Abstract
Bakgrunn
Genome-wide genuttrykk analyser av svulster er et kraftig verktøy for å identifisere gen signaturer i forbindelse med biologisk og klinisk relevante egenskaper og for flere krefttyper er under klinisk validering av potensielle studier. Imidlertid kan håndtering og behandling av kliniske prøver betydelig innvirkning på molekylære data fra sine analyser. Vi studerte effekten av vev behandlingstiden på genekspresjon i humane normale og tumor kolon vev gjennomgår rutine kirurgiske prosedyrer.
Metoder
RNA ekstrahert fra prøver av 15 pasienter på fire tidspunkter (for en totalt 180 prøver) etter operasjonen ble analysert for genuttrykk på høy tetthet oligonukleotid mikromatriser. En blandet effekt-modell ble anvendt for å identifisere prober med forskjellige uttrykk betyr på tvers av de fire forskjellige tidspunkter. De p-verdier i modellen ble justert med Bonferroni metoden.
Resultater
Trettito probe sett forbundet med vev behandlingstiden på vevsprøver, og trettien i normalt vev , ble identifisert. De fleste gener viste moderate endringer i uttrykk gjennom tidspunkter analysert; men fire av dem var onkogener, og to bekreftet effekten av vev håndtering av uavhengig validering.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at en kritisk tidspunkt for vev håndtering i tykktarm synes å være 60 minutter ved romtemperatur. Selv om antallet tidsavhengige gener vi identifisert var lav, de tre gener som allerede viste endringer på dette tidspunkt i tumorprøver var alle onkogener, derav anbefale standardisering av vev-håndtering protokoller og krefter på å redusere tiden fra prøven fjerning å knipse frysing regnskap for varm iskemi i denne svulsttypen
Citation. Musella V, Verderio P, Reid JF, Pizzamiglio S, Gariboldi M, Callari M, et al. (2013) Effekter av Warm iskemisk tid på Gene Expression Profilering i tykktarmskreft vev og normal slimhinne. PLoS ONE 8 (1): e53406. doi: 10,1371 /journal.pone.0053406
Redaktør: Shoba Ranganathan, Macquarie University, Australia
mottatt: 18 april 2012; Godkjent: 30 november 2012; Publisert: 07.01.2013
Copyright: © 2013 Musella et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fondazione Cariplo-Regione Lombardia (prosjekt~~POS=TRUNC: «Biobanca per il carcinoma colorettale»), Associazione Italiana Ricerca Cancro, Alleanza contro il Cancro, og EurocanPlatform prosjekt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med introduksjonen av nye genomiske teknologier som vev-basert RNA-mikromatriser, genekspresjonsmønster identifisert av microarray analyser har blitt oppdaget at stratify svulster og forutsi kliniske resultater i forskjellige krefttyper [1]. Noen av dem har blitt brukt for å identifisere pasienter som kan ha nytte av spesifikk behandling og FDA (Food and Drug Administration) -godkjent tester basert på brystkreft genet signaturer er nå kommersielt tilgjengelig. Som en konsekvens, samle seg i vev banker kirurgiske prøver som kan brukes for disse analysene er blitt et problem obligatorisk for å forstå de korrelative resultatene av de fleste av dagens kliniske forsøk. Imidlertid kan variasjoner i vev håndtering og behandling av kirurgiske prøver påvirker reproduserbarheten og tolkning av resultater. Flere variabler, inkludert vev manipulasjon, varm ex-vivo iskemi og oppbevaringstiden kan potensielt endre mRNA uttrykk nivåer og påvirke gyldigheten av studier som brukte kliniske prøver [2]. Alle disse variablene må nøye undersøkt for å sette opp retningslinjer for vev bank [3]. Organiseringen av kvalifiserte og sertifiserte biobanker bør være grunnlag for å garantere nettverk av aktiviteter og tilgjengelighet av kvalitetssertifisert biologisk materiale.
Formålet med denne pilotstudien var å undersøke effekten av vev behandlingstid i nøyaktig dokumentert vev prøvene som fulgte de rutinemessige behandlingen standarder i vår institusjon (Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, INT-MI), for å utvikle en klinisk relevant metode for prøvetaking svulster i vev banker som trygt kan brukes for microarray analyse. Vi brukte tykktarmskreft (CRC) modell. CRC er den nest hyppigste årsaken til kreftdød i vestlige land, og til tross for betydelige fremskritt i sin ledelse, total overlevelse for avansert og metastatisk sykdom har endret seg lite i løpet av de siste 20 årene, med fem år på nesten 90% for tidlig og 15% for sen tumorer [4]. Som en konsekvens av dette, er det et stort behov for nye biomarkører for å forbedre gjenkjenning og klinisk behandling av CRC. Ved hjelp av høy tetthet oligonukleotid mikromatriser vi undersøkt sekvensielle effektene av vev håndtering i prøver hentet fra 15 CRC og i deres matchet normalt vev samlet på vårt Institution og venstre ved romtemperatur ved ulike tidspunkt etter operasjonen. Studiens primære utfallet var å evaluere effekten av tiden på kreftprøver og eventuelt velge spesifikke gener hvis uttrykk er tidsrelaterte, som kan brukes som detektorer vev degradering. I tillegg til å identifisere gener som påvirkes av tid uavhengig av prøvetype (normal eller svulst), vi har også undersøkt tidseffekten i normalt vev og i forhold differensial uttrykk mellom de to vevstyper står for tiden.
Våre resultater viser at effekten av vev behandlingstiden på hele genekspresjon profil kan anses som mindre i tykktarm og at en rimelig terskel for å samle inn prøver kan være 60 minutter etter operasjonen, når ingen genet endringer ble observert. Slike prøver kan brukes til å generere reproduserbare microarray profiler for å hjelpe behandling beslutnings utnytte clinicogenomic modeller.
Materialer og metoder
1 Etikk erklæringen
Alle pasienter med biologiske prøver ble tatt i studien undertegnet et informert samtykke, godkjent av den uavhengige etiske komiteen av INT-MI, for å donere til INT-MI left vevsprøver etter endt diagnostiske prosedyrer for forskningsformål. The Independent Etisk komité INT-MI godkjent bruk av prøvene for denne spesifikke studien innenfor rammen av et prosjekt i biobanker kvalitetskontroll.
2 Studiedesign og prøvehåndtering
tumor og de vanlige motpart prøvene anvendt i forsøkene ble prospektivt samlet fra 15 pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved INT-MI og med tumorer som var representative for de forskjellige patologiske stadier av denne tumortype. Ved histologisk rutinemessig undersøkelse alle kreftprøver ble klassifisert moderat differensiert colonic adenokarsinomer NOS (klasse G2 ifølge American Joint Committee on Cancer 2010 https://www.cancerstaging.org/). De klinisk-patologiske og histologiske detaljer er angitt i tabell 1. Seks fragmenter fra hver prøve ble erholdt og ble tilfeldig stå ved romtemperatur ved forskjellige tidspunkter som følger: tre fragmenter ved 20 min. (T0), et fragment på 60 min. (T1), et fragment på 180 min. (T2) og et fragment på 360 min. (T3). Tiden ble målt fra pasientens kirurgisk fjerning og den første endepunktet analysert (T0) ble behandlet og frosset innen 20 min. fra kirurgi. Prøvene ble fraktet fra teater til patologi ved romtemperatur uten is. Det totale antallet analyserte fragmenter var 180 (90 normale prøver og 90 tumorprøver). Neoplastiske prøver ble innhentet fra det sentrale området av neoplasi, unngå å velge nekrotiske materielle eller overgangssoner med sunn slimhinner. Prøver av tarmslimhinnen ble friske resekterte minst 20 cm langt fra neoplasi og fjernt fra den kirurgiske reseksjonskanten. Kontrollen ble costituited utelukkende ved normal slimhinne, strippet fra den luminale flaten.
3 RNA Extraction and Evaluation
Vevsprøver ble lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Total RNA ble ekstrahert 10-20 mg tumorprøver og 30-40 mg av normale prøver. Vev ble mekanisk forstyrret og samtidig homogenisert i nærvær av QIAzol Lysis reagens (Qiagen, Valencia, CA, USA), ved hjelp av en Mikrodismembrator (Braun Biotech International, Melsungen, Tyskland). RNA ble ekstrahert ved hjelp av miRNeasy Mini kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. Rensing og DNase fordøyelsen ble utført ved hjelp av to forskjellige kits: RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) ble ansatt for opp til 45
μ
g av RNA mens RNeasy Mini kit (Qiagen) ble brukt for RNA som varierer mellom 45 og 100
μ
g. RNA-konsentrasjoner ble målt med Nanodrop ND-100 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) mens RNA kvalitet ble vurdert med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ved hjelp av RNA 6000 Nano kit (Agilent Technologies). RNA Integrity Number (RIN) [5] ble bestemt ved hjelp av programvaren som leveres av produsenten.
4 Gene Expression Profilering
RNA prøver ble behandlet for microarray hybridisering av Funksjonell genomkjernefasiliteten på INT-MI. I korthet ble 800 ng av total RNA ble revers transkribert, merket med biotin og forsterkes over natten (14 timer) ved anvendelse av Illumina RNA TotalPrep Amplification Kit (Ambion, Austin, Texas, USA) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Ett pg av den biotinylerte cRNA prøven ble blandet med den Hyb E1 hybridizatioin buffer inneholdende 37,5% (vekt /vekt) formamid, og deretter hybridisert til Sentrix Bead Chip HumanHT12_v3 (Illumina, Inc., San Diego, CA) ved 58 ° C over natten (18 timer). Matrisen representerer mer enn 48 000 perle typer, hver med en unik sekvens som stammer fra menneskelige gener i Nasjonalt senter for Bioteknologi Information Reference Sequence og UniGene database. Array chips ble vasket med produsentens E1BC løsning, farget med en ug /ml Cy3-streptavidin (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Og til slutt skannet med Illumina BeadArray Reader
5 Real Time PCR
Taqman® gen-analyser ble brukt til validering av ABL1 (Hs00245443), FOSB (Hs01547109), juni (Hs00277190) gener i tumorprøver og HIST1H1D (Hs00271187), HIST1H1E (Hs00271195), HIST1H4E (Hs003743461), HIST4H4 (Hs00545522) i både Tumor og normale prøver. Alle genene ble normalisert til 18S (HS03003631), mens de tre tumorassosierte gener ble også normalisert til ACTB (HS03023942) og GAPDH (Hs00266705). Kort fortalt cDNA ble syntetisert i to eksemplarer for validering av ABL1, FOSB og juni, og i en enkelt reaksjon for validering av histpngenene fra 500 ng av total RNA ved hjelp av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA ) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-Time qPCR ble utført ved hjelp av FAST kjemi (Applied Biosystems) med genet spesifikke analyser i ABI PRISM 7900 HT Real-Time PCR system (Applied Biosystems) med 10 ng av cDNA.
6 Data Analysis
6.1 Microrarray data pre-prosessering.
Rådata ble hentet fra skannede bilder ved hjelp av Illumina BeadStudio programvaren (versjon 3.3.8) og pre-prosessert ved hjelp av lumi pakken [6] av Bioconductor prosjekt [7]. Signalet mener, oppklaringsprosenten og mellom rekkeavstander ble evaluert i kvalitetskontroll trinn. To av de 90 profiler fra tumorprøver og to fra 90-profilene fra normale prøver ikke bestod kvalitetskontroller og ble forkastet i senere analyse. Data ble normalisert ved hjelp av Robust Spline Normalisering fremgangsmåte og prober med en deteksjons p-verdi 0,01 på mindre enn 10% av prøvene ble filtrert ut. Alle microarray data er MIAME kompatibel og rådata ble satt inn på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nmlm.nih.gov/projects/geo/) med tiltredelse antall GSE37182.The sammenheng mellom baseline genet profiler og klinikk-patologiske trekk ble analysert ved enveis ANOVA.
6.2 Tid løpet analyser.
for å identifisere sonder i tumorprøver forskjellig uttrykt på tvers av de fire forskjellige tidspunkter (
tidsforløp uttrykk analyse
) en blandet effekt-modell ble implementert på microarray data ved å vurdere faktor
tid plakater (T0, T1, T2, T3) som fast og den faktoren
pasient
som tilfeldig [8]. Modellen ble gjennomført ved å vurdere som avhengige variabler log (base 2) uttrykk verdien av hver probe. De p-verdier i modellen ble justert med Bonferroni metoden [9]. For valideringsstudien den samme tilnærmingen ble brukt ved å vurdere som avhengige variabler de -ΔCt verdier hentet fra qPCR utført på gener av interesse. Statistisk analyse ble utført implementere en spesifikk kode utviklet i SAS ® programvare v. 9.2 (SAS Institute Inc. Cary, NC). Superimposable resultater ble fremstilt ved hjelp av programmeringsspråket R v. 2.12.0 [10], så vel som ved hjelp av fritt distribuert og åpen EDGE programvarepakke [11]. En identisk statistisk prosedyre ble deretter påført i bearbeiding av data fra normalt vev. RIN verdier som tilsvarer både normale og tumorprøver ble analysert ved å følge samme tilnærmingen som brukes for microarray data ved vurderer også faktor
Skriv plakater (normal eller svulst) som fast (
tidsforløp RIN analyse
) .
6,3 Gene sett analyse
Gene satt funksjonell analyse ved hjelp av Gene ontologi (2010) [12].; [13] databaser ble utført ved hjelp av Bioconductor pakker GOstats [14] og kategori (v 2.16.0.) Med standard parametere (over-representasjon med p-verdi 0,01) (v 2.16.0.).
Resultater
1 RIN Analyse
RNA Integrity Number (RIN) av alle prøvene i løpet av alle tidspunkter hadde en medianverdi på 5,8 med en inter-kvantil spekter av 1.95. Tumorprøver hadde i gjennomsnitt en høyere RIN verdi enn de vanlige prøvene (median på henholdsvis 6,4 og 5,35), spesielt ved det første tidspunktet T0. Lignende distribusjoner av RIN verdier kan sees på tvers av de ulike tidspunkter og betydelig variasjon ble observert for hver prøve i løpet av det første tidspunktet T0 (RIN varians median = 1,668, IQR = 2,084) som var mer uttalt hos de normale prøver. Tidsforløpet RIN analyse viste at RIN verdiene hadde en tendens til å avta over tid (samlet p-verdi for Time = 0,0565 og for enkelt kontraster i forhold til T0, T1 = 0,0214, T2 = 0,1705 og T3 = 0,0529). Fordelingen av RIN-verdier signifikant forskjellig (p-verdi = 0,0008) i tumorprøver med hensyn til de normale (Fig. 1).
RIN fordelingene på hvert tidspunkt for både tumor (A) og normale ( B) prøver. En høyere RIN indikerer en høyere RNA kvalitet.
Ved å vurdere alle de fire tidspunkter vi identifisert en undergruppe av 6 normal og 7 svulst tilfeller RIN verdier som var stadig høyere enn fem og tidsforløp uttrykk analysen ble utført også for denne undergruppe av prøver. Det bør understrekes at ingen sammenheng ble observert mellom genet profiler på kreftprøver ved T0 og scene (p-verdi = 0,59) eller plassering (p-verdi = 0,95) av sykdommen.
2 Tid Course Expression Analysis
Etter kvalitetskontroll av microarray data, uttrykket profiler av 4 prøver (2 profiler fra svulst og 2 fra normale prøver) ble fjernet. Disse utliggere tilhørte forskjellige tidspunkter av to pasienter i tilfellet av normale prøver og for den samme pasient for tumorprøver. På grunn av beskaffenheten av studiedesign var det avgjørende å ha for hver pasient en full bilder på tvers av alle tidspunkter og dermed alle profiler knyttet til disse pasientene ikke tar hensyn til i tidsforløpet analyse. Som en følge av dette ble et totalt 13 pasienter som brukes i normal datasettet som inneholdt 17895 prober og 14 i den Tumordatasettet inneholder 18007 prober. Begge datasett delt 16698 vanlige sonder
Sondene identifisert av strenge Bonferronikorreksjon. (P-verdi 0,05) metoden i
Tid
faktor eller i det minste en av tids kontraster ( T0 baseline) i Normal og Tumor datasett er oppført i tabell 2 (N = 32) og tabell 3 (N = 31) henholdsvis. I disse tabellene, har radene er bestilt i henhold til de rå p-verdiene som følger av
Tid
faktor og en stjerne (*) under kolonnene «Time», «T1 «,» T2 «, eller» T3 «indikerer fra hvilken kontrast proben ble valgt. Heatmaps i panel A og B i figur S1 representerer grafisk retning av uttrykket endring på hvert tidspunkt i svulsten og Normal datasett, henholdsvis.
Bilder
Fem prober (gener) som viser forskjellig uttrykks tvers av de fire tidspunkter ble identifisert både i normal og svulsten datasett (
HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E, HIST4H4 og 5.960.086).
flertallet av variasjonen hos stammer fra siste tidspunkt T3 på 360 minutter når man sammenligner med referanse T0. Dette gjelder spesielt i Tumor datasettet mens noen sonder som følger av T2 kontrast dukke opp i Normal datasett. Alle genene identifisert i Tumordatasettet er konsistent oppregulert over tid; det samme gjelder for Normal datasett med noen få unntak. I det hele tatt men de fleste gener ikke viser drastiske endringer i nivåene av uttrykk. Funksjonell annotering av genene fra de to listene (med både Gene ontologi og KEGG trasé databaser) fremhevet at 22 av de 32 genene modulert i normalt vev var histoner, involvert i nucleasome organisasjon og kromatin montering. Fire av dem var også tidsavhengig i tumorprøver, sammen med andre 27 gener med ulike funksjoner som er involvert i kreft, inkludert onkogener, for eksempel
juni
,
FOSB
,
ABL1 Hotell og
EGR1
. Et annet gen vanligvis modulert i Normal og tumorvev var
RNU11
, en liten kjernefysiske RNA.
En identisk analyse ble utført ved hjelp av undergruppe av prøver med en RIN høyere enn fem som identifiserte bare 6 sonder i Normal datasettet og 6 i tumor datasettet, datasett trolig på grunn av den reduserte størrelsen på utvalget. Ingen felles prober ble funnet i de to listene. Fem av 6 prober (
HIST1H1E
,
HIST1H4B
,
HIST1H4E
,
HIST4H4
,
5960086
) i Normal datasettet var også til stede i analysen ved hjelp av alle prøver og 2 (
HSPA1A
,
IER5
) var i vanlig i Tumor datasett.
3 RT-PCR Validering
de tre gener
som var betydelig
for «Time», «T2» og «T3» kontraster
i svulsten prøvene (juni
,
FOSB Hotell og
ABL1)
ble valgt for teknisk validering med real Time PCR (RT-PCR) analyser i samme tumorvev som tilhører de 14 ulike pasienter analysert ved mikromatriser. To av dem (
juni og FOSB)
bekreftet resultatene fra arrays. Figur 2 rapporterer ekspresjon dynamiske over tid av den gener, normalisert til 18S. Normalisering bruker GAPDH og ACTB housekeeping gener bekreftet disse resultatene (data ikke vist). ABL1 ble ikke validert som iskemi forbundet genet sannsynligvis på grunn av svak grad av sammenheng mellom microarray og RT-PCR data. Dette kan delvis forklares ved den begrensede ekspresjon variasjon av dette gen i våre prøver, sammenlignet med juni og FOSB (fig. S2). Fire gener som vanligvis modulert i normal og svulstvev, ble også analysert (HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E og HIST4H4); bare én av dem, HIST1H4E, bekreftet microarray data.
RT-PCR verdier av FOSB, juni og ABL1 (-ΔCt) normalisert til huset-holder genet 18S.
diskusjon
Vi studerte effekten av vev behandlingstid på global genekspresjon ved hjelp av CRC eksemplarer sub-samplet og snap-frosset ved ulike tidspunkt etter operasjonen, etter rutine vev håndteringsprotokoller av en patologi Unit. RNA kvalitet vurderes av RNA Integrity Number (RIN) viste en svak trend med reduksjon forbundet til annen med tumorprøver stiller høyere og mindre variabel RIN verdier ved T0 i forhold til de normale prøver. Tilstedeværelsen av nedbrytning ved T0 kan indikere variabiliteten av prosedyren eller en spesifikk følsomhet av RNA fra tykktarm vev. Resultater oppnådd for tumorprøver er i overensstemmelse med hva funnet av Bray et al. [15]. Alle prøvene ble brukt for microarray analyse uavhengig av RIN nummer for å forstå hvis microarray plattform kunne markere bedre fullmakter til kvalitet for vev håndtering. Fordelingen av spille intensiteter per array var svært lik på tvers av de 180 arrays analysert, noe som tyder på at alle RNA utføres på samme nivå, og at hybridiseringer ble gjort på samme måte; bare fire prøvene ikke passere kvalitetskontroller.
For å vurdere variasjon av genuttrykk målinger som en funksjon av tiden, ble hver funksjon (probe) modellert hensyn til den tiden kategorier, og justert for pasient faktor. Dette ble gjort separat i både tumor- og normale datasett. Ved hjelp av en Bonferroni korreksjon av P 0,05, trettien prober ble identifisert som tidsavhengig i vevsprøver og trettito i normale prøver. Mange av genene som er identifisert i svulsten datasettet var DNA-bindende proteiner som er involvert i ulike prosesser: noen samsvarer med gener som er involvert i kreft, for eksempel
ABL1
,
juni
,
FOSB
,
NFKB1A Hotell og
CCL5
; fire sonder tilhørte histoner (
HIST1H1E
,
HIST1H4E
,
HIST1H1D Hotell og
HIST4H4
), andre var transkripsjonsfaktorer (
DDIT3
) eller gener som er involvert i transkripsjon slik som
EGR1 Hotell og
PPP1R15A
. Seks gener var involvert i apoptose, en av prosessene som induseres av vev reseksjon. De fleste av de genene som er identifisert (N = 22) var betydelig i Time sammenligning som involverer alle tidspunkter, 16 ble identifisert i T3 versus T0 kontrast og kun tre gener (
ABL1
,
juni
og
FOS
) på begge tidspunkter T2 og T3. Ni gener endret bare på T3. På den annen side er mange av de gener som er identifisert i de normale prøver (N = 21) samsvarer med gener som koder for histon proteiner, og tre var små nukleære RNA (
RNU2-1
,
RNU11
og
RNU12
). Trettito gener endret seg over alle de fire tidspunkter analysert; 17 av dem var signifikant forskjellig ved tidspunkt T3 og 8 ved begge tidspunkter T2 og T3. To gener endret bare på T3. Ved å utføre den samme analyse bare ved hjelp av prøver med en RIN over fem svært få gener ble identifisert (6 prober i begge datasett), hvorav hovedsakelig histoner var i likhet med de tidligere identifiserte gener. Resultatene fra disse to fremgangsmåter viser at de observerte endringene over tid er ganske ubetydelig. Faktisk, når vi sammenlignet vevstyper mellom både normale og tumor datasett et meget stort antall av forskjeller ble observert, som forventet, uavhengig av kvaliteten på RIN. Videre, funksjonell analyse av disse prober ved hjelp av Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) veien fra databasen viste at disse forskjellene matchet med elleve betydelige trasé som er involvert i kreftutvikling, inkludert cellesyklus, DNA-replikasjon og p53-signalveien (data ikke vist).
endringene observert i genene for både normale og tumorvev hovedsakelig fant sted ved T3, selv om noen gener som allerede er endret ved T2, noe som tyder på at et kritisk tidspunkt legger 60 minutter ved romtemperatur. Interessant, de tre gener som viste forandringer allerede ved T2 i tumorprøver ble alle onkogener, som foreslår å nøye vurdere endringer av disse genene ved håndtering av tumorprøver og å anvende en mer konservativ tidsgrensen (dvs. 60 minutter) for prøvetaking. Uttrykket nivåer over tid av de fleste av de gener ble øket. Den påviste er i overensstemmelse med hva funnet av Dumur et al. [16] på eggstokk kreft tilfeller og ved Bray et al. [15], i CRC, hvor antallet prober med øket ekspresjon forsterket med tiden. Som omtalt av forfatterne av de to studiene, er dette motsatt til hva forventet siden behandlingstid bør favorisere degradering av RNA-transkripter og kan i hvert fall delvis reflekterer en aktiv modulering av genekspresjon. Sammenligning mellom GO klassifisering av forskjellig uttrykt gener i våre (FDR justerte p-verdier og 0,05) og Bray analyser viste noen vanlige beriket vilkår ( «protein dimerization aktivitet «og» transkripsjonsfaktor aktivitet «). Mulige forklaringer på disse resultatene kan være ulike tidspunkter evaluert (opptil 360 minutter i vår studie og opptil 120 minutter i Bray studie), ulike prosedyrer følges for prøvetaking (kirurgiske prøver som fulgte rutinen behandlingen standard vs tumor biopsier) og ulike microarray plattformer som brukes til uttrykk analyser (Illumina vs Affymetrix).
To av de tre gener som er valgt for validering
i tumorvev product: (
Jun og FOSB) bekreftet matrise resultater
. Disse genene var også blant de mRNA mest betydelig påvirket av tid til å fryse i en brystkreft studie [17]. Som rapportert av disse forfatterne, er juni og FOSB spenning indusert umiddelbart tidlige transkripsjonsfaktorer som er komponenter av AP-1-dimerer, og disse dimerer har blitt funnet endret av ischemi i forskjellige vev, inkludert prostata og tykktarmskreft. I iskemiske og riperfused celler de to genene indusere spredning og apoptose, og kan være nært knyttet til attemps for degradering eller regenerering av injuried vev [18]. Fem prober ble delt mellom normale og vevsprøver. De identifiserte gener fra histone familien (
HIST1H1D
,
HIST1H1E
,
HIST1H4E Hotell og
HIST4H4
) involvert i DNA organisasjon, og en liten kjernefysiske RNA (
RNU11
). Bare én av disse genene (
HIST1H4E
) validert microarray data. Den høye sekvenslikhet av histoner kan forklare det høye antallet av modulerte histoner identifisert, som kan skyldes delvis aspecific hybridisering og kan være årsaken til den manglende validering med en uavhengig teknikk.
I denne artikkelen vi har beskrevet for første gang effekten over tid på å håndtere opp til 6 timer med normal kolorektal vev, som er hyppig brukt som kontroll i genomet brede analyser. Interessant, normalt vev viste mindre degradering enn sine tilsvarende kreftprøve, både i form av RNA kvalitet (RIN verdi) og av modulerte gener som var hovedsakelig histoner. Våre resultater favorisere oppbevaring av normalt vev, i tillegg til tumor.
De generelle endringer i genuttrykk sett i prøvene analysert i denne studien, der mer enn 16.000 prober ble undersøkt, synes ikke å korrelere med en global transkriptomet hendelse som man kunne forvente, i hvert fall i løpet av tidsrammen analysert i denne studien ( 20 minutter, 60 minutter, 180 minutter og 360 minutter). Tatt i betraktning den meget lave antall av angrepne gener funnet, virkningen av vev håndteringstiden på den totale genekspresjon profilering, i det minste i CRC, kan anses som mindre og ville ikke bli forventet å spille en viktig rolle i genekspresjon baserte tumor lagdeling.
Våre resultater er enig med at av Dumor et al. [16] og av Micke et al. [19] som viste ingen relevante endringer i eggstokk kreft og med hva Hatzis et al. funnet i brystkreft [20]. Andre studier har vist betydelige endringer i RNA etter 30 minutter av vev extirpation [15]; [21]; [22]. Siden vår design ikke inkluderer tidlige tider, kan vi ikke utelukke at relevante endringer har allerede skjedd før vår første tidspunktet (20 minutter). Men de nevnte studiene har vanligvis svært lave utvalgsstørrelser og vil trenge ytterligere bekreftelse.
Betydelig endring av genuttrykk profil ble observert i vår tidligere studie på brystkreft prøver der vev behandlingstid forandret uttrykket av gener som inngår i de vanligste brystkreft prediktive genetiske signaturer [23]. Disse dataene var i samsvar med Borgan et al. [17], som fant miRNA (mikroRNA) og mRNA uttrykk forandrede i brystkreft med iskemi tid opptil seks timer. Faktisk Hatzis og kolleger [20] i brystkreft viste ingen relevante endringer i uttrykk nivåer av enkeltgener og multigen signaturer, sannsynligvis fordi de regnet 40 minutter som lengste tidspunkt ved romtemperatur eller opp til 180 minutter, men ved hjelp av RNA-senere bevare RNA integritet.
tross delvis uenighet om sin utstrekning, kan tidspunktet for vev håndtering ha en effekt på genekspresjon, og sannsynligvis kan variere med vev og med tumortypen, inkludert de som kan oppvise større følsomhet overfor hypoksi effekter , for eksempel hjernesvulster [24].
Konklusjoner
funnene at fire av de få gener vesentlig forskjellig blant de tidspunkter analysert i svulsten prøvene var onkogener, hint om at analyse av deres uttrykk i vevsprøver kan føre til misvisende resultater. Selv om vevet håndteringstiden har en svak innvirkning på den totale genekspresjon profilering, dereguleringen av gener som er direkte involvert i tumorprosesser innebærer at vev skal lagres på tidlige tidspunkter etter kirurgi (i vårt sammenheng ikke mer enn en time), og sterkt støtte dens introduksjon som retningslinje for vev repositories.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression endring på hvert tidspunkt i svulsten (A) og Normal (B) datasett
doi: 10,1371 /journal.pone.0053406.s001 plakater (PPTX)
Figur S2.
Scatter plott av RT-PCR ΔCt verdier (x-aksen) versus log2 microarray intensitetsverdier (y-akser) for ABL1 jr og FOSB gener. I hver graf Pearsons korrelasjonskoeffisient (R) ble brukt for å måle styrken av foreningen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053406.s002 plakater (PPTX)
