Abstract
Bakgrunn
Forstyrrelse av nucleolus fører ofte til aktivering av p53 tumor suppressor vei gjennom hemming av MDM2 som formidles av et begrenset sett av ribosomale proteiner inkludert RPL11 og RPL5. Virkningene av ribosomalt protein tap i dyrkede pattedyrceller er ikke blitt grundig undersøkt. Her karakteriserer vi den cellulære stressrespons forårsaket av uttømming av ribosomalt protein S9 (RPS9).
metodikk /hovedfunnene
Nedbryting av RPS9 nedsatt produksjon av 18S ribosomalt RNA og indusert p53 aktivitet. Det fremmes p53-avhengig morfologisk differensiering av U343MGa Cl2: 6 glioma celler som dokumentert av intensivert uttrykk for glial fibrillary surt protein og dyptgripende endringer i cellen form. U2OS osteosarkom celler vises et begrenset senescence respons med økt uttrykk av DNA skade respons markører, mens HeLa livmorhalskreft celler gikk celledød ved apoptose. Knockdown av RPL11 nedsatt p53-avhengig fenotyper i forskjellige RPS9 utarmet cellekulturer. Viktigere, knockdown av RPS9 eller RPL11 også markert hemmet celledeling gjennom p53-uavhengige mekanismer. RPL11 binding til MDM2 ble beholdt til tross for redusert nivå av RPL11 protein følgende nukleolært stress. I disse innstillinger, RPL11 var kritisk for å opprettholde p53-proteinstabilitet, men er ikke strengt tatt nødvendig for p53-proteinsyntese.
Konklusjoner
p53 spiller en viktig rolle i den innledende begrensning av celleproliferasjon som forekommer i respons til redusert nivå av RPS9. Våre resultater kan ikke utelukke muligheten for at andre nukleolære stresset sensing molekyler handle oppstrøms eller parallelt RPL11 å aktivere p53. Inhibering av ekspresjonen av visse ribosomale proteiner, slik som RPS9, kan være en effektiv måte for å gjenoppta differensieringsprosesser eller for å indusere apoptose begynnende alderdom eller i hurtig prolifererende tumorceller
relasjon:. Lind MS, Nistér M (2010) lyddemping av ribosomalt protein S9 utløser en rekke cellulære responser hemme veksten av kreftceller Etter første p53 Aktivering. PLoS ONE 5 (3): e9578. doi: 10,1371 /journal.pone.0009578
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 28. januar 2010; Godkjent: 11 februar 2010; Publisert: 08.03.2010
Copyright: © 2010 Lindström, Nistér. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble gjort mulig med økonomisk støtte til ML fra Åke Wiberg fundament, Karolinska Institutet midler og Magnus Bergvall fundament. ML er en mottaker av et fellesskap pris fra den svenske Cancer Society (Cancerfonden). Arbeidet ble utført i laboratoriet av MN, støttet av den svenske Kreftforeningen, Kreftforeningen i Stockholm, Vetenskapsrådet, den svenske Childhood Cancer Foundation og Karolinska universitetssykehus FoUU. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ribosom biogenese er en meget kompleks prosess hvor hundrevis av forskjellige proteiner samvirker på ribosomalt RNA (rRNA) syntese, prosessering, ribosom-subenhet montering og transport [1]. Nucleoli er de faktiske områder for ribosom biogenese men disse konstruksjonene har også vært implisert i andre cellulære prosesser som for eksempel kontroll av cellesyklus, viral replikasjon, mitogene signalisering, nukleær eksport av p53, og stamcelledifferensiering, gjennomgått i referanser [1] – [4]. I løpet av det siste tiåret har forbindelsen mellom tumor suppressor protein p53, den kjerne, og ribosom biogenesis bli godt etablert. Uttrykk av dominerende negative mutanter av den nukleolært protein Bop1 resulterte i defekter i rRNA behandling utløse p53 indusert cellesyklus arrest [5]. p53 blir ofte aktiveres etter lyddemping av nukleolære eller ribosomale proteiner (R-proteiner), og eksempler innbefatter RPL23 [6], RPS6 [7], nucleostemin, [8] og TIF1A [9]. Videre er inhibitorer av rRNA-syntesen eller behandling slik som aktinomycin D og 5-fluorouracil også aktiverer p53 [10]. Sammen disse betingelsene blir betegnet som nukleolært eller ribosomal stress. Montering bevis fra en rekke musemodeller beviser eksistensen av denne p53-avhengig sjekkpunkt
in vivo
. En mus modell avslørt at ribosom biogenesis er svekket etter betinget sletting av en allel av
Rps6 product: [11]. Interessant, embryonale dødelighet som skjedde under gastrulation i disse
Rps6
+/-
embryoer ble forårsaket av en p53-avhengig sjekkpunkt i stedet for en generell nedgang i translasjonell kapasitet [11]. Rpl22 mangel selektivt hemmet utvikling av alfa /beta-avstamning T-celler, en reaksjon mediert av aktivering av p53 [12]. I sin tur, p53 tap gjen utviklingen av Rpl22-manglende thymocytter.
mutasjoner er blitt funnet i forskjellige R-proteiner i pasienter som lider av et syndrom som kalles Diamond-Blackfan anemi (DBA, MIM # 105650), karakterisert v av defekte erytropoiese, medfødte misdannelser og en økt risiko for kreft [13], [14]. Genet
RPS19
ofte mutert i DBA [15], men mutasjoner har også blitt funnet i
RPS24
,
RPS17
,
RPL35A
,
RPL5
,
RPL11
, og
RPS7 product: [16], [17]. Dyremodeller av DBA har blitt opprettet i mus og sebrafisk [18], [19]. Det ble funnet at tap av
Rps19
er embryonale dødelig [20].
Rps19
mangel svekker ribosomal biogenesis og aktiverer p53 i sebrafisk, og undertrykkelse av p53 og deltaNp63 kan lindre Rps19-mangel fenotype i denne modellen [18]. Tap av andre R-proteiner i sebrafisk, for eksempel Rps8, Rps11, og Rps18 også utløst en p53 respons [18]. Rollen til p53 i DBA er fortsatt uklart, men det er bemerkelsesverdig at mus med mutasjoner i
RpS19 Hotell og
Rps20
har lave erytrocyttantigener teller som kan gjenopprettes ved p53 mangel [21].
Hvordan er p53 aktiveres følgende nukleolært stress? Flere grupper har vist at R-proteiner (RPL11, RPL5, RPL23 og RPS7) frigjøres fra nukleolus under stress og deretter binde MDM2 derved aktiverer p53 [6], [22] – [29]. Det ble senere funnet at økt translasjon av 5′-terminal oligopyrimidine (TOP) mRNA, blant annet som
RPL11
, forekommer som respons på forstyrret 40S ribosomale subenhet biogenese derved fører til en økning i produksjonen RPL11 [30]. Faktisk, etter tap av RPS6 eller RPL24 p53 tumor suppressor aktiveres på en måte som er avhengig av RPL11 [30], [31]. Mens redusert ekspresjon av enkelte R-proteiner kan aktivere p53 som en del av en cellulær stressrespons, er det også tydelig at enkelte andre R-proteiner har direkte og mer spesifikke roller i
p53
mRNA oversettelse. Haploinsufficiency av en undergruppe av r-proteiner i sebrafisk er knyttet til utvikling av ondartet perifere nerve slire svulster [32]. Interessant, disse nerve slire svulster ikke klarer å produsere p53 protein, til tross for tilstedeværelsen av
p53
mRNA [33]. Dessuten spiller RPL26 en rolle i å forbedre
p53
mRNA oversettelse under DNA skade respons ved direkte interaksjon med både MDM2 protein og
p53
mRNA [34]. Derfor, R-proteiner har mer dynamiske roller i regulering av p53 tumor suppressor vei enn tidligere antatt, anmeldt i [35] -. [37]
Nylig RPS9 ble identifisert som en roman B23 (NPM /nucleophosmin ) samspill protein [38]. Redusert nivåer av RPS9 var assosiert med akkumulering av celler i G
1 /(G
0) og p21 induksjon i U2OS osteosarkom celler [38]. Her setter vi ut for å ytterligere undersøke de ulike cellulære stressresponser forårsaket av tap av RPS9. Nedbryting av RPS9 provosert en rask tap av nukleolært protein basseng, nedsatt produksjon av modne 18S ribosomalt RNA og aktivering av p53 tumor suppressor veien. Vi har funnet at kombinasjonen av en defekt ribosom biogenese bane og p53-aktivering resulterte i uventet sterke anti-proliferative responser hos humane tumorcellelinjer i at de gjennomgikk senescens, differensiering, apoptose eller etter uttømming av RPS9.
Resultater
Rapid Nedbryting av nukleolære RPS9 Etter siRNA Transfeksjon
for å fusjonere R-proteiner med GFP har vist et nyttig verktøy for å bedre visualisere lokalisering og omsetning av r-proteiner i humane celler [39], [ ,,,0],40]. U2OS celler som uttrykker RPS9-GFP tidligere var blitt etablert [38]. I disse celler RPS9-GFP-fusjonsprotein ble lokalisert til kjerne og cytoplasma. For bedre å forstå dynamikken i RPS9 i forhold til knockdown fenotyper, brukte vi RPS9-GFP U2OS celler kombinert med RNA interferens for å visualisere knockdown av RPS9 i levende celler (figur 1A). Transfeksjon av U2OS celler med RPS9 siRNA indikerte en rask omsetning av nukleolært RPS9-GFP. Allerede 24 timer etter transfeksjon et flertall av cellene viste en slående tap av nukleolært RPS9-GFP (figur 1B). 72 timer post-transfeksjon, de fleste cellene hadde en GFP signal påvisbart bare i cytoplasma. Ved hjelp av immunoblotting RPS9-GFP ble detektert som et enkelt bånd med den forventede størrelse som ble redusert ved siRNA transfeksjon med to forskjellige RPS9 sirnas # 1 og # 2, mens knockdown med oligo # 0 var ineffektiv når sammenlignet med kontrollen siRNA, siCtrl (figur 1C). Bassenget av cytoplasmatiske RPS9-GFP protein forble i flere dager i samråd med den kjente stabiliteten i pattedyr cytoplasmatiske ribosomer. Vi har vært i stand til å fullstendig tømme cellene i cytoplasma GFP-reaktivitet som kan være på grunn av det faktum at stanse med siRNA er ikke 100%, eller at et totalt tap av RPS9 er ikke forenlig med vedvarende celleproliferasjon. For ytterligere å bekrefte den cellulære fordelingen av RPS9, ble U2OS celler farget med et antistoff dannet mot humant RPS9, som beskrevet [38], og en identisk nukleolært og cytoplasmatisk farging ble observert. Den nukleolært pool av endogen RPS9 kunne raskt og effektivt silenced i U2OS celler lik som RPS9-GFP (figur S1 A), og dette ble bekreftet av immunoblotting (figur S1B). I sammendraget, fikk vi en komplett og spesifikk uttømming av nukleolært RPS9 hjelp siRNA.
(A) Effektivitet av RPS9-GFP knockdown i U2OS celler som stabilt uttrykker RPS9-GFP ved bruk av tre forskjellige siRNAs rettet mot menneskelig RPS9. Bilder av celler som uttrykker RPS9-GFP ble tatt etter 48 timer. (B) Prosent av U2OS celler som uttrykker detekterbar RPS9-GFP i nucleolus ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon av RPS9-1 siRNA eller siCtrl. (C) Samme antall celler fra eksperiment i (A) ble oppsamlet og hele celleekstrakter fremstilt i buffer inneholdende 2% SDS. Protein lysates ble separert ved SDS-PAGE og immunoblottet med antistoffer spesifikke for EGFP, PCNA, β-aktin, og RPL11 som vist i figuren.
Induksjon av en Limited Senescence Response i U2OS Cells
Forstyrrelse av den kjerne blir ofte observert etter eksponering av celler for en rekke kjemiske og fysiske midler som hemmer transkripsjon eller rRNA-behandling [10]. En nøye gjennomgang av nucleoli avdekket at de forble intakt i respons på behandling med siRPS9, etter avtale med studier på RPS6 [11], [30]. Men, vi bemerket at nucleoli i RPS9 utarmet U2OS celler ble mer kontrast, rund, og fase-tetthet enn i siCtrl behandlede celler indikerer en omorganisering av nukleolært struktur (figur S2A). Nukleolære tette fibrillære sentrene var i noen få celler gjen lokalisert til periferien av den kjerne som åpenbart ved farging for fibrillarin, en markør av det tette fibrillære rommet i kjerne. Disse nucleoli lignet de forstørrede nucleoli ble observert i U2OS-celler utarmet med hensyn til nucleostemin [8], et nukleolært protein som er involvert i ribosomet biogenese [41].
knockdown av RPS9 induserte akkumulering av celler i G
1 og økte nivåer av p21 i U2OS celler [38]. En mer grundig undersøkelse av cellene viste at en brøkdel viste en heller «alvorlig» fenotype likner alderdom med et grovt ekspanderende cytoplasma fører oss til videre undersøke denne respons (figur 2A). Uttømming av RPS9 induserte en økning i antallet γ-H2A.X positive celler og celler med atom foci av fosfo-ATM /ATR-substrat-proteiner (Fig 2B og C). Analyser viste en økning på senescens forbindelse β-galactosidase-positive (SA-β-gal) U2OS celler fra 0,4% positive celler i siCtrl celler, til 7% i siRPS9 transfekterte celler (figur 2D).
(A ) fase kontrast avslører morfologi av menneskelige U2OS osteosarkom celler transfektert med siRNA rettet mot RPS9 eller p53. (B-C) Økt uttrykk av DNA-skade og replikering spennings markører i U2OS celler utarmet av RPS9 og analysert 72 timer etter siRNA transfeksjon. U2OS celler ble fiksert og farget med et antistoff mot γ-H2AX og en fosfor-ATM /ATR underlaget antistoff. (D) Kvantifisering av SA-β-gal positiv U2OS celler i kulturer tømt for RPS9. Det er vist en representativt eksperiment ut fra to. (E) Celler ble transfektert med siCtrl, RPS9, RPL11, p53 eller p21 siRNA som angitt. Cellene ble inkubert med BrdU i 24 timer etter transfeksjon i ytterligere 24 timer, og cellene ble deretter fiksert og farget med anti-BrdU-antistoff og et gjennomsnitt av BrdU-positive celler er vist (%). (F) Co-uttømming av RPL11, p53 eller p21 delvis svekket RPS9 knockdown-mediert inhibering av celleproliferasjon. U2OS celler ble transfektert med siCtrl, siRPS9, sip53, sip21 eller siRPL11 i kombinasjoner som angitt. Endelig konsentrasjon av siRNA var 100 nM i hvert enkelt tilfelle og kompensasjon ble gjort med siCtrl. Cellene ble tellet 72 timer etter transfeksjon og vist er middelverdien og SEM fra tre forskjellige eksperimenter utført i triplikat ved uavhengige anledninger og normalisert til siCtrl satt til 100%. (G) Co-knockdown av RPL11 svekket induksjon av p21 og MDM2 proteiner forårsaket av knockdown av RPS9. U2OS celler ble transfektert med kombinasjoner av siRNA som angitt. Cellelysater ble utsatt for immunblotting og uttrykket av p53, MDM2, p21, RPL11, RPL5 og RPS9 ble bestemt som angitt. Proteinet lysat fra hver prøve ble delt i tre forskjellige blotter og hver probet med aktin som en lasting kontroll. (H) U2OS-celler ble transfektert med siRPS9-1 eller siRPL11-2 i 48 timer og behandlet med 5 nM actinomycin D i 18 timer hvoretter cellene ble høstet direkte inn i 2% SDS inneholdende lyseringsbuffer. Cellelysater ble utsatt for immunblotting ved bruk av antistoffer mot RPL11 eller RPS9 (w.c.e = hel celleekstrakt). (I) Co-immunoprecipitation av MDM2 og RPL11 i U2OS celler transfektert med siRNA rettet mot RPS9. MDM2 immunoutfelt med N20 antistoff etterfulgt av deteksjon med SMP14 monoklonale eller et monoklonalt mot RPL11. Legg merke til at ulike eksponeringstider ble brukt til RPL11 IP og inngangs blotter. (J) U2OS-celler ble transfektert med siRPS9-1 alene eller i kombinasjon med siRPL5-2 i 72 timer, hvoretter cellene ble høstet og nivået av p21 som en utlesning for p53-aktivitet ble analysert ved immunblotting.
for å formelt demonstrere rollen p53 i formidling av hemming av U2OS celleproliferasjon vi co-utarmet p53 og RPS9 resulterer i en reversering av aldringsprosessen fenotype (figur 2A og D). I tillegg RPL11, p53 eller p21 ko-uttømming i siRPS9-behandlede celler økte BrdU-inkorporering i disse kulturene ved 24 timer etter transfeksjon (figur 2E), kombinert med en redning av senescens-lignende morfologi (fig S3). Vi ønsket å vite hvordan denne «flykte» fra G
en pågripelse i forbindelse med cellevekst på lengre sikt, slik at vi også undersøkt celleproliferasjon på et senere tidspunkt. Vi fant ut at siRPS9 behandlet kulturer hadde vokst 36% (± 9,2), mens siRPS9 + sip53 behandlede celler hadde vokst 52% (± 6,5) sammenlignet med siCtrl evaluert 72 timer etter transfeksjon (figur 2F). Stanse av RPL11 restaurert celletall til nivået sett i celler co-transfektert med siRPS9 og sip53, men det kunne ikke gjenopprette celle nummer som hos siCtrl kulturer, derav siRPS9 + siRPL11 behandlede celler hadde vokst 56% (± 4,4) sammenliknet å siCtrl (figur 2F). Dette indikerte at stanse av RPS9 eller RPL11 også indusert undertrykkelse av celleproliferasjon i en p53-uavhengig måte. Dette ble bekreftet av tappe RPS9 i matchet WI38 og WI38-E6 fibroblaster samt i SAOS2 osteosarkom celler mangler p53 (figur S1D).
Regulering av p53 Response utløst av RPS9 Tap i U2OS Cells
Den reduserte uttrykk for RPS9 i U2OS cellene ikke markert endre nivåene av p53 som vist før [38], men induserte en økning i p21 protein som var avhengig av p53 (figur 2G). Induksjon av p21 ble markert svekket av co-trans celler med RPL11 siRNA (figur 2G). Knockdown av RPL11 ved hjelp siRPL11-1 resulterte i lavere nivåer av p53, MDM2, og spesielt p21, også under normale forhold i U2OS celler (figur 2G, spor 6). Interessant, uttømming av RPS9 førte til lavere nivåer av NP40 løselige RPL11 (figur 2G, spor 2), men brøkdel av RPL11 bundet til MDM2 forblitt den samme, og gikk ikke ned (figur 2I). Vi ønsket å vite om reduksjonen i RPL11 også kunne sees i hele celleekstrakter og derfor U2OS celler ble transfektert med siRPS9 eller inkubert i 5 nM actinomycin D i 18 timer. Denne konsentrasjonen av actinomycin D selektivt blokkerer RNA-Pol I-aktivitet og forhindrer ribosom biogenese. Vi kunne bekrefte resultatene som ble oppnådd ved bruk av mildere lysis buffer også i hele celleekstrakter således som viser reduserte totale nivå av RPL11 (figur 2H). De fleste av studiene på feltet har stolt på å kneble RPL11 ved hjelp av én bestemt siRNA så vi fant det viktig å sammenligne RPL11 med RPL5. Vi fant at uttømming av RPL5 kan blokkere p21 induksjon identisk RPL11 i RPS9 utarmet celler (Figur 2J). Stanse av RPL11 med morpholinos induserer en p53-avhengig apoptotisk respons i sebrafisk [42], og vi derfor ikke vil utelukke at RPL11 og RPL5 tap kan i noen grad indusere p53 aktivitet eller engasjere p53 relatert trasé
in vivo
. Vi har også gjort en annen observasjon fra eksperimentet i figur 2G. Først, knockdown av RPL11 forårsaket en nedgang i RPL5 proteinnivå i samme grad som for RPL11 (figur 2G, spor 6). Dette er antagelig fordi 28S rRNA ikke er effektivt behandlet i RPL11 eller RPL5 manglende celler [43] som fører til et overskudd av store subenhet R-proteiner som raskt brytes ned [44]. Det har nylig blitt vist av andre grupper som kan utarming av en individuell r-protein fra en ribosom subenhet resulterer i nedregulering av andre proteiner fra den samme underenheten [45]. Dette funnet kan ha noen betydning på hvorfor regulering av MDM2 av flere ribosomale proteiner ser ut til å skje i en ikke-redundante måte, men dette kan ikke være den eneste forklaringen for da ville vi finne at knockdown av nesten alle r-protein kan blokkere p53 stabilisering som vi ikke ser. Oppsummert konkluderer vi med at RPL11 er nødvendig for effektiv induksjon av p53-avhengige responser i RPS9 utarmet U2OS celler.
Er RPL11 Kreves for p53 mRNA Oversettelse Etter nukleolære stress?
Hvordan RPL11 kontroll p53? Binding av RPL11 og RPL5 direkte til MDM2 protein fører til stabilisering av p53 via hemming av MDM2 E3 ubiqutin ligaseaktivitet [46]. Men andre rapporter tyder også viktige roller for R-proteiner i
p53
mRNA oversettelse [33], [47]. Videre betydningen av samspillet mellom MDM2 og RPL11 /RPL5 når det gjelder mulige effekter på
p53
mRNA oversettelse har vært noe uklart. Dette kan være aktuelt å undersøke siden MDM2 kan øke
p53
mRNA oversettelse som har blitt beskrevet å forekomme i noen settinger [48], [49]. Faktisk ble det foreslått at interaksjoner mellom RPL11 /RPL5 og MDM2 kan tjene et dobbelt formål å hemme MDM2 E3 ligase aktivitet, og å fremme
p53
mRNA oversettelse samtidig [48], [49]. På den annen side, MDM2 binder seg til og hemmer RPL26 RPL26 mediert stimulering av p53 mRNA oversettelse [15]. Derfor bestemte vi oss for å re-besøk p53 halveringstid og fornedrelse og å undersøke
p53
mRNA oversettelse følgende nukleolært stress i U2OS celler med og uten RPL11. Vi først utført et p53-protein halveringstid analyse for å bekrefte den økte stabiliteten av p53 etter en lav dose actinomycin D eksponering for å indusere nukleolært stress. Faktisk ble en sterk økning i mengden og stabiliteten av p53-protein sett, og i det vesentlige meget lite, om noen, nedbrytning av p53 forekom i actinomycin D-behandlede celler i løpet av den fire timers forfølgelse (figur 3A). I motsetning til størstedelen av p53-proteinet i DMSO-behandlede kontrollceller ble nedbrutt etter mindre enn én time i cykloheksimid (figur 3A). Vi deretter transfektert U2OS celler med kontroll eller siRPL11 i 24 timer og deretter behandlet alle transfektanter med 5 nM actinomycin D natten etterfulgt av en CHX jage. Lasting ble justert for å gi en tilsvarende start mengde av p53 å muliggjøre en direkte sammenligning. p53 var klart mer ustabil i RPL11 utarmet U2OS celler (Figur 3B). Residual stabil p53 i siRPL11 prøver på senere tidspunkter trolig stammer fra en populasjon av celler som har svart actinomycin D, men som ikke har blitt transfektert med siRPL11. Vi neste begrunnet at små molekyler som forstyrrer p53-MDM2 bindende, blokkere MDM2 transkripsjon eller hindre p53 nedbrytning av proteasome dermed forårsaker p53 opphopning av «default» ville handle uavhengig av ribosomalt protein-MDM2 interaksjon. Vi behandlet derfor U2OS celler med Nutlin-3. Den Nutlin-3-delsen ødelegger p53-MDM2 interaksjon, men hindrer ikke bindingen av MDM2 til p53 mRNA [48], [49]. Vi transfekterte celler med to forskjellige RPL5 siRNA oligoer over natten, etterfulgt av behandling av celler med 5 nM actinomycin D eller 10 uM Nutlin-3 i ytterligere 18 timer (figur 3C). Hver av de to RPL5 sirnas kan effektivt inhibere p53-akkumulering etter 5 nM actinomycin D, og spesielt induksjon av p21 ble redusert (figur 3C, spor 3 og 4). I motsetning til virkning på p53 og p21 protein nivå når vi utarmet RPL5 i nærvær av Nutlin-3 var marginal når normalisert til aktin. Derfor RPL5 var ikke nødvendig for stabilisering av p53, samt induksjon av MDM2 og p21 proteiner, i Nutlin-3-behandlede celler. Vi neste ønsket å se om andre liten subenhet R-proteiner inkludert RPS9 kreves for p53 stabilisering etter actinomycin D behandling. Vi utarmet celler av RPS6, RPS9, RPS17 og RPS24 men knebling av disse proteinene ikke blokkere p53 protein stabilisering forårsaket av actinomycin D (Figur 3D). Dette viser at RPL11 men ikke RPS9 spiller en avgjørende rolle i p53 respons etter actinomycin D behandling.
(A) U2OS celler ble behandlet med 5 nM actinomycin D i 18 timer eller DMSO bare etterfulgt av en cycloheximide chase ( CHX) for å estimere p53 protein degradering priser. Cellelysater fra hvert tidspunkt ble utsatt for immunblotting og ekspresjon av p53 bestemt i forhold til actin nivåer. (B) U2OS celler ble transfektert med siCtrl eller siRPL11 natten etterfulgt av behandling med actinomycin D i ytterligere 18 timer. Dette ble etterfulgt av CHX chase som ovenfor angitt tid. I dette tilfelle er lastingen ble justert for å gi sammenlignbare utgangs mengder av p53 fasilitets analyse av degradering som er raskere i RPL11 transfekterte celler. (C) U2OS celler ble transfektert med sirnas målretting RPL5 eller med siCtrl. Celler ble deretter behandlet med Nutlin-3 (10 uM) eller actinomycin D (5 nM) i 18 timer. Den blotting membran ble undersøkt for RPL5, MDM2, p53 og p21. (D) Nedbryting av ribosomale proteiner RPS6, RPS9, RPS17 og RPS24 ikke hindrer p53 akkumulering og p21 induksjon følgende actinomycin D behandling, men uttømming av RPL11 gjorde. U2OS-celler ble transfektert med angitte siRNA i 18 timer, etterfulgt av behandling med actinomycin D (5 nM) i ytterligere 18 timer og uttrykk nivåer av p53 og p21 ble målt ved immunblotting. (E) p53-syntese i actinomycin D behandlede celler med eller uten siRPL11. Total p53 og RPL11 er vist ved immunoblotting og nylig syntetiserte p53 ble immunpresipitert med antistoff DO1 og visualisert ved autoradiografi. Forsøket ble utført 36 timer etter transfeksjon siRNA. (F) Evaluering av p53 mRNA translasjon i U2OS celler utarmet av RPL11, RPS9, RPS9 + RPL11, eller i celler behandlet med actinomycin D (5 nM) i nærvær eller fravær av RPL11 siRNA. Vist er mengden av nylig syntetisert p53 i løpet av 15 minutter i forhold til den totale mengden av p53, og sammenlignet med totale proteinnivået som oppdages med Ponceau S. Forsøket ble utført 36 timer etter siRNA transfeksjon.
til slutt, vi ønsket å undersøke syntese av nye p53-protein under betingelser med actinomycin D eksponering eller etter stanse av RPS9, i nærvær eller fravær av siRPL11. Vi merket U2OS celler i 15 minutter, og brukes til p53 immunopresipitasjon å overvåke total og nylig syntetiserte p53, men fant ingen indikasjon på at RPL11 er nødvendig for p53-proteinsyntese i dette eksperimentelle omgivelser (figur 3E og F). En marginal økning i nye p53 protein kan sees i actinomycin D behandlede celler (figur 3E), men tolkningen av dette er vanskelig fordi actinomycin D kan også stabilisere pool av nylig syntetisert p53, og de generelle nivåene av oversettelsen var noe høyere i dette utvalget. Resultatene tatt alle sammen støtter forestillingen om at RPL11 styrer hovedsakelig p53 på en post-translasjonell nivå og at RPL11 ikke er strengt nødvendig for p53 syntese i denne eksperimentelle innstillingen, men en ekstra mindre effekt på p53 produksjonen er ikke utelukket.
RPS9 Lyddempningsplater Svekker Produksjon av 18S rRNA og induserer p53 i gliom Cells
Så langt har de fleste studier på ribosomalt protein-p53 signal blitt utført i U2OS celler og det er fortsatt uklart om, eller i hvilken grad dette reguleringsmekanisme opererer i andre celletyper. Vi fant ut at endogen RPS9 kunne effektivt silenced i U343MG og i U87MG glioma celler mens ingen endring i RPS9 uttrykk ble sett i U1242MG celler ved siRPS9 transfeksjon (Figur 4A). Av notatet, er det allerede lavt nivå av RPS9 i ubehandlede U1242MG celler. En klar reduksjon i antall celler i kulturer behandlet med siRPS9 forhold til siCtrl behandlede kulturer ble sett for U87MG, U343MG, og U343MGa Cl2: 6 celler, men ikke for U1242MG (figur 4B). Som en ytterligere kontroll spesifisitet, har vi fastslått at RPS9 siRNA oligonukleotidet hadde ingen virkning på mus NIH3T3 celleproliferasjon mens en mus rps9 siRNA oligo effektivt hemmet proliferasjonen av disse cellene (fig S1C). For å vurdere effekten av RPS9 knockdown på syntesen av modne 28S og 18S rRNA vi merket knockdown og kontrollere U343MGa Cl2: 6 celler med [
3H] -uridine i 2 timer og undersøkt merket og isolert rRNA følgende gel elektroforese og blotting til en nylonmembran. Vi har funnet at i RPS9 knockdown kulturer meget lite modne 18S rRNA ble produsert i løpet av merkingsperioden (figur 4C), men samlet cellulært RNA-syntese fortsettes (figur 4D). Actinomycin D (5 nM) effektivt blokkert syntese og merking av rRNA (figur 4C og D). I et eksperiment med [
3H] -L-metyl metionin som skal merkes nylig syntetisert rRNA fant vi at produksjonen av 18S rRNA var tydelig svekket (figur 4E). Det var en marginal reduksjon i den nye syntesen av 28S rRNA. Videre uttømming av RPS9 i U343MGa Cl2: 6 celler reduseres den totale Inkorporering av [
35S] -metionin i begynnende protein med 30-50% (figur 4F). Mekanismen for å opprettholde rRNA-syntesen ved høye nivåer til tross for aktivering av p53 gjenstår å bli bestemt. Som foreslått av andre, kan dette være en generell kompenserende mekanisme i respons til en mangel på ribosomer [50].
(A) RPS9 knockdown effektivitet i glioma cellelinjer U87MG, U343MG og U1242MG som bestemt ved immunoblotting for RPS9 i forhold til aktin. (B) Cellelinjer fra forsøket utført i (A), og U343MGa Cl2: 6 celler, ble transfektert med siCtrl eller siRPS9-1 og etter 72 timer ble antall levedyktige celler i forhold til siCtrl behandlede celler er angitt som 100%, ble bestemt etter hver cellelinje. For denne analysen, ble et likt antall celler sådd ut i triplikat på dag 0, og kulturene transfektert på dag 1, og deretter trypsinert og tellet 72 timer senere. (C) Total RNA fra forsøket i (C) ble separert på en 1% agarose-formaldehyd-gel, overført til nylonmembraner og underkastet autoradiografi. Nylig syntetiserte 18S rRNA er indisert, mens det totale nivå av 18S rRNA overført til membranen ble visualisert ved hjelp av metylen blå farging. Actinomycin D ved en sluttkonsentrasjon på 5 nM ble det tilsatt 3 timer før merking og tjente som en kontroll for inhibering av rRNA transkripsjon. (D) U343MGa Cl2: 6-celler ble transfektert med sirnas som angitt, og etter 72 timer ble cellene merket med [
3H] -uridine i ytterligere 2 timer. Radioaktiv inkorporeringen ble målt ved hjelp av væskescintillasjonstelling og uttrykt som cpm /pg totalt RNA og deretter normalisert til nivået i siCtrl transfekterte celler satt til 100%. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt og SEM representerer tre ulike eksperimenter. (E) U343MGa Cl2: 6 celler transfektert med siRPS9-1 eller siCtrl i 72 timer, ble inkubert med [metyl-
3H] -L-metionin i 2 timer for å merke de nylig syntetiserte rRNA-forløpere, etterfulgt av isolering av total RNA. Like mengder av total-RNA ble deretter separert på en 1% agarose-formaldehyd-gel, overført til nylonmembraner og underkastet autoradiografi. Nylig syntetiserte 18S rRNA er indikert (venstre panel) og total 28S og 18S rRNA overført til membranen ble visualisert ved hjelp av metylen blå farging (høyre panel). En stjerne angir tydelig akkumulering av et mellom rRNA forløper. (F) U343MGa Cl2: 6 celler transfektert med sirnas i 72 timer som indikert ble merket med [
35S] metionin. Cellene ble sultet av metionin og cystein i 30 minutter før tilsetning av [
35S] -metionin. Etter merking i 2 timer ble de proteinekstrakter ble forberedt. Radioaktiv inkorporeringen ble målt ved hjelp av væskescintillasjonstelling og uttrykt som cpm /ug totalt protein og deretter normalisert for å kontrollere cellene satt til 100%. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt og SEM representerer tre ulike eksperimenter.
