrasjoner. På de angitte tidspunkter ble cellene vasket, fiksert med 30% (vekt /volum) trikloreddiksyre, og farget i 30 minutter ved romtemperatur med 0,4% sulforhodamin B (SRB) i 1% eddiksyre. Fargestoffet ble vasket med 1% (volum /volum) eddiksyre og deretter oppløst i en 10 mM Tris-base-løsning. Platene ble avlest med en mikroplateleser (Bio-Rad) ved 570 nm. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer og gjentas minst tre ganger
Annexin V /PI farging
The Dead Cell Apoptose kit med Annexin V Alexa Fluor® 488 Propidiumjodid (PI) (Invitrogen, CA, USA) ble anvendt for å undersøke hvorvidt behandling med Huaier indusert de SKOV3-celler, SKOV3.ip1 celler og Hei-celler til å gjennomgå apoptose. Cellene ble fluorescensmerkede følge instruksjonene fra produsenten. I korte trekk dyrkede SKOV3-celler (2 x 10
5), SKOV3.ip1 (2 x 10
5) celler og Hei-celler (5 x 10
3) i en 35 mm skål ble behandlet med forskjellig konsentrasjoner av Huaier i 48 timer. Cellene ble høstet og resuspendert ved 1 x 10
6 celler /ml i bindingsbuffer. Deretter, grønt fluorescerende fargestoff (AlexaFluor® 488) -konjugert annexin V og PI ble tilsatt og inkubert i mørke i 15 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble analysert ved hjelp av et FACScan strømningscytometer (Beckman) er utstyrt med Cellquest-programvare. Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet fra prosenten av celler i den nedre høyre (LR) kvadranten av dot plottet, som representerer antallet tidlige apoptotiske celler (annexin V + /PI-) dividert med det totale antall celler. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
In vitro-assay bunnen
En in vitro bunnen analyse ble utført for å vurdere hvor cellemigrering ble påvirket av administrasjonen av Huaier vandige ekstrakt. Totalt 2 × 10
4-celler ble sådd i en 24-brønns plate. Referansepunkter i nærheten av den «scratch» ble merket for å sikre bruk av den samme område for bildeopptak. Etter en 24-timers inkubasjonstid, ble sammenflytende monolag av SKOV3, SKOV3.ip1 og Hei celler riper ved hjelp av en 200 mL pipette tips for å lage en straight «scratch». Etter vasking 2 ganger med PBS, serumfritt medium inneholdende Huaier ekstrakt (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn. Skrape bredde ble målt ved fire forhåndsdefinerte steder i starten og på 12 og 24 timer etter ripe i SKOV3 og SKOV3.ip1 celler. Og grunnen bredde ble målt i Hey celler på starten og ved 6 og 12 timer etter scratch. Avstandene mellom de 2 kantene av bunnen ble målt ved referansepunktene og analysert statistisk
Matrigel invasjons assays
transwellsystemet (24-brønns sette;. Porestørrelse, 8 um; Corning Costar, Lowell, MA, USA) ble benyttet for å utforske virkningen av Huaier vandige ekstrakt på invasivitet av SKOV3, SKOV3.ip1 og Heycells. Innsatsene ble belagt med 30 ul av Matrigel (B.D. Biosciences Pharmingen). Et totalt 3 x 10
4 SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler som hver suspendert i 0,2 ml ferskt medium uten føtalt bovint serum ble tilsatt til den øvre brønnen av kammeret. I kontrollgruppen, ble 600 ul av fullstendig medium tilsatt til den nedre brønnen, mens det i testgruppen, mediet inneholdt 5 mg /ml Huaier. Etter inkubering i 24 timer ble cellene på den øvre overflaten av membranen dras med bomullspinner. Deretter ble cellene fester seg til den nedre overflaten av innsatsene fiksert og farget med hematoksylin. Seks representative felt av hver innsats ble tilfeldig telles ved hjelp av et Olympus lysmikroskop.
Reverse-fase protein rekke
SKOV3 celler og SKOV3.ip1 celler (5 × 10
5) ble dyrket i 6-cm diameter retter. Etter en 24 timers inkubasjon ble cellene delt inn i fire grupper for å motta forskjellige behandlinger: komplett medium kun i 72 timer, Huaier vandig ekstrakt (5 mg /ml) i 72 timer, komplett medium i 60 timer pluss over natten sult og 10 min stimulering med epidermal vekstfaktor (EGF 20 ng /ml) og Huaier vandig ekstrakt (5 mg /ml) i 60 timer pluss over natten sult og 10 minutter stimulering med EGF (20 ng /ml). Den reversfase protein array (RPPA) Analysen ble utført ved Funksjonell Proteomikk Reverse Phase Protein Array Kjerne Facility ved M.D. Anderson Cancer Center. Kort sagt ble cellelysatene justert for deres proteinkonsentrasjoner, denaturert med SDS, og serielt fortynnet (fra ufortynnet til 1:16 fortynning) for å definere det lineære området av hvert antigen-antistoffreaksjon. Lysatene ble prikket på nitrocellulose-belagte objektglass (Whatman, Inc.) ved anvendelse av en GeneTAC G3 microarrayer (Genomiske Løsninger) sammen med positive og negative kontroller. Totalt 153 validerte antistoffer som er spesifikke for proteiner eller deres fosforylerte områder som er involvert i en rekke signalbaner som var tilgjengelige og anvendes i RPPA (se tabell S1 for proteiner og fosforyleringsseter brukes i RPPA studier). Hvert snitt ble undersøkt med en primær antistoff pluss en konjugert sekundært antistoff med Dako CSA (tyramide) forsterkning tilnærming og visualisert ved hjelp av DAB kolo reaksjon. De innsamlede data ble kvantifisert ved bruk av kvantitative programvare MicroVigene, som ble utviklet spesielt for denne tilnærmingen. Protein fosforylering nivåer ble uttrykt som et forhold til den tilsvarende totale proteiner. Verdiene er avledet fra skråningen og avskjærer ble uttrykt i forhold til de vanlige styrecellelysatene på matrisen. Alle verdier ble sammenlignet med den midlere innenfor hvert antistoff sonde og visualisert med varmekart som er opprettet av programvaren Matlab (Mathworks Inc.).
Cell fraksjone
kjerneproteiner ble isolert ved anvendelse av BestBio Nuclear og Cytoplasmatisk Utvinning reagenser (BestBio, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens spesifikasjoner. I korthet, en x 10
6-celler ble vasket to ganger med kald PBS og lysert med 100 ul iskald cytoplasmatisk utvinning reagens (CER) og 1 ul protease inhibitor cocktail. Etter oppsamling av det cytoplasmiske fraksjon (supernatant), ble det nukleære utvinning reagens (NER) og protease-inhibitor cocktail tilsatt til den uoppløselige fraksjon, opprettholdelse av volumforholdet mellom CER: NER: protease cocktail 100:500:1. Etter en 60 minutters inkubasjon og en 5 minutters sentrifugering (16000 x
g
ved 4 ° C), den nukleære fraksjonen ble oppsamlet. Supernatanten og nukleær fraksjon ble underkastet Western blot-analyse for β-catenin.
Western blot-analyse
Cellene ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5 per 3,5 cm- diameter parabol og samlet etter den angitte behandling. Cellene ble lysert i lyseringsbuffer (Biyuntian Biotech Co., Ltd, Shanghai, Kina) følge instruksjonene fra produsenten. Like mengder av protein (20 ug per bane) ble separert ved 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Etter blokkering, ble blottene probet med de primære antistoffer og inkubert over natten ved 4 ° C, fulgt av merking med de passende sekundære antistoffer konjugert med HRP. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av ECL Detection System (Pierce, Rockford, IL, USA). GAPDH, β-aktin og histon H1 ble brukt som laste kontrollene.
Immunocytochemistry
dyrkede celler ble vasket med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyde. Platene ble vasket igjen, behandlet med 1% Triton i 15 minutter og blokkert med 3% H
2o
2 i 20 min. Etter vasking ble platene blokkert med normalt geiteserum i 10 minutter ved romtemperatur og inkubert først med 1:200 anti-human E-cadherin antistoff (Epitomics, CA, USA) ved 4 ° C over natten og deretter med et biotinylert anti-kanin sekundært antistoff i 30 minutter ved RT. Deretter ble platene inkubert med avidin-biotin-peroksidase-systemet i 10 minutter ved romtemperatur og farget med diaminobenzidin (DAB) i 2 minutter. Til slutt, de ble motfarget med hematoksylin og sett under et lysmikroskop.
Kvantitativ sanntids RT-PCR
Cellene ble behandlet med eller uten 7,5 mg /ml Huaier i 48 timer. Total RNA ble ekstrahert fra de behandlede og kontrollcellene ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra 1 ug av RNA ved hjelp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland). Uttrykket nivåer av gener knyttet til Wnt signalveien [DIX domene som inneholder-en (
DIXDC1)
], low density lipoprotein reseptor-relatert protein 6 (
LRP6)
, og vingeløse-type MMTV integrasjon nettstedet familie, medlem 5A (
WNT5A)
) ble evaluert med en Illumina Eco real-time system ved hjelp av en Perfect real Time Kit (Takara). β-aktin ble benyttet som intern kontroll i hver reaksjon. De primersett for disse genene vil bli levert på forespørsel. De relative fold endringene ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden.
Mus xenograft og måling av tumorstørrelse
dyreforsøk ble godkjent av den etiske komiteen av Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University. Seks uker gamle BALB /c-mus ble kjøpt fra Sino-britiske SIPPR /BK Lab Animal Ltd Co (Shanghai, Kina). SKOV3-celler (4 x 10
6) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av hver mus. Deretter ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper (n = 6 mus /gruppe) for å motta enten normal saltløsning (NS) som en kontroll, Huaier (4 g /kg kroppsvekt), cisplatin (DDP) (5 mg /kg kroppsvekt ) eller Huaier pluss DDP. Huaier ble gitt oralt daglig. DDP ble injisert en gang i uken i tre uker. Kontrollmusene ble behandlet med samme volum av NS bare. Tumorvolumene ble målt to ganger i uken ved hjelp av et digitalt skyvelære og beregnet ved hjelp av følgende formel: tumorvolum (mm
3) = (tumorlengde [mm] x tumorbredde x høyde [mm]) n /6. Musene ble avlivet på dag 42 etter tumorcelle-injeksjon. Kroppsvekt ble også målt for å vurdere bivirkninger. Det betyr av tre uavhengige målinger ble i gjennomsnitt
siRNA-mediert genet Slå
GSK3p siRNA tomannsboliger som er rettet mot de sekvenser:. (5′-GAGCAAAUCAGAGAAAUGAdtdt-3 «) ble syntetisert av Genechem (Shanghai , Kina), For siRNA transfeksjon, 5 × 10
5 celler /fatet ble belagt med 60 mm kultur retter. Den følgende dag, 10 ul Lipofektamin 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble tilsatt til 0,5 ml Opti-MEM redusert serummedium (Invitrogen, Carlsbad, CA) uten antibiotika og serum, og inkubert ved romtemperatur i 5 min (løsningen EN). 200 pmol siRNA ble tilsatt til 0,5 ml Opti-MEM medium uten antibiotika og serum (oppløsning B). Løsning A og løsning B ble deretter blandet og inkubert ved romtemperatur i 20 min. Cellekulturmediet ble fjernet, og deretter 1 ml av Lipofectamine 2000-siRNA blanding og 4 ml friskt 1640 medium uten antibiotika ble tilsatt til hver kulturskål og blandet forsiktig. 24 timer senere ble mediet erstattet med friskt kulturmedium eller 5 mg /ml Huaier vandig ekstrakt. Cellene ble høstet for western blot-analyse etter 24 timers inkubering.
Statistisk analyse
Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Resultatene ble analysert ved anvendelse av SPSS 11,5 programvare. p 0,05 ble akseptert som betydelig
Resultater
Huaier hemmet celleviabilitet i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler
For å evaluere effekten av Huaier trekke på. SKOV3, SKOV3.ip1 og Hei celler, målte vi celleviabilitet hjelp av SRB analysen. Etter at cellene ble behandlet med Huaier for 24, 48, 72 og 96 timer ved forskjellige konsentrasjoner (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 og 10 mg /ml), Huaier vesentlig hemmet veksten av SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey celler i en tids- og doseavhengig måte (figur 1). Den cytotoksiske virkning startet 24 timer etter 5 mg /ml Huaier behandling og ble mer tydelig ved 48, 72 og 96 timer i SKOV3 og Hei-celler, mens den startet ved 48 timer i SKOV3.ip1 cellene. Den Hei og SKOV3.ip1 cellene var mer følsomme for Huaier behandling, som de levedyktighet prisene ble redusert til 31,94% (72 timer, p 0,001) og 20,43% (96 timer, p 0,001) i SKOV3.ip1 celler, 4,9% (72 timer, p 0,001) og 3,1% (96 timer, p 0,001) i Hei celler sammenlignet med 61,1% (72 timer, p = 0,01) og 40,1% (96 timer, p 0,001) i SKOV3 celler. Det ble observert en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet når cellene ble behandlet med 10 mg /ml Huaier, uavhengig av behandlingsvarighet.
veksthemmende virkning av Huaier ble målt ved anvendelse av SRB-analysen. SKOV3 (A) SKOV3.ip1 (B) og (C) Hei-celler ble behandlet med Huaier for 24, 48, 72 og 96 timer. Forsøkene ble utført in triplo, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter.
celle apoptose analysert ved anvendelse av PI-annexin-V farving
Fordi Huaier trekke ut vesentlig hemmet cellevekst, vi videre undersøkt om denne effekt ble oppnådd ved å indusere apoptose. PI-annexin V-farging analyse viste at etter Huaier behandling i 48 timer, både den sen apoptose eller celledød rate (UR) og den tidlige apoptose frekvens (LR) økte på en doseavhengig måte i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hey -celler (figur 2 og tabell 1).
prosent~~POS=TRUNC av apoptotiske celler ble målt ved strømningscytometri ved bruk av PI-annexin V-analyse. (A, B, C) Dot plott som viser apoptose i SKOV3 (A), SKOV3.ip1 (B) og (C) Hei-celler med Huaier behandling ved 0, 2,5, 5 og 10 mg /ml i 48 timer.
Cell motilitet redusert på grunn av eksponering for Huaier trekke
for å undersøke om Huaier trekke berørte cellemotilitet, celle invasjon og skrape analysene ble utført. Når SKOV3-celler ble behandlet med 5 mg /ml Huaier ekstrakt, antallet av invaderende celler gjennom Matrigel-belagte membranen ble signifikant redusert sammenlignet med den ubehandlede gruppen (218 ± 35 versus 18 ± 7, s 0,001), noe som indikerer at invasjon evne ble hemmet. Lignende resultater ble funnet i SKOV3.ip1 og Hey celler (SKOV3.ip1: 438 ± 26 versus 83 ± 25; Hei: 264 ± 21 versus 62 ± 16 p 0,001, figur 3).
(A ) effekten av Huaier på invasjonen av SKOV3, SKOV3.ip1 og Hei-celler ble undersøkt ved anvendelse av Transwell-systemet. Representative bilder blir presentert. (B) Etter en 24 timers behandling med 5 mg /ml Huaier, antall hell invadere SKOV3, SKOV3.ip1 og Hei celler ble regnet. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. ** P . 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
En ripe analyse ble utført for å vurdere cellemigrering in vitro. Som antydet i figur 4, migreringen indeks (svarende til sårheling kapasitet) ble signifikant hemmet i SKOV3-celler ble behandlet med Huaier i 48 timer, sammenlignet med ubehandlede celler (23,3% mot 69,8%, p 0,01), mens det var lignende i cellene behandlet med Huaier i 24 timer og ubehandlede celler (17,5% versus 24,7%, p 0,05). Imidlertid redusert migrering indeksen så tidlig som 24 timer etter Huaier behandling i SKOV3.ip1 celler sammenlignet med ubehandlede celler (19,3% mot 60,6%, p 0,05). For Hey celler, kan såret nesten lukket opp for bare 12 timer healing i ubehandlede celler, og migrasjon indeksen ble betydelig hemmet i behandlede celler med Huaier for bare 6 timer (58,2% versus 29,1% p. 0,01).
(A) en rett sårområdet ble generert i hver kulturbrønn i begynnelsen, og administrering av Huaier (5 mg /ml) viste en forsinket prosess for sårheling sammenlignet med ubehandlede celler. Representative bilder av kontrollceller og 5 mg /ml Huaier-behandlede celler ble kjøpt til 0, 12,24 h (SKOV3, SKOV3.ip1) eller 0, 6, 12 timer (Hei). (B) trekk indeksene ble betydelig hemmet av Huaier. Stolpene representerer migreringsindeksen for hver behandling, uttrykt som en relativ verdi for avstanden beveget av cellemonolaget. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. ** P 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
celleproliferasjon, apoptose og celle adhesjon eller invasjon signaliserer proteiner er nedregulert av Huaier behandling
For å undersøke signalveier som kan. bidra til Huaier sin hemmende effekt på bevegelighet, brukte vi RPPA analyse for å vurdere proteinforandringer i SKOV3 og SKOV3.ip1 celler behandlet med Huaier. RPPA er en ny high-throughput teknologi som overvåker endringer i protein uttrykk over tid, før og etter behandlinger, mellom sykdom og ikke-sykdomstilstander og mellom respondere og non-respondere [11]. Ved hjelp av RPPA, analyserte vi ekspresjonsnivået av 153-proteiner og /eller fosforyleringsseter i Huaier-behandlede eller ubehandlede ovarie cancer-cellelinjer med eller uten EGF-stimulering. For hver prøve og hver antistoff, signalforskjellen mellom de ubehandlede og Huaier-behandlede celler ble beregnet som følger [12]: ([bety av behandlede celler – middel av ikke-behandlede celler] /[midler av ikke-behandlede celler]) x 100%.
av de 153 proteiner og fosforyleringsseter analysert, 7 og 10 varierte med mer enn 30% i de behandlede og ubehandlede forhold i SKOV3 og SKOV3.ip1 celler, respektivt. Representative varmekart er vist i figur 5A. I SKOV3 celler, Huaier behandling hemmet celledeling og endret nivåene av relaterte proteiner /fosforylering områder; for eksempel redusert det HER2 fosforylering på Y1248 og ER proteinnivåer men oppregulert p53 og Taz fosforylering på S79. I SKOV3.ip1 celler, mer pro-proliferativ proteiner, slik som ER, c-kit og fosforylert S6 (ribosomalt protein S6-kinase; fosforylert ved S235-236 og S240-244) ble nedregulert ved Huaier. I tillegg Huaier inhiberte ekspresjon av det lengre isoformen av Bcl (Bcl-xL) og opp-regulert ekspresjon av pro-apoptotiske proteiner, slik som p53 og spaltet for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP_cleaved), i SKOV3.ip1 -celler (Figur 5B).
(A) Hierarkisk klynge-analyse av fire prøver (kontroll, Huaier behandlet i 72 timer, sult + EGF-stimulering, sult + EGF + stimulerings Huaier i 60 timer) i SKOV3 og SKOV3 .ip1 celler i henhold til ekspresjonen av 16 signalmolekyler. Cluster fargeknapp: rød – oppregulert; grønn – nedregulert; svart – uendret. (B og C): Brett endringer i ekspresjonen eller fosforyleringen av forskjellige proteiner etter Huaier behandling og tilsetning av EGF ble analysert ved hjelp av RPPA analysen i SKOV3 (B) og (C) SKOV3.ip1 celler. De relative verdier av kontrollgruppen og de sult + EGF-stimulering grupper ble angitt som 1,0. *:. Foldendring 30%
Vi fant også at Huaier kan regulere celle adhesjon og invasjon, basert på nedregulering av fibronektin, β-catenin og caveolin-1 uttrykk i begge cellelinjer og oppregulering av claudin 7 i SKOV3.ip1 celler etter Huaier behandling (figur 5B).
Involvering av pakt /mTOR /S6 bane i Huaier-indusert eggstokkreft cellevekstinhibering
Ved hjelp den RPPA, fant vi at ribosomalt S6 kinasefosforylasjon ble undertrykt av Huaier behandling. S6-kinase er et viktig mål for den mTOR vei, og det fremmer cellevekst og proliferasjon. Den AKT reaksjonsvei er et oppstrøms aktivator av mTOR pathway. Derfor har vi analysert proteinnivåer Pakt, AKT, PS6 (S235-236) og PS6 (S240-244) av western blotting. Vi fant at AKT-fosforylering ble signifikant redusert i SKOV3.ip1 celler etter 72 timer av Huaier behandling, enten med eller uten EGF stimulering. I samsvar med reduksjon i pakt, fosforyleringen av S6 ved S235-236 og S240-244 ble også nedregulert. Men i SKOV3-celler, fosforyleringen av S6 ved S235-236 og S240-244 ble nedregulert i celle behandlet med Huaier bare, men ikke i EGF-stimulering gruppene, mens pakt ble svakt øket i den Huaier-behandlede SKOV3-celler. Huaier nedregulert i fosforylering av S6 på S240-244 i begge Huaier behandlet bare og EGF stimuleringsgrupper i Hey celler. (Figur 6).
AKT-fosforylering, total AKT nivåer, og S6 fosforylering ved S235 og S240 ble målt ved Western blotting av prøver fra hver av de fire behandlingsgrupper (kontroll, Huaier behandlet i 72 timer, sult + EGF stimulering, sult + EGF stimulering + Huaier i 60 timer). Tallene på proteinbåndene representerer fold endringer, med basalnivået i kontroll eller sult + EGF grupper tilordnet en verdi på 1,0.
Huaier hemmer celle invasjon via GSK3p /β-catenin veien
på grunn av resultatene av annexin V /PI farging viste at Huaier induserer apoptose og RPPA resultatene videre indikert at flere pro- og anti-apoptotiske proteiner ble modulert ved Huaier behandling, våre resultater støtter den pro-apoptotiske virkning av Huaier observert i andre studier. Imidlertid RPPA analysen viste også at proteiner som er involvert i celle-adhesjon og invasjon ble modulert ved Huaier behandling (figur 5). Dette tyder på at Huaier kan ha en annen terapeutisk viktig effekt, spesielt fordi ovarialcancer celler har en unik invasiv /metastatisk kapasitet og ofte implantat inn i bekken eller bukhulen.
Blant disse proteinene, er β-catenin en nøkkel komponent av E-cadherin-mediert celle-celle adhesjon kaskade. Ved hjelp av vestlige blotter, vi ytterligere bekreftet endringene i β-catenin uttrykk i SKOV3, SKOV3ip1 og Hei celler. Som vist i figur 7, Huaier dramatisk redusert cytosoliske akkumulering av β-catenin på en tidsavhengig måte i SKOV3, SKOV3.ip1 og Hei-celler. Den kjernefysiske ekspresjon av β-catenin ble også redusert. Våre data indikerer at Huaier undertrykker ikke bare den proteinekspresjon, men også den nukleære translokasjonen av β-catenin.
Både cytoplasmisk ekspresjon og nukleær translokasjon av β-catenin ble signifikant inhibert ved Huaier behandling. (A) SKOV3, (B) SKOV3.ip1 og (C) Hei-celler ble behandlet med 5 mg /ml og 7,5 mg /ml Huaier for 24, 48 og 72 timer. De cytoplasmatiske og kjerneproteiner ble hentet separat. En representativ Western blot er vist. For densitometrisk analyse av β-catenin nivåer, var resultatene normalisert til nivået av GAPDH (for cytoplasmatiske proteiner) eller histon-1 (kjerneproteiner). Basalnivået for de ubehandlede grupper på hvert tidspunkt ble tildelt en verdi på 1,0.
For å klargjøre mekanismen som forårsaker nedregulering av β-catenin, vi evaluert uttrykk for GSK3P videre (glykogen syntase kinase 3β), som er kjent for å ha en negativ regulere den klassiske Wnt /β-catenin signalveien ved å fosforylere β-catenin, noe som fører til dens degradering [13]. Fordi fosforylering av GSK3p på S9 hemmer dens aktivitet og hindrer satsing på β-catenin for nedbrytning, ble helcellelysater undersøkes for både total GSK3p og fosforylert GSK3p på S9 nivåer følgende Huaier behandling.
