Abstract
EPH reseptortyrosinkinaser mekle juxtacrine signaler ved å samhandle «i
trans
» med ligander forankret til overflaten av nabocellene via et GPI-ankeret (Efrin-As) eller et transmembransegment (Efrin-B), noe som fører til reseptor-gruppering og øket kinase-aktivitet. I tillegg kan vannløselige former av Efrin-A-ligander som frigjøres fra celleoverflaten ved matriks-metallproteaser også aktivere EphA reseptorsignalisering. Foruten disse
trans
interaksjoner, nyere studier har avdekket at Ef reseptorer og ephrins kouttrykte i nevroner kan også engasjere seg i lateral «
cis
» foreninger som demper reseptor aktivering av ephrins i
trans
med kritiske funksjonelle konsekvenser. Til tross for viktigheten av Ef /Efrin system i tumorigenesis, Ef reseptor-Efrin
cis
interaksjoner er ikke tidligere undersøkt i kreftceller. Her viser vi at i kreftceller, kan koekspresjon Efrin-A3 hemme evnen til EphA2 og EphA3 å binde ephrins i
trans
og blir aktivert, mens Efrin-B2 kan hemme ikke bare EphB4 men også EphA3.
cis
hemming av EphA3 av Efrin-B2 innebærer at det i enkelte tilfeller ephrins som ikke kan aktivere en bestemt Ef reseptor i
trans
kan likevel hemme av signalanlegget evne gjennom
cis
assosiasjon. Vi fant også at en EphA3 mutasjon identifisert i lungekreft forbedrer
cis
interaksjon med Efrin-A3. Disse resultatene tyder på en ny mekanisme som kan bidra til patogenesen kreft ved å dempe tumoren å undertrykke virkningene av Eph-reseptor signalveier som aktiveres av ephrins i
trans
.
Citation: Falivelli G, Lisabeth EM, de la Torre ER, Perez-Tenorio G, Tosato G, Salvucci O et al. (2013) Demping av Ef Receptor kinase aktivering i kreftceller ved kouttrykte Efrin ligander. PLoS ONE 8 (11): e81445. doi: 10,1371 /journal.pone.0081445
Redaktør: Renping Zhou, Rutgers University, USA
mottatt: 7 august 2013; Godkjent: 21 oktober 2013; Publisert: 29.11.2013
Copyright: © 2013 Falivelli et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir P01CA138390 og P01HD025938, gi 18XT-0099 fra Tobakks Related Disease Research Program (EBP), et postdoktorstipend fra den spanske Foundation for Science and Technology (FECYT, ERT), National Institutes of Health postdoktor trening stipend T32CA121949 og postdoktorstipend 20FT-0076 fra Tobakks Related Disease Research Program (EML), og postdoktorstipend Dnr 2009-7360 fra Vetenskapsrådet (GP). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
medlemmer av store Ef-reseptor-tyrosin-kinase-familien, og spesielt EphA2 og EphB4, blir overuttrykt i et bredt spekter av tumortyper [1,2]. Ef reseptorer signal ved å samhandle «i
trans
» med ephrins uttrykt på nabocellene, som fremmer receptor clustering, autofosforyleringsaktivitet og kinase aktivitet [3]. Oppløselige former av Efrin-A-ligander som frigjøres fra celleoverflaten ved matriks-metallproteaser kan også aktivere EphA reseptorer [4-7]. Imidlertid Ef reseptorer i kreftceller er ofte dårlig tyrosin-fosforylert [3]. Dette tyder på lav aktivering ved Efrin ligander og er i overensstemmelse med det tumor-undertrykkende virkninger som er rapportert for et antall av Ef reseptor nedstrøms signalveier [1,8,9].
Mangelen på betydelig Ef reseptor aktivering er i noen tilfeller på grunn av lav uttrykk for Efrin ligander i kreftceller med høy reseptor uttrykk [1,10-13]. I tillegg kan en rekke andre mekanismer holde Ef reseptoraktivering lav i cancerceller som også uttrykker Efrin ligander. For eksempel har kreft mutasjoner blitt vist å forstyrre Efrin bindingsevnen eller kinaseaktiviteten Ef-reseptorer [14,15]. Videre kan mangel på E-cadherin-avhengige celle-celle adhesjon svekke EphA2 reseptor aktivering i brystkreftceller, noe som tyder på ineffektiv EphA2
trans
samspill med ephrins [16]. En annen mulig mekanisme for å dempe Ef reseptor nedstrøms signalisering i kreftceller kan innebære hemmende lateral
cis
interaksjoner mellom Ef reseptorer og ephrins kouttrykte i de samme cellene [2,17,18]. Hemmende
cis
interaksjoner med ephrins har vist seg å spille en viktig rolle i finjustering Ef reseptor aktivering i nervesystemet til nøyaktig kontroll axon pathfinding og synaptic funksjon [1,18-21]. Men
cis
interaksjoner ikke forekommer i alle nevroner coexpressing Ef reseptorer og ephrins fordi i noen nevroner reseptorer og ligander okkupere forskjellige mikroområder av plasmamembranen og kan derfor ikke blander [20,22]. Enten
cis
interaksjoner mellom Ef reseptorer og ephrins kan også oppstå i kreftceller er ikke tidligere undersøkt.
biokjemiske og strukturelle studier har vist at
cis
samspill innebærer en Ef reseptor-Efrin bindende grensesnitt forskjellig fra formidling av høy affinitet samhandling i
trans product: [18,23]. Det ekstracellulære område av både EphA og EphB reseptor-klassene inneholder en N-terminale ligandbindende domene, et cysteinrike område og to fibronektin type III domener [3]. Den andre fibronektin domene er etterfulgt av et transmembransegment og et cytoplasmisk region som inneholder tyrosinkinase-domene, en SAM domene og et PDZ-bindende motiv. De ephrins består av en N-terminal Ef reseptor-bindende domene forbundet ved hjelp av en kort linkerområde til et glykosylfosfatidylinositol (GPI) anker for den Efrin-As og et transmembran-segment etterfulgt av en kort cytoplasmisk region for Efrin-B. Ef-reseptor-binding i Efrin
trans
innebærer i hovedsak interaksjonen mellom G-H løkke av Efrin og en lomme i den ligand-bindende domene av det Ef-reseptoren [24]. Disse grensesnittene overveiende støtter promiskuøse interaksjoner av Ef reseptorer med ephrins tilhører samme A eller B klasse. På den annen side,
cis
interaksjoner er blitt foreslått å innbefatte fibronektin type III domener av Eph-reseptoren og en region av reseptoren-bindende domene av det Efrin som er forskjellig fra det GH sløyfen [18,23 ].
Her viser vi at Ef reseptorer og ephrins kouttrykte i kreftceller kan engasjere seg i
cis
interaksjoner som hemmer Ef reseptor aktivering av ephrins i
trans
. Interessant nok har vi oppdaget at inhibering av EphA3 aktivering
cis
interaksjon med ikke bare Efrin-A3 men også Efrin-B2, som ikke er en aktiverende ligand for EphA3 [25], som tyder på at
cis
interaksjoner ikke viser det samme reseptor-ligand selektivitet som
trans
interaksjoner. Vi fant også at en lungekreft mutasjon identifisert i andre fibronectin type III gjentakelse av EphA3 forbedrer
cis
sammenslutning av reseptoren med Efrin-A3.
Resultater
Efrin-A3 koekspresjon i kreftceller demper EphA reseptor aktivering i trans av løselig Efrin-A3
For å undersøke effekten av Efrin koekspresjon på Ef reseptor signalisering i kreft celler, undersøkte vi EphA3 (en Ef reseptor som hemmende
cis
interaksjoner med Efrin-As har blitt grundig studert i nevroner [17,18,20]) og EphA2 (den EphA reseptoren mest uttrykt i kreftceller [1,26-28] men som effekten av
cis
interaksjoner ble ikke tidligere undersøkt). Vi infisert NCI-H226 og A549 lunge kreft cellelinjer med lentiviruses koding EphA3 og ZsGreen fra en bicistronisk avskrift eller bare ZsGreen som en kontroll. Etter seleksjon med FACS sortering, vi videre infisert cellene med lentiviruser som koder for Efrin-A3 merket med mCherry eller bare mCherry som en kontroll, fulgt av seleksjon. De to lentivirally infiserte cancercellelinjer, som ikke uttrykker detekterbar endogene EphA3 eller Efrin-A3 (figur 1), ble deretter behandlet med Efrin-A3-Fc (et oppløselig form av Efrin-A3 ligand fusjonert til Fc-delen av humant IgG
1) for å aktivere EphA3 gjennom Efrin bindende i
trans
. Efrin-A3 Fc-reseptor øket tyrosinfosforylering i cellene coexpressing EphA3 med kontroll mCherry, som forventet, men ikke i cellene coexpressing EphA3 med mCherry-Efrin-A3 (figur 1A, B). Efrin-A3 koekspresjon også dempes Efrin-A3 Fc-indusert aktivering av endogene EphA2 i A549 celler (figur 1C). Derfor, i lungekreftceller, koekspresjon Efrin-A3 kan hemme EphA2 og EphA3 aktivering av Efrin ligander.
(A, B) NCI-H226 og A549 lungekreftceller ble infisert med en lentivirus koding EphA3 og ZsGreen alene eller sammen med et lentivirus koding mCherry-Efrin-A3; kontrollceller ble infisert med lentiviruses koding ZsGreen og mCherry. EphA3 immunutfelninger ble analysert ved immunoblotting for fosfotyrosin (Ptyr) og reprobed for EphA3. Lysates ble analysert for mCherry-Efrin-A3 med et anti-DsRed antistoff som også gjenkjenner mCherry, for EphA3, og for β-tubulin som lasting kontroll. Histogrammene viser normaliserte middel ± SE kvantifiseres fra 3 immunoblot i både A og B. I en av de A549 forsøkene anvendt for kvantifisering ble cellene stimulert med Efrin-A5 Fc. ** P 0,01 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-A3 Fc-behandlede celler som uttrykker både EphA3 og Efrin-A3 med Efrin-A3 Fc-behandlede celler som uttrykker bare EphA3. Av notatet, EphA3 nivåene var høyere hos A549-celler ko-uttrykker Efrin-A3 /Efrin-B2 (se også fig. 2A, 3B, 4A og 5C, D), noe som tyder på at denne reseptor kan stabiliseres ved kouttrykte ephrins. (C) A549-celler ble infisert med en lentivirus koding mCherry-Efrin-A3 eller mCherry som en kontroll. Immunopresipitert endogene EphA2 ble undersøkt ved immunblot for fosfotyrosin (Ptyr) og reprobed for EphA2. Lysates ble undersøkt med et anti-DsRed antistoff og β-tubulin som lasting kontroll. Histogrammet viser normaliserte midler ± SE kvantifiseres fra 3 immunoblotter. ** P. 0,01 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-A3 Fc-behandlede celler uttrykker eller ikke uttrykke Efrin-A3
Koekspresjon med Efrin-A3 i kreftceller svekker evnen til EphA3 å binde Efrin-As i trans
for å undersøke om i kreftceller Efrin-A3 koekspresjon svekker evnen til EphA3 å binde Efrin-A ligander i
trans
, målte vi binding av løselig former Efrin-A5 eller Efrin-A3 kondensert til alkalisk fosfatase (AP) til NCI-H226 og A549-celler som uttrykker EphA3 alene eller sammen med mCherry-Efrin-A3. Vi oppdaget Efrin-A AP binding til cellene bare uttrykker EphA3 men ikke til celler coexpressing Efrin-A3 med EphA3 (figur 2A). Immunoblotting bekreftet at Efrin-A3 koekspresjon ikke reduseres samlede EphA3 nivåer (Figur 2A). Biotinylering av celleoverflateproteiner, etterfulgt av en ELISA i hvilken EphA3 ble innfanget med et antistoff og dets nivå av biotinylering ble påvist med streptavidin konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) viste at Efrin-A3 koekspresjon ikke påvirker brøkdel av EphA3 til stede på celle overflate (figur 2B). Dermed koekspresjon Efrin-A3 i lungekreftceller hemmer Efrin binding til EphA3 i
trans
uten å redusere EphA3 uttrykk eller overflate lokalisering.
(A) NCI-H226 og A549 lungekreft celler ble infisert med et lentivirus koding EphA3 og ZsGreen alene eller sammen med en lentivirus koding mCherry-Efrin-A3; kontrollceller ble infisert med lentiviruses koding ZsGreen og mCherry. Histogrammene viser binding av Efrin-A5 AP til NCI-H226 celler og Efrin-A3 AP til A549 celler, avslørende at Efrin-A3 koekspresjon hindrer bindingen av Efrin AP proteiner til EphA3. Normaliserte midler fra 2 forsøk (hver med triplikatprøvene) ± SE vises. ** P 0,01 ved en-veis ANOVA og Dunnetfs post hoc-test for sammenligning med celler som uttrykker bare EphA3. De immunoblotter viser uttrykk for EphA3, Efrin-A3, og β-tubulin som lasting kontroll i cellelysatene, verifisere at Efrin-A3 koekspresjon ikke reduserte EphA3 nivåer. Faktisk EphA3 synes nivåene høyere i A549 celler samtidig uttrykte Efrin-A3. Den hvite området indikerer fjerning av en irrelevant kjørefelt. (B) Celleoverflate biotinylering, etterfulgt av en ELISA hvor EphA3 ble tatt med et immobilisert antistoff og dets biotinylering påvist med streptavidin-HRP viser et tilsvarende brøkdel av EphA3 på overflaten av celler som uttrykker EphA3 alene eller sammen med Efrin-A3. Histogrammet viser midler fra 2 forsøk (hver med triplikatprøvene) ± SE. Inkubering med dobbelt så mye lysater ga lignende resultater, noe som indikerer at maksimal EphA3 binding til antistoffet immobilisert på brønnene ble oppnådd. ** P 0,01 ved en-veis ANOVA og Tukey post-hoc-test for sammenligning med celler som uttrykker mCherry og ZsGreen; p 0,05 for sammenligningen av celler som uttrykker EphA3 med og uten Efrin-A3. (C) EphA3 Fc ble brukt for pull-downs fra kondisjonert medium og lysatene av A549 eller H226 celler infisert med de indikerte lentiviruses. Ved immunblotting med et anti-DsRed antistoff, ble Efrin-A3 detektert bare i lysatene. Rullegardin ble også undersøkt for Fc å kontrollere nivåene av EphA3 Fc. (D) overflateproteiner ble biotinylert i celler infisert med lentiviruses koder mCherry, mCherry-Efrin-A3, eller mCherry-Efrin-A3 sammen med EphA3 og ZsGreen. mCherry-Efrin-A3-immunopresipitater (med anti-DsRed-antistoff) ble probet med streptavidin-HRP, noe som viser tilsvarende celleoverflatenivå Efrin-A3 uttrykkes alene eller sammen med EphA3. IgG, kontroll immunpresipitatet med ikke-immun IgG. Lysates ble analysert for mCherry-Efrin-A3 med anti-DsRed antistoff.
En mulig forklaring på disse resultatene kan være at løselig Efrin-A3 utgitt i kulturmediet ved matriks-metallproteaser [4-6] ville konkurrere med Efrin-A3 AP for binding til EphA3 ligandbindende domene. For å løse denne muligheten, brukte vi det ekstracellulære domene av EphA3 smeltet sammen med Fc for å trekke ned Efrin-A3 fra dyrkningsmediet eller cellene lysert i et volum som er ekvivalent til den i kulturmediet. Efrin-A3 kan bli detektert ved immunblotting i rullegardin fra cellelysater, men ikke fra kulturmediet (figur 2C), som indikerer at det store flertall av de Efrin-A3 forble assosiert med cellene i løpet av 24-48 timers periode av våre eksperimenter. I tillegg ble et enkelt mCherry-Efrin-A3 bånd observert i immunoblot, noe som gjør det usannsynlig at en vesentlig del av Efrin ble spaltet for å generere en mindre gjenværende skjema assosiert med cellene ved å binde seg til en reseptor EphA. Biotinylering av celleoverflateproteiner, etterfulgt av påvisning av biotinylerte immunopresipitert Efrin-A3 med streptavidin-HRP bekreftet at Efrin-A3 er likeledes lokalisert på A549 celleoverflaten når de uttrykkes alene eller sammen med EphA3 (figur 2D).
EphA3-Efrin-A3 cis samhandling krever ikke reseptor ligand-bindende domene
Tidligere studier har vist at cis interaksjoner krever membran lokalisering av Ef reseptoren og Efrin [18]. Derfor, for å undersøke hvorvidt den EphA3 ligand-bindende domene som er nødvendig for
cis
interaksjon med Efrin-A3 eller om fibronektin type III gjentakelser er tilstrekkelig for å mediere
cis
binding [18,23] , vi transient transfektert HEK293-celler som stabilt uttrykker mCherry-Efrin-A3 med plasmider som koder for EphA3 0,05 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-A3 bundet til EphA3 0,05 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-A3 E129K versus Efrin-A3 villtype bundet til EphA3 0,001 ved en-veis ANOVA og Dunnetfs post hoc-test for sammenligning med celler som uttrykker villtype Efrin-A3. Den immunoblot viser uttrykk for Efrin-A3 og ephrinA3 E129K i baner lastet med like mengder totalt lysatene. Det skal bemerkes at Efrin-A3 overuttrykkes i HEK-celler gir to bånd, med det øvre bånd som tilsvarer størrelsen av det modne full-lengde proteinet.
For å undersøke effekten av å mutere den Efrin GH loop, undersøkte vi E129K mutasjon i Efrin-A3. Denne mutasjonen ikke hindre
cis
sammenslutning av Efrin-A3 med EphA3 0,05 av en sample t-test for sammenligning av EphA3 kontrollceller ble infisert med lentiviruses koding ZsGreen og mCherry. Histogrammet viser cellen binding av Efrin-A3 AP (ett eksperiment) og Efrin-A5 AP (2 forsøk), som bekrefter at Efrin-A3 koekspresjon hindrer bindingen av Efrin AP proteiner til EphA3 G518L mutant. Normaliserte midler fra 3 eksperimenter (hver med dobbeltprøver) ± SE vises. *** P 0,001 av enveis ANOVA og Tukey post-hoc test for sammenligning av celler coexpressing EphA3 og Efrin-A3 med celler bare uttrykker EphA3 og for sammenligning av celler coexpressing EphA3 G518L og Efrin-A3 med celler bare uttrykker EphA3 G518L. Den immunoblot av cellelysatene viser uttrykk for EphA3, Efrin-A3, og β-tubulin som lasting kontroll.
Efrin-B2 koekspresjon i kreftceller demper ikke bare EphB4 men også EphA3 aktivering og ligand- bindingsevne i trans
Cis
interaksjoner mellom Ef fibronektin type III domener og ephrins kunne ha særegne selektivitet i forhold til
trans
interaksjoner som involverer Ef ligand-bindende domene og Efrin GH sløyfe [23]. For å undersøke dette, brukte vi Efrin-B2, som ikke binder seg med høy affinitet til EphA3 ligand-bindende domene [25]. Vi infisert A549 lungekreftceller og MCF7 brystkreftceller med et lentivirus koding Efrin-B2 smeltet til EGFP og først undersøkte effekter på endogene EphB4, som binder Efrin-B2 ligand i
trans
. Som EphA2 er EphB4 allment uttrykt i kreftceller [1,30] og dens evne til å være regulert av ephrins i
cis
var ikke tidligere undersøkt. Vi fant at Efrin-B2 ekspresjon inhiberer bindingen av Efrin-B2 AP til celleoverflaten (figur 5A) og EphB4 tyrosinfosforylering som induseres i
trans
av Efrin-B2 Fc (Figur 5B). Dermed
cis
interaksjon med koekspresjon Efrin-B2 hemmer EphB4 ligandbindende i
trans Hotell og aktivering i kreftceller. For å undersøke om EphA3 kan også være regulert av
cis
interaksjon med Efrin-B2, infisert vi A549 lungekreft celler uttrykker EphA3 med lentiviruses koder EGFP-Efrin-B2 eller bare EGFP som en kontroll. Interessant, Efrin-B2 koekspresjon svekket EphA3 aktivering av Efrin-A3 Fc (figur 5C) og hemmet evne EphA3 å binde Efrin-A5 AP uten å redusere de samlede EphA3 nivåer (Figur 5D). EphA3 uttrykk bare svakt økt binding av det ekstracellulære domene av Efrin-B2 AP til cellene (figur 5D), noe som bekrefter at Efrin-B2 ikke effektivt bindes til EphA3 i
trans product: [25]. Disse resultatene tyder på at selv om Efrin-B2 er ikke et aktiverings ligand for EphA3, kan det påvirke EphA3 funksjon gjennom
cis
interaksjon. Dette innebærer at bindende særegenheter som styrer
cis Hotell og
trans
Ef reseptor-Efrin interaksjoner er ikke det samme.
(A) Histogrammet viser binding av Efrin-B2 AP til A549 celler infisert med lentiviruses koding EGFP-Efrin-B2 eller EGFP, avsløre at Efrin-B2 koekspresjon hemmer Efrin-B2 AP binding til EphB4. Normaliserte midler fra 3 eksperimenter (hver med triplikatprøvene) ± SE vises. *** P 0,001 av uparet t-test for sammenligning av celler som uttrykker Efrin-B2 med celler ikke uttrykker Efrin-B2. Den immunoblot av cellelysatene viser uttrykk for EphB4, Efrin-B2 og β-tubulin som lasting kontroll. (B) A549 lungekreftceller og MCF7 brystkreftceller ble infisert med lentiviruses koding EGFP-Efrin-B2 eller EGFP. EphB4 immunutfelninger ble analysert ved immunoblotting for fosfotyrosin (Ptyr) og reprobed for EphB4. Cellelysater ble analysert for Efrin-B2 med en anti-EGFP antistoff og for β-tubulin som lasting kontroll. Histogrammene viser normaliserte middel ± SE kvantifiseres fra 2 immunoblot for hver cellelinje. * P 0,05 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-B2 Fc-behandlede celler som uttrykker Efrin-B2 med celler ikke uttrykker Efrin-B2. (C) A549 celler ble infisert med et lentivirus koding EphA3 og ZsGreen sammen med et lentivirus koding EGFP-Efrin-B2 eller EGFP bare. Kontrollceller ble infisert med lentiviruses koding ZsGreen og EGFP. EphA3 immunutfelninger ble analysert ved immunoblotting for fosfotyrosin (Ptyr) og reprobed for EphA3. Lysates ble analysert for Efrin-B2 med en anti-EGFP antistoff samt for EphA3 og for β-tubulin som lasting kontroll. Histogrammet viser normaliserte midler ± SE kvantifiseres fra 2 immunoblotter. * P 0,05 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-A3 Fc-behandlede celler som uttrykker Efrin-B2 med celler ikke uttrykker Efrin-B2. (D) Efrin-A5 AP binding til celleoverflate EphA3 hemmes av Efrin-B2 koekspresjon. Histogrammet viser gjennomsnitt ± SE fra 3 forsøk (hver med triplikate prøver) for sammenbinding av Efrin-A5 AP eller Efrin-B2 AP til A549-celler som anvendes for forsøket i C. For Efrin-A5-binding, ** p 0,01 ved en-veis ANOVA og Dunnetfs post hoc-test for sammenligning med celler som uttrykker EphA3 og EGFP; for Efrin-B2 AP bindende, ** p 0,01 av uparet t-test for sammenligning av celler som uttrykker eller ikke uttrykke EphA3. Den immunoblot av cellelysatene viser uttrykk for Efrin-B2, EphA3 og β-tubulin som lasting kontroll, verifisere at Efrin-B2 koekspresjon ikke redusere EphA3 nivåer. Av notatet, dublett tilsvarer overexpressed Efrin-B2 er ikke på grunn av ulik grad av N-bundet glykosylering fordi fjerning av N-koblede oligosakkarider med PNGase-F endoglykosidase tilsvarende økte SDS-PAGE mobilitet av begge bandene (ikke vist). Enten det øvre båndet kan representere en form med O-bundne oligosakkarider [51] eller annet posttranslational modifisering gjenstår å fastslå.
Endogene Efrin-As dempe aktivering av koekspresjon EphA2 i kreftceller
for å undersøke om ephrins endogent uttrykt i kreftceller kan også engasjere seg i
cis
interaksjoner som hemmer aktiveringen av kouttrykte endogene Ef reseptorer, vi valgte SKBR3 og MCF7 brystkreftcellelinjer. Disse linjene uttrykker høye nivåer av Efrin-A-ligander, sammen med EphA2 [11] (broadinstitute.org/ccle), selv om reseptoren uttrykkes i relativt små mengder, i overensstemmelse med det komplementære ekspresjon av Ef reseptorer og ephrins observert i mange cancercellelinjer [1]. Siden både SKBR3 og MCF7-celler uttrykker flere Efrin-A-ligander, som er GPI-forankret, brukte vi enzymet fosfatidylinositol-spesifikk fosfolipase C (PI-PLC) for å fjerne alle Efrin-As fra celleoverflaten. I begge cellelinjer, fjerning av endogene Efrin-As fra celleoverflaten resulterte i forbedret EphA2 aktivering av Efrin-A1 Fc in
trans
sammenlignet med ubehandlede celler (figur 6 A, B). I motsetning til dette, PI-PLC behandling av kontroll Fc-behandlede celler ble redusert til lave basal EphA2 aktivering, noe som tyder på at endogen Efrin-som kan indusere noen EphA2 aktivering. Siden Efrin-A1 er blitt rapportert å bli spaltet fra overflaten av kreftceller av matriks-metallproteaser, vi også behandlet SKBR3 celler med det bredspektrede matriks metalloprotease-inhibitor GM-6001 [4,6,31]. Behandling med inhibitoren i 24 timer ytterligere øket celleoverflate assosiert Efrin-A1. Men det gjorde ikke vesentlig påvirke EphA2 tyrosinfosforylering indusert av Efrin-A1 Fc bindende i
trans
, muligens på grunn av allerede høye
cis
hemming av de høye nivåene av Efrin-A1 til stede selv i fravær av GM-6001. Derfor, i kreftceller
cis
interaksjon med endogene Efrin-A ligander kan dempe EphA2 aktivering av Efrin-As presenteres i
trans
, støtter betydningen av
cis
interaksjoner i kreft patogenese.
(A) SKBR3 og (B) MCF7 brystcancerceller ble behandlet med PI-PLC i 4 timer og deretter stimulert med Efrin-A1 Fc. EphA2 immunutfelninger ble analysert ved immunoblotting for fosfotyrosin (Ptyr) og reprobed for EphA2. Lysates probet med anti-Efrin-A1 antistoff bekrefte fjerning av Efrin-As av PI-PLC; β-tubulin bekrefter lik belastning av banene. The Odyssey LI-COR systemet ble brukt for deteksjon og fargebilder ble konvertert til gråskala med Photoshop. Histogrammene viser normaliserte data fra 3 forskjellige eksperimenter * p 0,05 og *** p 0,001 av en sample t-test for sammenligning av Efrin-A1 Fc-stimulerte celler behandlet eller ikke med PI-PLC. (C) SKBR3 celler ble behandlet med PI-PLC som i A eller med den bredspektret matriks metalloprotease-inhibitor GM-6001 i 24 timer. Immunutfelninger og lysatene ble undersøkt som angitt.
Diskusjoner
ulike familier av reseptorer og celleoverflateassosierte ligander som sammen formidler juxtacrine signaler ved å samhandle i
trans
tvers celle-celle veikryss kan også, når koekspresjon på samme celleoverflaten, samhandle på tvers i
cis product: [32]. Disse
cis
interaksjoner, som har vært mest studert i nervesystemet og immunsystemet, typisk dempe signalene utløst av
trans
interaksjoner gjennom mekanismer som i mange tilfeller er ikke godt forstått [ ,,,0],32-34]. Nyere studier har avdekket viktige funksjonelle roller for hemmende
cis
interaksjoner mellom Ef reseptorer og Efrin ligander kouttrykte i nevroner [17-21].
