Abstract
Formalin fast og parafin-embedded menneskelig vev resected under kreft kirurgi er uunnværlig for diagnostiske og terapeutiske formål og representerer et stort og i stor grad uutnyttet ressurs for forskning. Optisk mikroskopi av slike prøven er begrenset av diffraksjon begrenset oppløsning av konvensjonell optisk mikroskopi. For å overvinne denne begrensningen, brukte vi STED super-oppløsning mikroskopi slik at optisk oppløsning godt under diffraksjon barriere. Vi visualisert nanoskala protein distribusjoner i deler av godt kommenterte parafin-embedded human endetarmskreft vev lagret i en klinisk depot. Bruk av antisera mot flere mitokondrielle proteiner, STED mikroskopi avslørte forskjellige sub-mitokondrie protein distribusjoner, noe som tyder på et høyt nivå av strukturelle bevaring. Analyse av menneskelig vev som er lagret i inntil 17 år vist at disse prøvene var fortsatt mottagelig for super-oppløsning mikroskopi. STED mikroskopi av deler av HER2 positiv rektal adenokarsinom avslørt detaljer i overflaten og intracellulære HER2 distribusjon som ble uklart i de tilsvarende konvensjonelle bildene, som viser potensialet i super-oppløsning mikroskopi for å utforske hittil i stor grad uutnyttet nanoskala regimet i vev som er lagret i biorepositories.
Citation: Ilgen P, Stoldt S, Conradi LC, Wurm CA, Rüschoff J, Ghadimi BM, et al. (2014) STED Super-Resolution Mikros of Clinical Parafin-Embedded Menneskelig Rektal kreftvev. PLoS ONE 9 (7): e101563. doi: 10,1371 /journal.pone.0101563
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12 mars 2014; Godkjent: 09.06.2014; Publisert: 15.07.2014
Copyright: © 2014 Ilgen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den authors bekrefte at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i papir
Finansiering:. Deler av arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft gjennom Cluster of Excellence «nanoskala Mikroskopi og molekylær fysiologi av hjernen» og EU-prosjektet IMAGINT (Helse-F5 -2011-259881) (både til SJ) samt gjennom KFO179 «biologisk grunnlag av individuelle tumorrespons hos pasienter med endetarmskreft». de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
antall menneskelige vevsprøve lagret i (kliniske) biorepositories ble anslått. på mer enn 300 millioner allerede for 15 år siden i USA alene [1], [2]. Mange av disse prøvene er formalinfiksert og parafininnebygd, en standard klinisk konserveringsmetode som er i bruk i mer enn et århundre. I mange kliniske settinger, er vev tatt fra kreftpasienter under onkologisk kirurgi lagres i blokker med parafin for diagnose, beslutning om postoperative behandlingsstrategier og oppfølgingsstudier, som representerer en stor og verdifull ressurs for å studere patologi og funksjonelle grunnlaget for mange kreftformer.
For analyser kan lagres og kommenterte parafin-embedded vev være seksjonert, avvokset, farget og deretter avbildes ved konvensjonell lysmikroskopi. I klassisk (fluorescens) mikroskopi den oppnåelige oppløsningen er begrenset av diffraksjon til ca. 250 nm, begrenser det ekstraherbare informasjon fra en prøve. Over det siste tiåret, flere super-oppløsning mikroskopi teknikker (nanoscopy) har blitt utviklet som tillater å fundamentalt overvinne diffraksjon grensen, slik at far-felt mikroskopi med en vesentlig forbedret oppløsning [3] -. [5]
av disse teknikkene, står stimulert emisjon mangel (STED) mikroskopi ut som en tilnærming som kan brukes i forbindelse med immunolabeled eksempler og som ikke krever beregnings anstrengelser for å generere det endelige bildet [6], [7]. I STED mikroskopi, er et lett mønster som brukes til å hemme fluorescens ved veldefinert sample-koordinater slik at tilstøtende funksjoner avgir sekvensielt. Inhiberingen av fluorescens blir oppnådd ved stimulert emisjon av eksiterte fluoroforer til grunntilstanden. I en typisk STED mikros gjennomføring fluoroforene som ligger ved den ytre kanten av et scanning brennpunktet av eksitasjonslys blir forbigående kobles ut ved de-eksitasjon ved stimulert emisjon med et smultring-formet STED-bjelke med en sentral null. Som en konsekvens, fluoroforer bare innenfor en effektiv fokus med en diameter på er i stand til å fluorescere. Her,
λ
er bølgelengden,
I
s
er karakteristisk for fluoroforen, og
I
maks
betegner intensiteten av toppen omsluttende null. For
I
max Twitter /
I
s
1, blir den effektive fokus mye mindre enn diffraksjon grensen. Som en konsekvens av dette, i motsetning til i konvensjonelle linsebaserte optiske mikroskoper, oppløsningen er ikke lenger begrenset av bølgelengden.
STED mikros følgelig gir seg som et kraftig verktøy for å åpne opp den hittil i stor grad uutnyttet nanoskala regime i arkivert menneskelig vev materiale. Tidligere har forskjellige super-oppløsningsteknikker blitt benyttet for å bilde protein lokaliseringer i kjemisk faste vibratome seksjoner eller kryostatsnitt av mus eller rotte vev [8] – [10], så vel som i deler av plast innleiret vev fra rotter som uttrykker fluorescerende proteiner som tags [11], [12]. STED Mikroskopi har også blitt brukt til å avbilde levende vev [13] – [15]. Ingen av disse metodene kan umiddelbart bli overført til etablerte kliniske prosedyrer som krever standardiserte prosedyrer og muligheten for langvarig oppbevaring av prøver.
For å undersøke om STED mikroskopi kan anvendes for å visualisere protein fordelinger i parafin-innleiret vev, vi brukte arkivert endetarmskreft vev som hadde blitt resekterte under standardisert total mesorectal eksisjon (TME-kirurgi) og ble lagret ved romtemperatur i opp til 17 år i en klinisk patologi depot. Dette vevet ble valgt for denne studien fordi med en stadig økende forekomst, har tykktarmskreft blitt en av de tre mest hyppige kreftformer i den vestlige verden [16]. En tredjedel av kolorektal kreft er endetarms kreft, og til tross for fremskritt i diagnostikk og multimodalitet behandling ved hjelp av pre-operative (neoadjuvant) kjemoradioterapi fulgt av utvidet onkologisk TME-kirurgi, er den langsiktige prognosen for pasienter med lokalavansert endetarmskreft begrenset av forekomsten av fjernmetastaser i nesten 30% av pasientene [17] – [19]
Dereguleringen av signalisering gjennom de human epidermal vekstfaktor-reseptor (HER; også kjent som erbB) familie av proteiner som har en intrikat rolle i. patogenesen av en rekke humane cancere [20]. Nylig ble det vist at HER2 er overuttrykt i ~ 30% av primærlokalavansert endetarms adenokarsinom, klinisk iscenesatt som Union for International Cancer Control (UICC) iscenesetter II og III [21]. Lite er kjent om den subcellulære lokalisering av HER2 i tumorvev.
I dette manuskriptet undersøkte vi muligheten for å visualisere nanoskala fordeling av HER2 og andre proteiner ved hjelp STED super-oppløsning mikroskopi i arkivert endetarmskreft vev. Vi viser at selv vev lagret i mer enn et tiår i en klinisk depot er mottagelig for STED superoppløsning.
Resultater
fluorescens mikroskopi av tynne snitt
HER2-positiv rektal carcinoma vev, arkivert etter formalin fiksering og parafin-nedgraving, ble delt inn i 2 mikrometer tykke skiver. Vevssnittene ble avvokset og varmebehandlet i 45 minutter for antigen gjenfinning [22]. Etter dette ble delene farget med DAPI for å fremheve de kjerner og dekorert med antisera mot integral membranprotein HER2 og mot den mitokondrielle ytre membranprotein Tom20, et vesentlig protein som uttrykkes på alle humane celler. Konfokal mikroskopi viste den sterke ekspresjon av HER2 i tumorvevet, mens de omkringliggende normale stromaceller ikke uttrykker en aktuell mengde av HER2 (figur 1). Mitokondriell massen var høyere i ondartede celler, og som en konsekvens Tom20 ble mer rikelig, selv om det, som ventet, Tom20 signalene var også påvisbar i de normale stromaceller. Også DAPI signalet var gjenkjennelig både i kreftceller og normale vev. Vi konkluderer med at flerfarge immunfluorescens merking og konfokal mikroskopi er mulig på arkivert behandles rutinemessig klinisk parafin-innleiret vev.
Confocal oversiktsbilde over et område av et HER2-positiv kreft i endetarmen vev seksjon som er merket med DAPI (blå) til markere kjerner og dekorert med antisera mot Tom20 (brann) og HER2 (grønn). (A) overlegg, (B) Tom20, og (C) HER2. Skala barer:. 25 mikrometer
Structural bevaring på nanoskala
Den optiske oppløsning av konvensjonell konfokalmikroskopi er begrenset av diffraksjon til rundt 200 nm i aksial flyet, ofte skjuler verdifull informasjon . Parafininnstøpte vev angivelig vise uttalt autofluorescence [23], og selv om den oppnåelige strukturelle bevaring av parafin-embedded tissue er tilstrekkelig for konvensjonell lysmikroskopi (figur 1; [24]), arkivert vev kan være uegnet til å møte de høye kravene til diffraksjon ubegrenset super-oppløsning mikroskopi. For å undersøke om rutinemessig behandlet lagret parafin-embedded klinisk menneskelig vev er egnet for STED mikroskopi, bestemte vi oss for å analysere sub-mitokondrie protein distribusjoner i mitokondriene. Disse organeller er utfordrende cellulære strukturer for super-oppløsning mikroskopi på grunn av sin lille størrelse, deres komplekse indre organellar arkitektur og meget tett emballasje av proteiner i mitokondrielle membraner [25]. For dette formål anvendes vi parafin-innleiret endetarmskreft vev som ble lagret i ~ 1 år ved romtemperatur i en klinisk patologi arkiv. Vevssnitt inneholdende et lengdesnitt av det indre sirkulære muskel lag av rektum (
muscularis externa
) ble dekorert med antisera mot fire forskjellige mitokondrie proteiner: Tom20, en perifer reseptor ifølge TOM translokase i den mitokondrielle ytre membran; Mic60 (mitofilin), en komponent av den komplekse MINOS lokalisert fortrinnsvis på cristae knutepunktene i den indre membran; aconitasen, en matrise enzym av trikarboksylsyre syklusen katalysere isomeriseringen av citrat for å isocitrat; og cyklofilin D, en peptidylprolyl isomerase lokalisert i mitokondrie matrisen.
I mitokondriene i
muskularis externa
danner store avlange tubuli. Når vevet blokkene ble kuttet langs den langsgående aksen av den resekterte rektale prøven, ble størstedelen av de organeller strukket ut inne i tverrsnittsplanet (figur 2A). Over et stort STED bilde av størrelse 120 pm x 100 pm, Tom20 viste en tydelig punktformet lokalisering i mitokondriene (figur 2A), som er i full overensstemmelse med tidligere studier ved hjelp av ulike former for super-oppløsning mikroskopi i dyrkede pattedyrceller [26] , [27]. Den oppnådde oppløsning, som bestemmes på bakgrunn-klynger, var gjennomgående ~40 nm gjennom de registrerte vevssnitt (Figur S1). Mens det i de tilsvarende confocal opptak fordelingen av Tom20, Mic60, aconitasen og cyklofilin D var praktisk talt umulig å skille, jo høyere oppløsning levert av STED mikroskop viste forskjeller i sub-mitokondrielle fordelinger av de respektive proteiner (figur 2B-E). Tom20, aconitasen og cyklofilin D ble generelt funnet i jevnt fordelt klynger, om enn i forskjellige mengder. Seksjoner dekorert med et antiserum mot cyklofilin D utstilt den tetteste clustering (figur 2E), mens et antiserum mot aconitasen resulterte i merking av spredte klynger (figur 2D). Som vist tidligere for Mic60 i dyrkede celler [28], synes dette proteinet for å få også en mer ordnet fordeling i humant vev (figur 2C). Den generelle sub-mitokondrielle fordeling av de respektive proteiner i vev var sammenlignbar med lokalisering observert i dyrkede humane celler (figur S2).
STED registreringer ble utført på 2 um tykke avvokset deler som er skåret langs den langsgående aksen rektum. (A) Venstre: STED oversiktsbilde over et område av det indre sirkulære lag av rektal
muscularis externa
dekorert med et antiserum mot Tom20. Høyre: Forstørrelser av de områdene i de angitte stiplede rutene viser fordelingen av TOM klynger innenfor mitokondriene. (B-E) STED bilder av vevssnitt dekorert med antisera mot Tom20 (B), Mic60 (mitofilin) (C), aconitasen (D), og cyklofilin D (E). I hvert panel confocal (øverst, venstre) og den tilsvarende STED bildet (øverst til høyre) vises. Bunn: Forstørrelse av STED bildet som indikert med stiplet firkant. Legg merke til de forskjellige distribusjoner av de fire proteiner i mitokondriene. Skala barer: 20 mikrometer (A, venstre); 1 um (A, høyre) og (B-E, øverst); 200 nm (B-E, nederst).
Samlet utgjør disse data tyder på en tilstrekkelig strukturell bevaring av rutinemessig klinisk parafin-embedded tissue kvalifiserer det for bruk i STED super-oppløsning mikroskopi.
STED super-oppløsning mikroskopi av HER2 merket endetarmskreft vev
for å kunne vurdere nytten av STED mikros forhold til konvensjonell mikroskopi, visualisert vi fordelingen av HER2 i deler av endetarmskreft vev som ble scoret som HER2 -positive basert på immunkjemi og in situ hybridisering [21], [29]. Tre påfølgende to mikrometer tykke seksjoner av parafin-embedded vev ble kuttet og behandlet likt for dewaxing og antigen gjenfinning. De tre seksjoner dekker samme område, slik at å direkte sammenligne egenskapene til forskjellige fargingsprosedyrer. Den første delen var farget av en standard klinisk Hematoxylin-Eosin (HE) prosedyre. Som et resultat, ble kjernene farget i blått, mens cytoplasma og den ekstracellulære matriks dukket opp i ulike nyanser av rosa (figur 3A). De to andre delene ble dekorert med et antiserum mot HER2 men med forskjellige sekundære antistoffer. For standard immunhistokjemi, har vi brukt et sekundært antistoff konjugert med peroksydase, å katalysere oksidasjonen av 3, 3′-diaminobenzidin, noe som resulterer i et brunt bunnfall (figur 3B). For fluorescens mikroskopi, sekundære antistoffer merket med rødt fluorescerende fargestoff KK114 [30] ble anvendt (figur 3C).
Legg merke til at de tre etterfølgende seksjoner dekker det samme område i vevet. Bildene ble tatt med diffraksjons-begrenset vidfelt (A, B) eller konfokal (C) mikroskopi. (D, H) og (E, I): tilsvarende forstørrelse av (B) og (C) henholdsvis på steder som er angitt med piler. (F, G, J, K): sammenligning av diffraksjon-begrenset konfokalmikroskopi med STED super-oppløsning mikroskopi på seksjonert lagret svulstvev. Vist er forstørrelser av områdene vist med stiplede firkanter. Top-høyre hjørne: confocal bildebehandling. Venstre-bottom område: STED bildebehandling. Pilene peker HER2-positiv vesikkel-lignende strukturer som løses i STED bildene. Skala barer. 1 mm (A-C), 50 mikrometer (D, E, H, I), 2 mikrometer (F, J), og 500 nm (G, K)
HE farging gir en oversikt av vevet, mens immunhistokjemi og immunfluorescens bildene viser sterk HER2-ekspresjon i tumorceller, men ikke i det omgivende ikke-ondartet vev stroma. Deretter sammenlignet vi immunhistokjemi flekker med immunfluorescens merking som registrert av konfokal og STED mikroskopi (figur 3B-K). For dette formål har vi valgt tilsvarende områder i de to forskjellig merkede vevssnitt. Mens de konfokale bilder av immunfluorescens merking gi en høyere kontrast og membranene er mer skarpt avgrenset som i bildene i immunhistokjemi flekker, vises det totale informasjonsinnholdet sammenlignbare (figur 3D, E, H, I). Antagelig, vises immunofluorescens bildet skarpere, fordi i tilfelle av immunhistokjemi den oppnåelige oppløsningen er i siste instans begrenses av diffusjon av det brune bunnfallet. Begge tilnærmingene viser at HER2 finnes hovedsakelig i plasma membran av endetarmskreftceller. STED mikros muliggjør visualisering av ytterligere detaljer, som er skjult i diffraksjon-begrenset confocal bilder (Figur 3F, G, J, K, Figur S3). Den STED Bildet viser tydelig ~450 nm store HER2 positive vesikkel-lignende strukturer, som kan være på grunn av HER2 intern. De STED bilder selv foreslå eksistensen av enkelt HER2 protein klynger, som er fullt skjult i diffraksjon-begrenset vanlige bilder.
Vi konkluderer med at sub-cellulær distribusjon av HER2 kan visualiseres i deler av arkivert klinisk parafin -embedded endetarmskreft vev. STED mikroskopi avslører strukturelle detaljer, inkludert HER2 positive vesikkel-lignende strukturer i lagret materiale som er uklart når du bruker state-of-the-art konvensjonelle lys microcopy.
STED super-oppløsning mikroskopi på arkiv klinisk materiale etter lang -term lagring
potensialet i super-oppløsning mikroskopi på parafin-embedded vev kan bare bli utforsket mye om metoden kan brukes på vanlige kliniske prøver som de er lagret i flere kliniske arkiver rundt om i verden. For å bestemme påvirkning av langvarig lagring på brukbarheten av arkiv vev for STED mikroskopi, brukte vi parafin-embedded, endetarmskreft vev som ble lagret ved romtemperatur i en rutinemessig klinisk patologi arkiv for opp til 17 år. De parafininnstøpte vev ble forbehandlet som beskrevet før, og som er merket med antistoffer mot mitokondrie protein Tom20 (figur 4). Vi har funnet at selv 17 år gammel vev kan brukes for immunofluorescens merking, selv med økende tid oppbevare lysstyrken av de merkede seksjoner ble redusert, antagelig som reflekterer en reduksjon av tilgjengelige epitoper i de eldede prøver. Bemerkelsesverdig, selv i den eldste vevsprøve, individuelle Tom20 klynger kan løses ved STED mikroskopi, som ikke var merkbar i de respektive tilsvarende diffraksjon-begrenset confocal bilder, som viser at enda flere tiår gamle parafininnstøpte menneskelig vev er mottagelig for STED super-oppløsning mikroskopi.
Representative bilder av tumorvev lagret ved romtemperatur i mindre enn ett år (A), 11 år (B) eller 17 år (C), ble seksjonert, avvokset, dekorert med et antiserum mot Tom20 og avbildes. Venstre: Representative confocal bilder. Det samme farge bord ble brukt til de tre bildene for å visualisere de relative flekker effektivitet. Middle /Høyre: Sammenligning av STED (i midten) og confocal (til høyre) mikroskopi av vevssnitt av ulik alder. Her ble de fargetabeller justert til signalintensitetene som oppnås. Skala barer. 10 mikrometer (til venstre) og en mikrometer (midten, høyre)
Diskusjoner
Kreft vev resected under onkologisk kirurgi er svært viktig for diagnostikk. For rutinemessig analyse, er uttrykket nivåer av spesifikke viktige proteiner generelt bestemt på svulsten eller cellenivå. Proteiner imidlertid utføre sine funksjoner lokalt, og dermed nanoskala fordeling av viktige proteiner kan inneholde verdifulle signaturer, som har så langt ikke blitt ansett for klinisk diagnose. I denne studien viser vi at STED super-oppløsning mikroskopi er egnet til å avsløre nanoskala protein utdelinger i vev som er lagret i flere tiår i biorepositories, og dermed åpne opp nanonivå i disse prøvene.
Det er en enorm og raskt voksende mengde vevsprøver som er lagret i ulike biobanker. Biospecimen kvalitet er ansett som et alvorlig problem [2], [31], og kvaliteten av prøven vil også være avgjørende for de data som kan hentes ut av super-oppløsning mikroskopi. Ikke desto mindre, på grunn av praktiske begrensninger, er det lite sannsynlig å ha kvalitetsnivå som er oppnåelig under strengt kontrollerte laboratoriebetingelser strukturbevaringen av prøven resekterte under rutinemessig operasjon. Det er ytterligere potensial, selv om det antagelig surmountable, utfordringer som kvaliteten og tilgjengelighet av egnede antistoffer og utfordringen å kombinere bildedata med, for eksempel, metabolske signaturer av prøvene. Vi ser for oss at den fremtidige utviklingen i super-oppløsning feltet inkludert parallellisering av bildet oppkjøpet [32], [33], samt automatisk bildeanalyse vil gjøre stor skala analyse av biobanked vev ved hjelp STED og andre superoppløsning teknikker.
Materialer og metoder
etikk erklæringen
studiet ble godkjent av medisinsk etikk komité ved Universitetet i Göttingen (28 juni 2006; # 9/8 /08). Opprinnelsen til de spesifikke prøvene brukt i denne studien har blitt beskrevet i en tidligere publikasjon [21].
Tissue fiksering og embedding
Fersk resected vev ble løst i 4,5% bufret formalin (Th. Geyer, Renningen, Tyskland) ved romtemperatur i 12 til 24 timer. Den faste vev ble innleiret i parafin automatisk (Süsse Labortechnik, Gudensberg, Tyskland) ved hjelp av en vev prosessor (Leica ASP 300; Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland). De parafinblokker ble lagret i mørke ved romtemperatur.
Utarbeidelse av vev lysbilder
Parafin blokker ble kjølt ned til -10 ° C på en kjøleplate (PFM Medical AG, Köln, Tyskland ). De avkjølte parafinblokker ble kuttet i 2 mikrometer tykke vevssnitt på en mikrotom (HM 430, MICROM Internasjonalt, Walldorf, Tyskland) og overføres med en børste i vann ved romtemperatur før de ble montert på glassplater. Å strekke snittede vevsprøver ble objektglass plassert på et varmebord (MEDAX, Kiel, Tyskland) ved 37 ° C og tørket i en inkubator oppvarming ved 37 ° C over natten.
dewaxing
De tørkede Glassene ble deparaffinized med xylol (2 x 8 min) etterfulgt av en serie av synkende alkoholkonsentrasjoner (2 x 2 min 100% EtOH, 2 x 2 min 96% EtOH, 1 x 2 min 75% EtOH) og endelig skylles 3 ganger i vann.
Automatisert immunhistokjemi
Standardisert immunhistokjemisk farging ble utført i en Ventana BenchMark XT Immunostainer (Ventana, Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland). Bruke immunostainer, varmen epitop henting automatisk utført på vevssnitt i CC1 (Cell Conditioning en løsning, Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland) buffer i 60 minutter ved 100 ° C. Deretter vevssnittene ble automatisk inkubert med reaksjonsveien anti-HER-2 /neu (4B5) kanin-monoklonalt antistoff ved 37 ° C i 32 min. Deretter ble seksjonene dekorert med sekundære antistoffer koblet til pepperrotperoksidase og farget med 3,3′-diaminobenzidin (Ultra Universal DAB Detection Kit; Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland). Som counterstain ble Hematoxylin II counterstain reagent (Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland) brukes til å farge kjerner. Til slutt, objektglass ble manuelt dehydrert i en serie med stigende alkoholkonsentrasjoner (2 x 1 min 75% EtOH, 2 x 1 min 96% EtOH, 2 x 1 min 100% EtOH) med en endelig 2 min inkubering i xylol. Platene ble montert i Vitro-Clud (Langenbrinck, arbeids und Medizintechnik, Emmending, Tyskland). Denne metoden ble brukt for 3B, D, H.
Manuell Hematoxylin og eosin (HE) farging
HE farging ble utført på deler av deparaffinized vev. Vevet Platene ble skylt i vann og deretter neddykket i oppløsning Hemalum (Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Tyskland) i 10 minutter. For å tillate utvikling av blå farge av de fargede kjerner, ble vevet skylt lysbildene i kategorien vann i 10 min. Deretter ble prøvene motfarget i 30 sekunder i en Eosin-løsning (1% eosin på 37,5% EtOH, Merck Millipore), skyllet i rent H
2O og dehydrert i en serie med stigende alkoholkonsentrasjoner (2 x 1 min 75% EtOH, 2 x 1 min 96% EtOH, 2 x 1 min 100% EtOH) med en endelig 2 min inkubering i xylol. Platene ble montert i Vitro-Clud (Langenbrinck, arbeids und Medizintechnik, Emmending, Tyskland). Denne metoden ble brukt for figur 3A.
Manuell antigen gjenfinning
Seksjoner ble overført til et lysbilde kammer, nedsenket i CC1 løsning (Cell Conditioning en løsning, Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland) og deretter varmet opp i 45-60 minutter ved 100 ° C i en dampbåt (Multi Gourmet pluss, Braun, Kronberg, Tyskland). Etter avkjøling i 20 minutter, ble skyllet i vann lysbilder.
Manuell immunolabeling
Snittene ble blokkert med 5% eller 10% (vekt /volum) BSA i PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na
2HPO
4, 1,5 mM KH
2PO
4, pH 7,4) i 5 min og inkubert i 1 time med det primære kanin monoklonalt antistoff PATHWAY anti-HER-2 /neu (4B5) (Ventana Medical Systems, Mannheim, Tyskland, katalognummer: 790-2991) (fortynning: 1: 50), polyklonale kanin antistoffer mot Tom20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA; sc-11415) (fortynning: 1:200), polyklonale kanin antistoffer mot Mic60 /mitofilin (Abcam, Cambridge, Storbritannia, ab48139) (fortynning: 1:200), polyklonale kanin antistoffer rettet mot aconitasen (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA; HPA001097) (fortynning: 1:400), eller monoklonale antistoffer mot cyklofilin D (også kalt cyklofilin 3 eller cyklofilin F; Abcam, Cambridge, UK, ab110324) (fortynning: 1:400), henholdsvis, ved romtemperatur. De primære antistoffer ble detektert med sekundære antistoffer (sau anti-mus eller geite-anti-kanin; Jackson Immunoresearch Laboratories) tilpasset merket med rødt emitterende fargestoff KK114 [30] (fortynning: 1:200) eller et sekundært antistoff (sau anti-mus ; Dianova, Hamburg, Tyskland) tilpasset merket med gule emitting fargestoff Atto532 (ATTO-TEC, Siegen, Tyskland) (fortynning: 1:100). Etter immunolabeling, ble vevsprøvene montert i Mowiol supplert med 0,1% (vekt /volum) DABCO (1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 2,5 ug /ml DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole, Sigma-Aldrich).
Mikros
Alle bildene som vises representerer representative bilder. Seksjoner fra mer enn 10 forskjellige parafinblokker ble analysert, vedvarende gi lignende resultater. De immunhistokjemi-farget og HE-farget vevssnitt ble fotografert med en Axio Imager 2 utstyrt med en Axio-Cam MRc (Zeiss, Jena, Tyskland). For konfokalmikroskopi, ble en Leica TCS SP5 mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). For STED og tilsvarende konfokalmikroskopi, ble en tilpasset bygget STED mikroskop brukes [26], [34]. En oppløsning på ~250 nm i confocal bilder og ~40 nm i STED bildene ble oppnådd. Oppløsningen ble bestemt ved å måle den fulle bredde ved halvt maksimum (FWHM) i x- og y-aksen på mer enn 100 bakgrunns klynger, som antagelig stammer fra utfelt sekundære antistoffer. Imaging ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [26], [34]. Bortsett kontrast strekker ikke lenger bildebehandling ble brukt.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Målt diameter på bakgrunn klynger tatt fra Figur 2. (A) Den fulle bredde ved halv maksimum (FWHM) over x- og y-aksene mer enn 100 individuelle klynger ble bestemt. Merk at også bakgrunns klynger som var fysisk større enn oppløsningen av mikroskopet ble analysert. Derfor er det fastslått gjennomsnittlige FWHM kan være verre enn den faktiske oppløsning av mikroskopet anvendes. (B) Representative bakgrunns klynger. Skala: 100 nm
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101563.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Under mitokondrielle protein utdelinger i dyrkede humane celler tatt opp med en STED (til venstre) og confocal (til høyre) mikroskop. Detalj av mitokondrier dekorert med antisera mot Tom20 (A), aconitasen (B), Mic60 /mitofilin (C), eller cyklofilin D (D). Humane primære fibroblaster (A, C) eller U2OS (human bone osteosarkom epitelceller) (B, D). Skala barer: 500 nm
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0101563.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Linje profil gjennom en region hentet fra Figur 3F. Den STED super-oppløsning (A) avslører HER2 positive vesikkel-lignende strukturer som er uklart i tilsvarende confocal bilde (B). (C) normaliserte fluorescensenheter signal belastningsprofiler langs de angitte linjer i STED (rød) og konfokale (svarte) bilder. Den punktplott viser fluorescens signaler fordelt på 3 tilstøtende belastningsprofiler. De heltrukne linjer representerer de tilsvarende passer ved hjelp av en Lorentz-funksjon. Skala:. 500 nm
doi: 10,1371 /journal.pone.0101563.s003 plakater (TIF)
Takk
Vi står i gjeld til Stefan W. Hell for diskusjoner og støtte. Vi takker Jaydev Jethwa for kritisk lesing av manuskriptet og Birgit Jünemann og Hanna Styczen fra Institutt for General, visceral og Pediatric Surgery, for utmerket teknisk assistanse og analyser av standard vev stainings.
