Abstract
Bakgrunn
Aktiveringen av MAPK og PI3K /AKT /mTOR trasé er innblandet i de fleste kreftformer. Aktiverende mutasjoner i begge disse banene er blitt beskrevet i kolorektal cancer (CRC), og således indikerer deres potensial som terapeutiske mål. Denne studien evaluerte kombinasjonen av et PI3K /mTOR-inhibitor (PF-04691502 /PF-502) i kombinasjon med en MEK-inhibitor (PD-0325901 /PD-901) i CRC-cellelinjer og pasient-avledet CRC-tumor xenograft-modeller (PDTX) .
Materialer og metoder
Den anti-proliferative effekt av PF-502 og PD-901 ble vurdert som enkle midler, og i kombinasjon mot et panel av CRC-cellelinjer med forskjellig molekyl bakgrunn. Synergy ble evaluert ved bruk av Bliss additivity metoden. I utvalgte cellelinjer, undersøkte vi kombinasjonseffekter på nedstrøms effektorer ved immunoblotting. Kombinasjonen ble deretter evaluert i flere fullt genetisk merkede CRC PDTX modeller.
Resultater
in vitro
eksperimenter viste et bredt spekter av IC
50 verdier for begge midler mot en cellelinje panel. Kombinasjonen av PF-502 og PD-901 viste synergistisk anti-proliferativ aktivitet med Bliss verdier i tilsetningsområdet. Som forventet, ble p-AKT og p-ERK nedregulert av PF-502 og PD-901, respektivt. I PDTX modeller, etter en 30-dagers eksponering for PF-502, PD-901 eller kombinasjonen, demonstrerte kombinasjonen forbedret reduksjon i tumorvekst sammenlignet med enten monoterapi uavhengig av KRAS eller PI3K mutasjonsstatus.
konklusjoner
kombinasjonen av et PI3K /mTOR og en MEK hemmer vist forbedret anti-proliferative effekter mot CRC cellelinjer og PDTX modeller
Citation. Pitts TM, Newton TP, Bradshaw-Pierce EL , Addison R, Arcaroli JJ, Klauck PJ, et al. (2014) Dual Farmakologisk målretting av MAP kinase og PI3K /mTOR Pathway i prekliniske modeller for tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (11): e113037. doi: 10,1371 /journal.pone.0113037
Redaktør: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Canada
mottatt: 19 juni 2014; Godkjent: 17 oktober 2014; Publisert: 17.11.2014
Copyright: © 2014 Pitts et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Pfizer Inc og University of Colorado Cancer Center Grant P30 CA046934. Finansiører hadde en mindre rolle i studiedesign og beslutningen om å publisere. Finansiører hadde ingen rolle i datainnsamling og analyse, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne av dette manuskriptet har lest journalen politikk og har følgende konkurrerende interesser: Pfizer gir økonomisk støtte til SGE for onkologi stipend. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
To av de impliserte cellulære veier kreft er phosphatidylinositol-3-kinaser (PI3K) og mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) veier. Klassen I (PI3K) er heterodimere lipid kinaser som utgjør en regulatorisk P85 subenhet og en katalytisk p110 subenhet [1]. PI3K fosforylerer 3-hydroksylgruppen i fosfatidylinositol, som deltar i en rekke forskjellige signalveier som er viktige for kreft, som proliferasjon, differensiering, kjemotaksis, overlevelse, handel, og glukosehomeostase [2], [3]. På grunn av det mangfoldige cellular funksjon, er de PI3K aksen sterkt innblandet i kreft hos mennesker; opp til 30% av alle humane kreftformer har en mutasjon i et PI3K sti-komponent [4]. I tykktarmskreft (CRC),
PIK3CA
genet, som koder for p110α katalytiske subenhet av klasse I PI3Ks, har vist seg å være mutert i 10-20% av CRC vevsprøver [5].
A nedstrøms komponent av PI3K-signalveien er pattedyr målet for rapamycin (mTOR). Cellevekst er en av de viktigste funksjonene som styres av mTOR; aktivering av mTOR via PI3K /AKT-reaksjonsveien er kritisk for den celle i balanse næringsopptak og vekst, og avvikende hyperactivation av denne veien bidrar til tumorgenese [6], [7]. Rollen til mTOR i disse cellulære funksjoner gjør det til et attraktivt mål for inhibering; siden utviklingen av rapamycin førti år siden, har mange første og andre generasjon mTOR-hemmere blitt syntetisert og er i forskjellige stadier av klinisk og preklinisk utvikling [8], [9].
MAPK /ERK (MEK) komplekser er komponenter i Ras /Raf signale akse. Signalisering gjennom denne veien resulterer i øket proliferasjon og resistens mot apoptose, mens konstitutiv aktivering bidrar til chemoresistance i flere krefttyper [10], [11]. Mutasjoner i KRAS, NRAS, eller BRAF (alle oppstrøms for MEK-komplekser) er svært vanlig i CRC, og er blitt funnet i 50-60% av tumorprøver [12], [13]. En rekke stoffer har blitt utviklet som er rettet mot EGFR, er RAS, RAF, eller MEK, hvorav mange er i kliniske studier og noen som allerede er godkjent [14].
Høring mellom PI3K /AKT /mTOR vei eksisterer: for eksempel kan PI3K aktiveres av RAS, og tumor suppressor tuberin (en negativ regulator av mTOR) er et direkte substrat ERK [15] – [17]. Det har vist seg også at samtidig forekomst av endringer i den PI3K-AKT-mTOR og RAS-RAF-MEK-trasé forekommer i en tredjedel av CRC-prøver, noe som tyder på at samtidig inhibering av begge reaksjonsveier kan være nødvendig for terapeutisk nytte [12]. I tillegg er det antatt at RAS-RAF-MEK signale akse kan virke som en kompenserende mekanisme med inhibering av PI3K-AKT-mTOR vei, og vice versa [18], [19]. Beviset for omfattende krysstale mellom disse banene har skapt stor interesse samtidig hemmer utskillelsen, med flere ulike strategier nå under utvikling [20].
For å utforske effekten av samtidig hemming av både PI3K-AKT-mTOR og RAS-RAF-MEK trasé, undersøkte vi kombinasjonen av PF-04691502 (PF-502) med PD-0325901 (PD-901). PF-502 er en oralt biotilgjengelig, potent ATP-konkurrerende kinase hemmer av både klasse I PI3Ks og mTOR [21], [22]. I en nylig avsluttet en fase I klinisk studie, ble PF-502 funnet å være godt tolerert med trøtthet, redusere appetitten, kvalme hyperglykemi, utslett, oppkast, diaré og slimhinnebetennelse er de mest sett bivirkninger. Imidlertid fleste av disse var Grad 1 eller 2. [23] PD-901 er en svært potent, oral, små-molekyl-inhibitor av MEK1 og MEK2 som viste noen aktivitet i tidlige kliniske forsøk og er forbundet med toksisitet er karakteristisk for denne klassen av stoffer : utslett
, diaré, tretthet, kvalme og synsforstyrrelser, [24]. PD-901 er nå i fase I kliniske forsøk for behandling av CRC i kombinasjon med PKI-587 (PF-0521384), en dobbel PI3K /mTOR-hemmer med tilsvarende potens PF-502 [24] – [26]. En fordel med denne kombinasjonen er at gjennom hemming av oppstrøms PI3K, unngås tilbakemelding oppregulering av AKT ved mTOR-inhibering [27].
I denne studien vil vi beskrive den forbedrede anti-tumor aktivitet av den doble PI3K /mTOR-hemmer PF-502 og MEK hemmer PD-901 i
in vitro Hotell og
in vivo
modeller av tykk- og endetarmskreft.
Materialer og metoder
kjemikalier og reagenser
PF-04691502 (PF-502) og PD-0325901 (PD-901) ble levert av Pfizer Inc. (San Diego, California). For
in vitro
arbeid, både agenter ble oppløst i 100% DMSO i en konsentrasjon på 10 mM. For
in vivo
studier ble PF-502 suspendert i 0,5% metylcellulose i vann, og PD-901 ble suspendert i 0,5% hydroksypropylmetylcellulose, 0,2% Tween-80 i vann.
Cell linjer og kultur
menneske~~POS=TRUNC kolorektal kreft cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection, DSMZ, eller den koreanske cellelinje Bank. Geo-celler, som er beskrevet tidligere [28], ble vennlig levert av Dr. Fortunato Ciardiello (Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento Medico-Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale «F Magrassi e A Lanzara,» Seconda Universita «degli Studi di Napoli, Napoli, Italia). KM12L4, KM12C, og KM20, beskrevet tidligere [29], var alle vennlig levert av Scott Kopetz (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas). Alle celler ble rutinemessig dyrket i RPMI 1640. Alt medium ble supplementert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, og 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer. Alle cellene ble holdt ved 37 ° C under en atmosfære inneholdende 5% CO
2. Celler ble rutinemessig undersøkt for tilstedeværelse av mykoplasma (MycoAlert; Cambrex BioScience). Alle CRC cellelinjer brukt i denne studien har vært fullstendig karakterisert og godkjent ved universitetet i Colorado Cancer Center DNA sekvensering og analyse kjerne.
Sulforhodamine B (SRB) og CyQuant celleproliferasjon Analyser
Celler ble sådd i 96-brønns klare plater på 2000-8000 celler per brønn, avhengig av cellelinje egenskaper. For CyQuant analysen ble cellene sådd ut i svart-vegger plater. Etter 24 timer ble cellene inkubert i 72 timer med media bare eller varierende konsentrasjoner av PD-901 (0,015 umol /L-1 pmol /L) eller PF-502 (0,08 umol /L-5 pmol /L), som enkle midler eller i kombinasjon. For CyQuant analysen, ble platene forberedt og lese i henhold til produsentens protokoll (Life Technologies, Carlsbad, California). Sulforhodamin B assay (SRB) ble utført som beskrevet tidligere [30]. I korthet ble cellene fiksert med 10% tricholoracetic acidat 4 ° C i 30 minutter, vasket 3 x med vann og tørket ved RT. De ble deretter farget med en sulforhodamin B (SRB) oppløsning (0,4% w /v SRB i 1% eddiksyre) i 20 minutter ved romtemperatur ble vasket 3 x med 1% eddiksyre og gjenværende SRB ble solubilisert med 10 mM ikke-bufret Tris . Absorbansen ble avlest ved 492 nm, ved hjelp av Synergy to plateleser (Biotek, Winooski, VT). Data ble normalisert til absorbansen intet medikament (ND). En kombinasjon effekt ble analysert ved hjelp av Bliss additivity modell som beskrevet tidligere [31].
caspase 3/7 aktivitet
caspase-Glo 3/7 Lysende analyse (Promega, Milwaukee, WI) ble anvendt som en indikator på apoptotisk aktivitet gjennom kaspase 3 og 7-aktivitet. Celler ble sådd i hvite vegger plater på 2000-8000 celler per brønn, avhengig av cellelinje egenskaper. Etter 24 timer ble cellene inkubert i det angitte tidspunkt med bare eller i varierende konsentrasjoner av PD-901 eller PF-502 media, som enkle midler eller i kombinasjon. Data presentert som fold-endring, normalisert til kontroll.
klonogene Analyser
Celler ble sådd på 2000 celler per brønn i en seks-brønns plate og lov til å feste natten. PD-901 eller PF-502 ble tilsatt som enkle midler eller i kombinasjon, og inkubert i 72 timer. Etter 72 timer ble cellene vasket i fullstendig media og medier uten legemiddel ble tilsatt tilbake i ytterligere 72 timer. Celler ble fiksert med 100% metanol i 30 minutter og farget med 2% krystallfiolett. Den krystallfiolett ble så oppløst i 1% eddiksyre, og supernatanten ble overført til en 96-brønns plate. Absorbansen ble avlest ved 565 nm, ved hjelp av Synergy to plateleser (Biotek, Winooski, VT). Dataene ble normalisert for å kontrollere.
Immunoblotting og antistoff Array
Cellene ble utsådd i 6-brønners plater og tillatt å feste i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer med enten PD-901 eller PF-502, eller en kombinasjon. Cellene ble deretter vasket med PBS og lysert med RIPA-buffer (Cell Signaling, Danvers, MA). Etter ultralydbehandling og sentrifugering, ble totalt 30 ug protein lysat lastet opp på en NuPage gel (Life Technologies, Carlsbad, California), elektroforese, og overført til en nitrocellulosemembran med iBlot (Invitrogen, Carlsbad, California). Membranen ble blokkert, og undersøkt over natten med primære antistoffer, vasket i 10 minutter 3 x med, og analysert med DyLight sekundære antistoffer (Cell signalering, Danvers, MA), og avbildes med Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Alle primære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og utvannet som per produserer instruksjoner. For antistoff-matrisen, ble skåret ut svulster lysert i RIPA-buffer ved bruk av en FastPrep24 vevshomogenisator (MP Biologicals, Santa Ana, CA). Proteinkonsentrasjonen ble normalisert og lagt til PathScan Stress og apoptose signale Antistoff Array som per produserer instruksjoner. Array ble utviklet ved hjelp av Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Intensiteten av hver spot ble analysert ved hjelp av Image Studio programvare (Licor, Lincoln, NE) og tettheten av hver spot ble fremstilt grafisk.
Pasient-avledet Xenotransplantat Studier
Fem til seks uker gamle kvinnelig atymiske nakne mus (Harlan Labs, Indianapolis, iN) ble brukt for alle dyrestudier, bur i grupper på fem, holdt på en 12 timers lys /mørke syklus, og gitt steril mat og vann
ad libitum
. Pasienten-avledede xenotransplantater ble samlet som tidligere beskrevet [28]. I korthet ble en tumorprøve oppsamlet på tidspunktet for kirurgi fra en samtykkende pasient ved University of Colorado sykehus. Tumor materiale som gjenstår etter histopatologisk analyse ble skåret i 2 til 3 mm
3 stykker, nedsenket i Matrigel, og implantert subkutant i flanken av fem nakne mus. Etter svulster ble utvidet gjennom minst F3 generasjonen, de ble skåret ut, klippe, og injisert i venstre og høyre flankene av ca 25 mus for hver xenograft studie (50 totalt svulster fordelt på fire grupper: Kjøretøykontroll, PF-502 monoterapi , PD-901 monoterapi, og PF-502 /PD-901 kombinasjon). Når den gjennomsnittlige tumorstørrelsen nådde et volum på omtrent 200 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i fire forskjellige grupper. Mus ble overvåket daglig for tegn på toksisitet og veid to ganger ukentlig. Behandling ble administrert en gang daglig (10 mg /kg PF-502 og /eller 1,0 mg /kg PD-901) ved oral gavage. Tumor volum (ligningen for volum = (lengde × bredde
2) × 0,52) ble evaluert to ganger per uke med digitale calipers, ved hjelp av Study direktør programvarepakken (Studylog Systems, South San Francisco, California). Tumorvekstratene ble bestemt for hver individuelle tumor ved å tilpasse tumorvolumdata i løpet av behandlingsperioden til en eksponensiell vekst ligning med SAAM II v. 2,3. (The Epsilon Group, Charlottesville, VA). Ved slutten av behandlingen, ble musene avlivet av CO
2 overdose etterfulgt av cervikal forvridning før fjerning av svulstene for videre analyse.
Data Analysis
En vei ANOVA analyser med en Tukey post-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans mellom flere grupper. Analyser ble utført med Prism versjon 5.0,
p-
verdier. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeid og omsorg ble utført i henhold til retningslinjene for Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Særlig godkjenning for muse eksperimenter ble oppnådd med protokollen 51410 (08) 1E tittelen «Utvikling og vedlikehold av Primary GI Tumor Bank for utforming av Rational behandling ved hjelp av musen svulst explants». Alle rimelige anstrengelser ble gjort for å bøte lidelse, inkludert anestesi for smertefulle prosedyrer. De menneskelige svulster ble oppnådd ved hjelp av Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB) godkjent protokollnummer 08-0439. Samtykke for svulst gjenfinning ble skrevet.
Resultater
Virkningene av PF-502 og PD-901 som enkelt agenter på spredning av tykk- og endetarmskreft cellelinjer
CRC cellelinjer var eksponert for økende konsentrasjoner av PF-502 og PD-901 i 72 timer, proliferasjon ble bedømt og IC
50-verdier ble beregnet fra gjennomsnitt spredning av triplikat eksperimenter. Som vist i figurene 1 og 2 var det en større enn 10-ganger forskjell i IC
50s mellom sensitive og resistente CRC cellelinjer som ikke korrelerer med mutasjonsstatus av KRAS, BRAF, eller PIK3CA. Fire CRC cellelinjer med forskjellige genotyper ble valgt for videre analyse.
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater og tillatt å holde seg i 24 timer. Celler ble eksponert for økende konsentrasjoner av forbindelse i 72 timer og proliferasjon ble bedømt ved bruk av CyQuant analysen. Proliferaion analysene ble utført i triplikat og IC
50-verdier ble beregnet fra den gjennomsnittlige spredning. Mutasjonsstatus for KRAS, BRAF, og PIK3CA er i fargede bokser.
Celler ble sådd ut i 96 brønners plater og lov til å følge i 24 timer. Celler ble eksponert for økende konsentrasjoner av forbindelse i 72 timer og proliferasjon ble bedømt ved bruk av SRB-analysen. Proliferasjonsanalyser ble utført i triplikat og IC
50-verdier ble beregnet fra den gjennomsnittlige spredning. Mutasjonsstatus for KRAS, BRAF, og PIK3CA er i fargede bokser.
Kombi effektene av PI3K /mTORi PF-502 og Meki, PD-901 i kolorektal kreft cellelinjer
Løvø (KRAS
G13D /PIK3CA
WT), HCT116 (KRAS
G13D /PIK3CA
H1047R), WiDr (BRAF
V600E /PIK3CA
P449T), og Geo (KRAS
G13D /PIK3CA
WT) ble valgt for videre kombinasjon analyse.
Hver av de 4 CRC cellelinjer ble eksponert for varierende konsentrasjoner av PI3K /mTORi, PF-502 og Meki PD 901 som enkle midler eller i kombinasjon i 72 timer. Proliferasjon ble målt ved hjelp av analysen CyQuant og hemmingsverdier er vist i figur 3A. Kombinasjonen viste en større effekt på inhibering av proliferasjon i alle fire CRC-cellelinjene som ble testet ved forskjellige konsentrasjoner. Denne informasjonen ble bekreftet i CRC cellelinjer som bruker Bliss additivity modell. Bliss verdier ble beregnet som beskrevet i Materialer og metoder og utlignet for hver kombinasjon er presentert i figur 3B. HCT116, WiDr og GEO både viser gjennomsnittlig Bliss skårer litt over en som viste en større enn additiv effekt (1,08 ± 0,09, 1,11 ± 0,08, 1,08 ± 0,08, henholdsvis) mens Løvø viste omtrent en additiv effekt (1,019 ± 0,08,). For å avgjøre om kombinasjonen effekt observert var assosiert med irreversibel hemming av spredning, ble en klonogene analyse utført. De fire CRC-cellelinjene ble utsatt for 0,6 umol /L av PF-502 og 0,3 umol /L av PD-901 som enkle midler og i kombinasjon. Alle fire cellelinjer viste en reduksjon i clonogenicity av kombinasjonen sammenlignet med enten enkelt middel, mens den HCT116, demonstrerte GEO, og WiDr statistisk signifikante forskjeller. (Figur 4).
Løvø (KRAS
G13D), HCT116 (KRAS
G13D /PIK3CA
H1047R), WiDr (BRAF
V600E /PIK3CA
P449T), GEO (KRAS
G13D). Celler ble utsatt for forskjellige kombinasjoner av PF-502 og PD-901 i 72 timer. (A) Fraksjon hemmet ble fremstilt grafisk etter eksponering for monoterapi og kombinasjons. (B) Bliss additivitet ble beregnet, og for å vurdere kombinatoriske effekter. Gjennomsnittlig bliss skår ble fremstilt grafisk.
(A) Løvø, (B) HCT116, ble (C) WiDr, og (D) GEO belagt i 6 brønners plater og utsatt for monoterapi er PI3K /mTORi , PF-04691502, den Meki, PD-0325901, eller en kombinasjon i 72 timer. Medikamentet ble fjernet og erstattet med media for å tillate for gjenvekst av kloner. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett og fotografert. (E) Den krystallfiolett ble solubilisert i 1% eddiksyre og absorbans ble bedømt på en plateleser. Dataene ble normalisert til å kontrollere og grafisk. Alle data presenteres som gjennomsnitt ± SD, ANOVA Tukey justerte p-verdier: *
p
, 0,05, **
p
0,01, ***
p
0.001 vs kjøretøy, #
p
, 0,05, ##
p
0,01, ###
p
0,001 vs PF-502,
p
, 0,05,
p
0,01,
p
0,001 vs PD-901. All data representerer tre uavhengige eksperimenter.
Vi preges også effektene av PI3K /mTORi, PF-502 og Meki, PD-901 på etablerte nedstrøms effektorer av relevante veier. PF-502 har vist seg å redusere AKT, 4EBP1 og S6RP fosforylering [22], mens PD-901 hemmer fosforylering av ERK [32], [33]. For å validere effekten av disse 2 agenter og se etter tegn på en samarbeidende effekt, ble modulering av nedstrøms mål i MAPK og PI3K trasé analysert. Som vist i figur 5, behandling med PF-502 eller PD-901 indusert reduksjon i Pakt, pS6RP, P4EBP1, og Perk hhv. Interessant, ved eksponering for den Meki, PD-901 Vi observerte en mer markert reduksjon i pS6RP enn det som ble observert i PF-502 behandlede celler i tre av de fire CRC-cellelinjer. Disse reduksjonene ble i hovedsak opprettholdt i kombinasjonen.
Apoptose er forbedret etter eksponering for kombinasjonen av PF-502 og PD-901 i kolorektal kreftcellelinjer
klonogene data indikerte at kombinasjonen resulterte i forlenget antiproliferative effekter, således målte vi apoptose som en fenotypisk endepunkt. For å gjøre dette utsatte vi de fire CRC-cellelinjer til 0,6 umol /L av PF-502 og 0,3 umol /L av PD-901 som enkle midler, og i kombinasjon i 24 timer. Apoptose ble målt ved hjelp av Caspase Glo 3/7 assay. Som vist i figur 6, selv om det var en tendens til økt apoptose med kombinasjonen i alle cellelinjer, i WiDr-celler disse effektene var statistisk signifikant sammenlignet med både enkle midler.
Alle data presenteres som gjennomsnitt ± SD, ANOVA Tukey justerte p-verdier: *
p
, 0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001 vs kjøretøy, #
p
, 0,05, ##
p
0,01, ###
p
0,001 vs PF-502,
p
, 0.05,
p
0,01,
p
0,001 vs PD-901. All data representerer tre uavhengige eksperimenter.
Antitumor effekter av PF-502 og PD-901 i pasient avledet tumorxenotransplantater
Neste for å bekrefte anti-tumor effekter observert i vår
in vitro
modell, vi utsatt fire pasient avledet tumorxenotransplantater (PDTX) modeller med varierende mutasjonsstatus til PI3K /mTORi, PF-502, den Meki, PD901, eller en kombinasjon. Den anti-tumor effekten av hver forbindelse ble bedømt ved å bestemme veksthastigheten til hver enkelt svulst i hver behandlingsgruppe. Som vist i figur 7A, bare CUCRC040 modellen (
KRAS
G12V /PIK3CA
E542G) viser en signifikant fordel av kombinasjonsbehandlingen i løpet av monoterapi behandlinger (p 0,05). Den kombinasjonsbehandling var også statistisk signifikant i CUCRC108 (KRAS
G12C) og CUCRC125 (KRAS
WT) PDTX modeller sammenlignet med kontroller, men ikke i forhold til monoterapi behandlingsgruppene (figur 7B-C). Og det CUCRC042 (KRAS
G13D) modellen var relativt svarer på alle behandlinger (figur 7D). Tumorvekstkurver er vist i fig S1.
Hvert punkt representerer en enkelt svulst. Gjennomsnittlig tumorvekst ± standardavvik er representert ved baren og håndtak. Alle data presenteres som gjennomsnitt ± SD, ANOVA Tukey justerte p-verdier: * P 0,05 vs. kontroll;
† P 0,05 vs. 901;
‡ P 0,05 vs. 502.
Kombinasjonen av PF-502 og PD-901 hemmer pro-overlevelse trasé og påvirkning apoptotiske markører i PDTX modeller
For å vurdere effektene på signalveier av PI3K /mTORi, PF-502 og den Meki, PD-901 i PDTX modellene, et antistoff matrise ble anvendt med lysater av tumorer som er samlet fra gruppe for hver modell i slutten av studien. Svulster ble lysert i RIPA-buffer, og påføres på PathScan Stress og apoptose signale antistoff Array ved like konsentrasjoner. Arrays ble visualisert på en Licor Odyssey og tetthet /intensiteten av dupliserte flekker fra tre ulike svulstene ble normalisert til bilen kontroll og grafisk. Nivåene av Perk og Pakt ble redusert i PD-901 og PF-502 behandlingsgruppene, sammenlignet med kontrollgruppen i CUCRC040, CUCRC108 og CUCRC125 PDTX modeller, som er konsistent med tumorvekst profiler og respons observert i disse behandlingsgruppene ( Figur 8A-B og fig S2). I tillegg ble det nedregulering av Perk og Pakt opprettholdt i kombinasjons gruppene i disse modellene. Men bare i CUCRC040 modellen var nivået på perk i kombinasjonsgruppen faktisk lavere enn både monoterapi armene. Den CUCRC042 motstandsdyktig modell viste ingen reduksjon i perk eller Pakt (figur 8A-B og figur S2). Interessant, i CUCRC042 behandling med PD-901 resulterte i en økning i pakt og en økning i pBAD (figur 8B-C og fig S2).
Total-protein ble renset fra PDTX ved slutten av behandlingen og vurderes en stress og apoptose antistoff array. Tetthet av stedene ble oppnådd, og grafisk. Alle data presenteres som gjennomsnitt ± SD, ANOVA Tukey justerte p-verdier: *
p
, 0,05, **
p
0,01, ***
p
0.001 vs kjøretøy, #
p
, 0,05, ##
p
0,01, ###
p
0,001 vs PF-502,
p
, 0,05,
p
0,01,
p
0,001 vs PD-901. Alle data er en representant for tre separate svulster fra hver gruppe.
Diskusjoner
Om lag 40% av kolorektal kreft havner en mutasjon i KRAS genet som forårsaker denne veien for å være konstitutivt aktiv. Andre mutasjoner i denne reaksjonsvei, inkludert RAS (NRAS og HRAS) og omfatter en annen BRAF 1-3% og 5-15%, og [34], [35]. PIK3CA mutasjoner forekommer hos ca. 15% av kolorektal kreft og av disse 8-9% har mutasjoner i både PIK3CA og KRAS [34], [36]. Med begge disse store pro-overlevelse /proliferativ trasé aktive i kolorektal kreft, i tillegg til cross-talk /tilbakemeldinger som oppstår mellom disse banene, det er en begrunnelse for å målrette begge veier med lite molekyl hemmere.
hemmere av RAS /RAF /MEK sti har eksistert i over et tiår og enkelt agent kliniske studier har i stor grad vært skuffende. For eksempel, gjorde en fase II studie med CI-1040, en første-generasjons MEK hemmer, ved avansert kolorektal kreft ikke viser signifikant antitumoraktivitet. Men en nyere fase II studie med andre generasjon MEK hemmer selumetinib vist tilsvarende aktivitet som det kjemoterapeutiske middel kapecitabin i CRC pasienter [37], [38]. Med beskjedne resultater til monoterapi MEK hemming i kolorektal kreft, synes det åpenbart at kombinasjonsbehandling bør undersøkes.
Mange prekliniske studier har vist at målretting både RAS /RAF /MEK og PI3K /AKT /mTOR sti er mer fordelaktig i mange tumortyper [39] – [42]. I eggstokkreft co målretting av PI3K /mTOR og RAS /MEK sti vist synergistisk hemming av spredning og induksjon av celledød [42]. Tilsvarende, i basal-lignende brystcancermodeller, ble det observert en forsterket inhibering av proliferasjon og en økning i apoptose
ble observert in vitro
og en økning i tumorveksthem
in vivo product: [39] . Mesteparten av dataene i kolorektal kreft har vært i KRAS muterte modeller siden denne populasjonen er behov for nye nye behandlingsformer. Roper
et. al
. viste at kombinasjonen PI3K og MEK hemming fremmer apoptose og tumor regresjon i musemodeller av kolorektal kreft [41]. En annen studie i menneskelig kolorektal PDTX modeller, viste mer av en svulst stasis effekt, med og lite regresjon som tyder på dette kombinasjonsregime kan ikke oversette til varige terapeutiske effekter [40].
I denne studien vi brukt både tykk- og endetarmskreft cellelinjer og PDTX modeller for å vise at PI3K /MEK kombinasjonsbehandling er mer aktive enn monoterapi behandling i modeller av CRC med forskjellige molekylære bakgrunn. Både PF-502 og PD901 utstilt monoterapi aktivitet mot i et stort panel av kolorektal kreft cellelinjer uavhengig av RAS eller PIK3CA mutasjonsstatus. Når kombinasjonen ble testet i KRAS mutant, BRAF mutant eller KRAS /PIK3CA doble mutanter var det en forbedret kombinasjon effekt på ulike konsentrasjoner med HCT116, WiDr og GEO viser en litt mer robust kombinasjon effekt i forhold til Løvø. Evnen til å danne kolonier etter eksponering for kombinasjonen ble også forringet som indikerer at inhibering av disse reaksjonsveier som fører til en cytotoksisk i stedet for cytostatisk fenotype. Dette ble også støttet ved en økning i apoptose i kombinasjonen. Det er interessant å merke seg at ved behandling med Meki, PD901, en markert nedgang ble observert i pS6RP i tre av de fire CRC cellelinje-modeller. Dette kan skyldes det faktum at TORC1 aktivitet, som bevirker S6 fosforylering er et konvergenspunkt som omfatter flere oppstrøms signalveier i noen tumortyper. For eksempel, i MAPKi følsomme melanom, behandling med en Rafi eller en Meki, resulterer i redusert PS6, mens i de ufølsomme modeller ingen reduksjon i fosforylering er observert [43]. Det samme kan være sant i de tre PD-901 sensitive CRC cellelinjer (HCT116, Løvø, og WiDr) i motsetning til den mer motstandsdyktig CRC cellelinje, GEO, noe som kan tyde på at redusert pS6RP kan tjene som en markør for respons.
Neste vi overført våre
in vitro
data
in vivo
bruke våre CRC PDTX modeller. Disse modellene er tenkt å gi betydelige forbedringer i forhold til typiske cellelinje xenografter, selv om klinisk validering pågår [40], [44]. Ligner på
in vitro
data var det heterogene reaksjoner på kombinasjonsbehandling med en modell, CUCRC040, viser en statistisk signifikant kombinasjon effekt. Dette var i kontrast til de CUCRC108 og CUCRC125 modeller, hvor kombinasjonen bare var statistisk forskjellig fra kjøretøyet og til CUCRC042 som oppviste ingen behandlingseffekter. Interessant nok er dette motstandsdyktig PDTX modellen, viser en økning i pakt ved behandling med den Meki, PD-901, som var assosiert med en økning i pBAD, et protein som kan ha anti-apoptotiske virkninger, og føre til økt celleoverlevelse [45]. Dette kan være verdt å forfølge som en antatt motstand mekanisme.
Til tross for sterk preklinisk dokumentasjon som støtter co-målretting av PI3K /mTOR og MAPK trasé i flere krefttyper, har tidlige resultater fra kliniske studier vist blandet suksess [46 ] – [48]. Kombinasjonene ble generelt godt tolerert og terapeutiske doser ble oppnådd med tidlig tegn på anti-tumor aktivitet observert hos pasienter med avansert melanom og lav grad av serøs eggstokkreft, mens hos pasienter med kolorektal kreft svulst krymping ble sjelden dokumentert.
i en fase i studie, pasienter med kolorektal kreft gikk potensielle molekylære profilering for mutasjoner i KRAS, BRAF, PIK3CA og uttrykk nivåer av PTEN og pMET. Disse pasientene ble deretter tilbudt først-i-menneske fase I-studier basert på resultatene av disse endrede genetisk /protein uttrykk profiler. Valgene inkludert andre generasjons anti-EGFR mAbs (hvis KRAS villtype), PI3K pathway hemmere (hvis PIK3CA mutasjon eller lav PTEN uttrykk), mTORC1 hemmer og anti-IGF1R mAb (hvis lav PTEN uttrykk), PI3K pathway hemmere pluss MEK hemmere (hvis KRAS eller BRAF mutasjon), BRAF-hemmer (hvis BRAF mutasjon) og anti-HGF mAb (hvis høy pMET uttrykk) [49].
