Abstract
Det marine sopp
Microascus brevicaulis
belastning LF580 er en non-modell sekundær metabolitt produsent med høy avkastning av de to sekundære metabolitter scopularides A og B, som viser forskjellige aktiviteter mot tumor cellelinjer. En mutant stamme ble erholdt ved hjelp av UV-mutagenese, som viser hurtigere vekst og forskjeller i pellet formasjonen i tillegg til høyere produksjonsnivåer. Her viser vi den første proteomet studie av en marin sopp. Sammenlignings proteomikk ble brukt til å få en dypere forståelse av regulering av produksjon og fysiologi av villtypestammen og dens mutant. For dette formål ble en optimalisert proteinekstraksjon protokoll etablert. I alt ble 4759 proteiner identifisert. Den sentrale metabolske veien til belastning LF580 ble kartlagt ved hjelp av KEGG pathway analyse og GO merknader. Ansette iTRAQ merking, ble 318 proteiner vist seg å være betydelig regulert i mutant stamme: 189 var ned- og 129 oppregulert. Proteomikk er et kraftig verktøy for forståelse av regulatoriske aspekter: Forskjellene på proteom- nivå kunne tilskrives begrenset næringsstoffer i villtype press på grunn av en sterk pellet formasjon. Denne informasjonen kan brukes for optimalisering på belastning og prosessnivå. Koblingen mellom næringsbegrensning og pellet dannelse i den ikke-modellen sopp
M
.
brevicaulis
er i enighet med kunnskap på modellorganismer som
Aspergillus niger Hotell og
Penicillium chrysogenum
Citation. Kramer A, Beck HC, Kumar A, Kristensen LP, Imhoff JF, Labes A (2015) proteomikk Analyse av Anti-kreft Scopularide Produksjon av Marine
Microascus brevicaulis
Strain og dens UV Mutant. PLoS ONE 10 (10): e0140047. doi: 10,1371 /journal.pone.0140047
Redaktør: Marie-Joelle Virolle, Universitetet Paris Sør, FRANCE
mottatt: 16 mars 2015; Godkjent: 21 september 2015; Publisert: 13 oktober 2015
Copyright: © 2015 Kramer et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelige i saksdokumenter filer eller via Pangea database. (doi: https://dx.doi.org/10.1594/PANGAEA.853591)
Finansiering: Denne studien ble finansielt støttet av EU gjennom det 7. ramme KBBE (https://cordis.europa.eu/fp7/kbbe/about-kbbe_en.html) prosjekt MARINE FUNGI (prosjekt nr. 265926). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nye sekundære metabolitter produsert av sopp holde et stort potensial i søknaden for menneskelig bruk [1, 2]. De to cyclodepsipeptides scopularides A og B fremstilles ved en ascomycete, isolert fra det indre vev av den marine svampen
Tethya aurantium product: [3]. Sopp belastningen ble opprinnelig beskrevet som
Scopulariopsis brevicaulis
LF580. Nyere studier avdekket
S
.
brevicaulis
å være Soppers livsstadier av
Microascus brevicaulis product: [4-6]. Ifølge reglene for nomenklatur for sopp (6), navnet
Microascus brevicaulis
belastning LF580 brukes innenfor dette manuskriptet.
Begge scopularides demonstrerte spesifikk aktivitet mot bukspyttkjerteltumorcellelinjer Colo357 og Panc89 samt kolon tumorcellelinje HT29 [3]. Begge scopularides bestå av fem aminosyrer cykliserte via en sidekjede (scopularide A: (
cyclo
– (3-hydroksy-4-methyldecanoyl- Gly-l-Val-D-Leu-L-Ala-l- Phe); scopularide B:
cyclo
– (3-hydroksy-4-methylloctanoyl- Gly-l-Val-D-Leu-L-Ala-L-Phe)) i genomet analyse av
M
.
brevicaulis
LF580, 17 NRPS gener ble identifisert [7]. ansvarlig genet klynge for scopularide A inneholder et ikke-ribosomale peptid syntetase (NRPS1), en polyketide syntase (PKS2), en CoA-ligase, en acyltransferase og en transkripsjonsfaktor [7, 8]. på grunn av den strukturelle analogi, er en syntese av begge scopularides ved den samme enzymkomplekset er antatt.
villtypestammen LF580 representerer en ikke-modell sekundær metabolitt produsent, som viser høy avkastning av målet metabolitter (ca. 200 mg L
-1 for scopularide A [9]). Ved hjelp av en optimalisert screening tilnærming [10], en UV mutant stamme (
M
.
brevicaulis
belastning LF580-M26) ble oppdaget, som viste en økt produksjonsnivå på de to scopularides under standardbetingelser, raskere og annerledes vekst og endringer i pellet formasjon. Således ble denne mutantstamme LF580-M26 som velges for en detaljert sammenligning med villtypestammen på proteom- nivå.
Sammenlignings proteom- profileringen bidrar til å forstå metabolske forandringer som mediering av cellulære metabolske aktiviteter forekommer i prinsippet på proteinnivå [ ,,,0],11, 12]. Kvantitative proteomikk kan koble fysiologiske endringer, vekst egenskaper og forbedret sekundær metabolitt produksjon med molekylære endringer på proteomet nivå. En kvantitativ sammenligning gir romanen informasjon om de regulatoriske trasé som er involvert og bidrar til nøyaktig belastning og prosessutvikling [13-16]. Til tross for sin utbredelse i bioteknologisk industri og deres betydning som patogener, trådformede sopper fått mindre oppmerksomhet under initiering og gjennomføring av innovative biologiske metoder og i systembiologi i det siste [17]. Som i genomisk æra, trådformede sopp er etternølere i proteomikk era: I 2008, bare noen få soppundersøkelser av proteomet var tilgjengelige, i hovedsak beskriver klassiske modell arter av de to slektene
Aspergillus Hotell og
Penicillium
[15]. Dag, 250 sopp proteom er tilgjengelige, som representerer mindre enn 5% i forhold til de tilgjengelige bakterielle proteom (https://www.uniprot.org august 2015). Molekyl hel celle-analyser beskriver omfattende innsikt spesielt i ikke-modellorganismer, som gir informasjon av reaksjonen av organismen for endringer i miljøet. Noen studier allerede ga et glimt av det enorme potensialet i proteomikk.
E
g
. proteomet analyse av utviklingsstadier i
Cordyceps
ført til konkrete startpunkter for stammeutvikling [18], proteomet studier av
A
.
fumigatus
kaste nytt lys over patogenitet mekanismer [19], og sammenlignende proteomet analyse av en
A
.
nidulans
belastning og dens mutant stamme avdekket flere effekter av gendelesjoner [20, 21].
Proteome teknikker er i rask utvikling, men mange protokoller ble utviklet for bare et lite antall av organismer. Nesten alle nye studier for en tilpasning av protein utvinning metodikk. Generelt er sopp kjent for å ha stive og komplekse cellevegger, noe som er grunnen til at det kreves et spesielt fokus på celleveggen avbrudd under tillagingen [17, 22, 23].
Formålet med denne studien var proteomet basert karakterisering av forskjellene mellom UV mutant LF580-M26 og dens villtype (WT) stammen for å identifisere de underliggende molekylære mekanismer for den økte scopularide produksjon av UV-mutantstammen. Denne studien er den første proteomet analyse av en marin trådformede sopp.
Resultater
Identifikasjon av like prøvepunkter ved bestemmelse av vekstegenskaper og scopularide produksjons
Som alle endringer av mobilnettet metabolske aktiviteter resulterer i endringer på proteinnivå, kan bare oppnås en komparativ proteom analyse av stammer med ulik vekst atferd og fysiologi ved å synkronisere den metabolske egenskap av de to stammene. En sammenligning av veksten deres oppførsel ble brukt til å velge den avling punkt, hvor begge stammer ble antatt å være i det samme vekst- og produksjonstrinn. Vekstkurver for begge stammer ble oppnådd i tre paralleller, og viste forskjeller i vekst oppførselen til WT belastning LF580 og mutantstammen LF580-M26 (figur 1A). Åpenbare forskjellene var hastighet, pH, biomasse og scopularides produksjon (fig 1B) i de ulike vekstfaser
(A) Tidsserier av biomasse (LF580: – ◆ – (lys grå), LF580-M26.: – ▲ – (mørk grå)) og pH-verdi (LF580: – ■ – (lys grå), LF580-M26: – ● – (mørk grå)) for villtypestammen LF580 og dets mutant stamme LF580- M26 vises. Bestemmelsene ble utført in triplo i 6 dager. (B) Produksjons nivåer av scopularide A (LF580: – ◆ – (lys grå), LF580-M26: – ▲ – (mørk grå)) og B (LF580: – ■ – (lys grå), LF580-M26: – ● – (mørk grå)) i løpet av tidsseriene er sammenlignet på grunnlag av topparealet av den respektive masse signalet etter analytisk HPLC-MS. Kurvene representerer trendlinjen.
Den raske veksten fasen av mutant stamme LF580-M26 startet 20 timer etter vaksinasjon. I motsetning til dette lag fasen av WT-stammen ble avsluttet omtrent åtte timer senere. Tar biomasseproduksjon og pH som markører for soppvekst, kurvene avvek i varigheten av den hurtige vekstfasen, som er av omtrent 24 timer for mutanten og 42 timer for WT. Disse forskjellene førte til vekstrater på 0,0715 g biomasse L
-1 h
1 og 0,0426 g biomasse L
-1 h
1 (basert på biomasse: jjI = dX (dt)
-1) for mutantstammen LF580-M26 og WT belastning, henholdsvis. Biomassen produksjon av begge stammer i løpet av denne fasen viste ganske like verdier av 1,71 g biomasse L
1 (mutant stamme LF580-M26) og 1,79 g biomasse L
1 (WT stamme). Det endelige utbyttet av begge stammer var i det samme område (LF580: 3,4 g biomasse L
-1, LF580-M26: 4,3 g biomasse L
-1). I likhet med biomassen kurve, progresjon av pH-kurve av mutantstammen LF580-M26 var heller eksponentiell i forhold til den lineære progresjon av pH-kurven av WT belastning. Sammenligning det tidspunkt da begge stammer nådd det laveste pH-nivå (noe som indikerer slutten av rask vekst), en forskjell på omtrent 24 timer mellom begge stammer ble observert. PH-verdien for den WT belastning oppholdt seg på dette nivået inntil slutten av forsøket (120 timer). I motsetning til dette pH-verdien av mutantstammen LF580-M26 begynte å øke umiddelbart etter å ha nådd den laveste pH-nivået med den samme progresjon det hadde vært fallende tidligere. PH-verdien nådde et maksimum på 7,5 ved slutten av forsøket.
Begge stammer viste kontinuerlig fremstilling av de scopularides med liknende priser under den hurtige vekstfasen. En drastisk forandring som fører til klare forskjeller mellom WT og mutantstammen ble observert i løpet av overgangen fra slutten av raske til tidlig stasjonær fase (figur 1B): Mutantstammen LF580-M26 ført gjennom denne overgang i løpet av 7 timer, mens WT belastning trengte ca 32 timer. Den scopularide produksjonsrate var 50 ganger høyere i mutantstammen i overgangsfasen. I den stasjonære vekstfase, nedsatt faktor til ca 10. I denne fasen (
i
.
e
. 52 h og 72 h av dyrking for henholdsvis LF580-M26 og LF580,) den produksjon av begge scopularides stagnert i WT-stammen, mens produksjonen i mutantstammen likevel økes inntil omtrent 100 h dyrking, etterfulgt av en reduksjon av konsentrasjonen av begge scopularides. Det karakteristiske kompakt pellet dannelsen av WT stammen ble ikke observert for mutantstammen LF580-M26. Pellet dannelsen av WT belastningen startet på dag to etter vaksinasjon; ved dag tre omtrent 90% av pelletene nådd en størrelse på 2-3 mm i diameter; på dag fire pelleten dannelsen endte opp med en diameter på 3-4 mm. Ingen signifikant økning av antall pellets kunne observeres etter fire dager. I motsetning til dette, LF580-M26 viste en økende turbiditet av kulturen, med filamentøs vekst snu i utviklingen av hårete pellets (ca. 1 mm diameter). Viskositeten av kulturene økte frem til dag fem dyrknings
i betraktning den observerte forskjellene, pH-verdi, biomassen og scopularides produksjon ble brukt som markører for å bestemme ekvivalente prøvepunkter:. I henhold til cellene ble høstet etter 68 t (WT-stamme LF580) og 44 h (mutant stamme LF580-M26). På disse tider, ble stammene antas å være i en sammenlignbar vekst tilstand, som pH (LF580: 4,62 ± 0,13; LF580-M26: 4,95 ± 0,17) og biomasse (LF580: 2,5 ± 0,2 mg ml
1; LF580-M26: 2,6 ± 0,1 mg ml
-1) verdier var i samme område
Kvantitativ Protein Extraction som en forutsetning for Proteome Studies
Når det gjelder det marine ikke. -modellen sopp
M
.
brevicaulis
belastning LF580 av denne studien, flere metodiske tilnærminger og validering av protokollene var avgjørende for å oppnå høy kvalitet proteomet data. En enkel standard ekstraksjon prosedyre basert på celleoppbrytning ved ultralydbehandling førte ikke til en liknende kvalitet (mønster) og mengde (intensitet) av proteiner for WT og mutantstammen, noe som indikerer ufullstendig ekstraksjon. Derfor ble en tilpasset protein utvinning protokoll utviklet og validert. Fokus ble satt på celle avbrudd og oppløsning av proteiner (fig 2). To fremgangsmåter Celleødeleggelse ble sammenlignet: maling i flytende nitrogen og anvendelse av kuler. I tillegg ble fokus satt på oppløsningen av den uoppløselige proteinfraksjonen, som pelletert ved første separering.
To forskjellige celleoppbrytning metoder ble sammenlignet med hensyn til antall protein grupper identifisert ved anvendelse av nano-LC-MS /MS. En ekstra fokus ble satt på oppløsnings av knapt løselig proteinfraksjon (H) ved siden av løselige proteinfraksjon (S).
Å bruke denne tilpasses protokollen, en sammenlignbar utvinning klasse for WT og mutant stammen var påvist av SDS-PAGE før sammendrag av den endelige protein ekstrakt (resultater ikke vist). For å sammenligne utvinning graderinger av de ulike prøve preparater (Fig 2), ble proteomet data analysert prøven ved å prøve å bruke nano-LC-MS /MS. Tidligere studier viste at hele genomet til
M
.
brevicaulis
har en størrelse på ca 32 Mb, som inneholder 16.298 gener. 1,33% av genomet representert gjentar [7, 24]. Her ble 4759 proteiner identifisert (FDR 0,01 og 1 ≥ peptider pr protein) ved hjelp av de utviklede utvinning prosedyrer i begge stammer. Dette gjenspeiler dekning på ca. 30% av det teoretiske protein nummer. Proteiner oppnådd ved flytende nitrogen ekstraksjon omfattet 92,2% av disse 4759 proteiner. Sammenlignet med dekning på 88,1% med perle basert utvinning, flytende nitrogen utvinning derfor ført til en økning på 4,1% av proteiner dekket. En omtrent tre ganger høyere økning (11,4%) ble oppnådd ved oppløseliggjøring av de «nesten ikke oppløselige proteiner (» 92,2%), i stedet for å fokusere bare på «lett oppløselig» proteinfraksjon (80,8%). Økningen var uavhengig fra den opprinnelige cellen avbrudd metode.
Sammenligning av proteom av villtypestammen LF580 og dens UV mutant stamme LF580-M26
Analyse av trasé og protein funksjoner.
En kombinasjon av alle fraksjoner fra de flytende nitrogen behandlede celler ble brukt for kvantitativ sammenligning ved hjelp av iTRAQ merking. 3526 gjensidige proteiner ble trygt identifisert og kvantifisert i WT og mutant stamme LF580-M26 (FDR 0,01 og 2 ≥ peptider per protein). 318 proteiner ble differensielt regulert: 129 proteiner ble oppregulert og 189 ble nedregulert i mutantstammen sammenlignet med WT-stammen. For identifikasjon av molekylære prosesser og cellulære aktiviteter, ble det sett av differensielt regulert proteiner underkastet GO analyse [25] (fig 3). Enzym funksjonalitet ble avslørt ved hjelp KEGG [26], forutsi effektene av mutasjon på celle- og metabolske nivåer (fig 4).
3526 proteiner ble kvantifisert ved hjelp iTRAQ merking. 318 (9%) viste en signifikant regulering i mutantstammen. 129 (3,7%) ble oppregulert og 189 (5,3%) ble nedregulert. Stolpediagrammet viser prosentandelen av opp- og downregulated proteiner sortert til de forskjellige kategoriene på bakgrunn av GO merknader.
Mørk grå diagrammer representerer downregulated proteiner i mutant stamme, lys grå, i kontrast de oppregulert seg. Tallene gjenspeiler sekvenser av enzymer sortert til de forskjellige kategoriene.
Evalueringen av GO data ble utført ved hjelp av et sett av utvidet kategorier,
i
.
e
. undernivåer av GO kategorier [27]. Viktigste forskjeller ble funnet i kategoriene katabolisme, pellet formasjon og replikering. De to sistnevnte kategoriene viste en tydelig oppregulering i mutant med faktorer av 3,2 (pellet Formasjonen) og 3,5 (replikasjon), henholdsvis. Imidlertid representerer pellet dannelsen av typen med en liten datasett av proteiner (1,6% opp- og 0,5% nedregulert). En klar downregulation ble sett for protein grupper knyttet til kategoriene katabolisme, lagring, stress respons og død. 18,6% av proteinene relatert til kategorien katabolisme ble oppregulert og 33,3% nedregulert. I kategorien anabolisme, omtrent det samme antall proteiner ble opp- eller nedregulert: henholdsvis 10,1% og 9,5%. Små forskjeller kunne ses for alle kategorier celleveggen (forhold på 1,5) og transport (forhold på 1,3). Innenfor kategorier lagring (0,5%), stressrespons (4,2%) og død (2,1%) bare downregulated proteiner ble funnet. Antallet av ukjente proteiner var omtrent det samme for opp- og downregulated datasett (17,8% og 16,9%, henholdsvis). 12,4% (0,8% oppregulert, 11,6% nedregulert) av de regulerte proteiner kan ikke overdras til en av kategoriene.
KEGG pathway analyse aktivert kvalifisering av alle nødvendige enzymer i sentral metabolismen (se avsnittene nedenfor). Generelt ble uttrykket nivåer av de fleste enzymer nedregulert i mutantstammen (figur 4). Innenfor kategorien «biosyntese av sekundære metabolitter» et tilsvarende antall enzymer var opp- og nedregulert. I kategoriene lipidmetabolismen, metabolisme av kofaktorer og vitaminer, metabolisme av terpenoider /polyketider og oversettelse, et større antall enzymer viste høyere uttrykk nivåer i mutantstammen.
KEGG og gå data ble brukt for en detaljert sammenligning av WT belastning og mutantstammen LF580-M26.
katabolisme.
GO kategorien av katabolisme viste et høyere antall proteiner for å bli nedregulert i mutant stamme (fig 3). Men downregulation ikke gjenspeiler en generell nedbremsing av katabolisme. For eksempel, peptidase-inhibitor i9 (g7795), en inhibitor for katabolske prosesser, viste en nedregulering i mutantstammen, noe som indikerer en forbedring av katabolske prosesser. Evalueringen av KEGG data bekreftet denne antakelsen, fordi en nedregulering ble i hovedsak sett på enzymnivå for flere stier og isoenzymer i mutant stamme, sannsynligvis fører til høyere fluks i de sentrale veier.
Alle enzymer av en klassisk Embden-Meyerhof-veien (glykolyse) var tilstede og aktive, slik at vekst på glukose som forventet for en typisk eukaryot. I tillegg kan alle enzymer som er nødvendige for den første nedbrytning av andre mono- og disakkarider være kvalifisert. Vekstmedium inneholdt glukose som karbohydratkilde, men soya pepton og gjærekstrakt var kilder for ytterligere monomere sukker (i henhold til leverandørenes sertifikater av analyser). Uttrykket av alle glykolytiske enzymer var den samme i WT belastning og mutantstammen LF580-M26.
pentosefosfateveien pathway (PPP) kunne være kvalifisert. De fleste enzymer ble nedregulert i mutantstammen, for eksempel fruktose-biphosphatase (EC 3.1.3.11). WT-stammen benyttes både fruktose-biphosphatase (EC 3.1.3.11) og 6-fosfofruktokinase (EC 2.7.1.11). Med hensyn til den oksidative del, ble reaksjonsveien fra D-glukonat-6-fosfat D-ribose-1-fosfat nedregulert i mutantstammen. WT kan ha nytte av en løpende PPP, som den genererer ytterligere NADPH, som er nødvendig for opptak ammonium så vel som for proteinsyntese. Vanligvis høyere etterspørsel etter NADPH øker fluksen gjennom PPP [28]. Jo høyere nivået av protein ekspresjon i PPP i WT indikerte en slik økning i fluksen [29].
Som forventet for et eukaryot organisme, ble pyruvat generert i glykolysen kanaliseres gjennom den klassiske pyruvat-dehydrogenase-komplekset inn i tricarbonic syre syklus (TCA). Den fulle TCA var operativ i den katabolske retning i begge stammer. Imidlertid mutantstammen LF580-M26 viste nedregulering av noen enzymer: Den innledende trinn med kondensering av oksaloacetat og acetyl-CoA til citrat blir katalysert av en citrat-syntase (EC 2.3.3.8) i mutantstammen.
M
.
brevicaulis
belastning LF580-M26 bruker ett skritt isocitrat dehydrogenase isoform (EC 1.1.1.41) generere NADH. WT tillegg uttrykte to trinn isocitrat dehydrogenase (EC 1.1.1.42) generere NADPH. Utnyttelse dette enzymet, kunne WT heve NADPH nivå,
e
.
g
. for økt ammonium opptak eller høyere nivåer av oversettelse. Det samme fenomen ble observert for succinatdehydrogenase, som er til stede i WT-stammen som EC 1.3.99.1 og EC 1.3.5.1. Sistnevnte isoformen er membranbundet og en del av luftelektrontransportkjeden. Det ble funnet på samme nivå oversettelsen i begge stammer. Omdannelsen av CoA-aktiverte karbonsyrer (acetat, butyrat, acetoacetat) ble nedregulert ved nivået for acetat-CoA transferase (EC 2.8.3.8), som fører til et høyt nivå av aktiverte substrater i TCA og påfølgende fluks i mutantstammen .
CoA-transferase (EC 2.8.3.8) og beslektede enzymer av β-oksidasjon ble nedregulert i mutantstammen som indikerer lavere nivåer av β-oksidasjon. Nedregulering av propionyl-CoA-konverterende enzymer, slik som 2-methylcitrate syntase (EC 2.3.3.5) og den etterfølgende dehydratase (EC 4.2.1.79), falt sammen med lavere nivåer av β-oksidasjon, som propionyl-CoA dannes via degradering av oddetalls-fettsyrer. I motsetning til dette WT viste høyere nivåer av disse enzymer, noe som kan forklares ved nedbrytning av lagerområder (
i
.
e
. Fettsyrer) indusert ved et karbon begrensning innenfor de dannede pellets .
Enzymer av respiratoriske kjeden (oksidativ fosforylering) var kvalifisert og viste ingen forskjell i proteinekspresjon nivå mellom mutant og WT belastning.
Aminosyre degradering og nitrogenmetabolisme var kvalifisert, noe som indikerer at den NADP-glutamat dehydrogenase (EC 1.4.1.4) ble brukt av begge stammer å assimilere gratis ammonium fra mediet. I mutant stamme, ble ytterligere ammonium opptak via glutaminsyntetase-glutamin oksoglutarat aminotransferase (GOGAT) syklus nedregulert ved nivået for konvertering fra glutamat til glutamin av glutaminsyntetase (EC 6.3.1.2).
NAD -spesifikk glutamat dehydrogenase (EC 1.4.1.2, konvertere glutamat til ketoglutarat og ammonium eller omvendt) ble nedregulert i mutantstammen. En slik nedregulering ble vist for soppceller ikke er begrenset i deres nitrogen- eller karbonkilder [30, 31]. Vice versa, vil NAD-spesifikke glutamat dehydrogenase bli aktivert, hvis en belastning er begrenset i en av disse kildene. Som scopularide produksjon er nitrogen avhengig [9], proteom data tyder på en nitrogen begrensning av WT i brukt medium. I motsetning til dette, ble alle veier for ytterligere forsterkning av nitrogen nedregulert i mutantstammen, som ikke ser ut til å være begrenset nitrogen.
Generelt aminosyre degradering er aktiv, slik at stammene til dyrket på pepton-medium innehold . Omdannelse av aminosyrene til acetyl-CoA for påfølgende respirasjon ble forsterket ved nivået for de respektive acetyl-CoA C-acyltransferases (EC 2.3.1.16). Likevel, nedbrytning av aminosyrer nødvendig for produksjonen av scopularides ble nedregulert (se nedenfor).
Anabolisme.
Evalueringen av GO data viste et tilsvarende antall proteiner gruppert inn i kategorien anabolisme å være opp- og nedregulert. Den KEGG pathway analyse tillatt en mer detaljert visning
Enzymene av den klassiske Embden-Elben (EM) sti i eukaryoter vanligvis tjene i to retninger. For glykolyse og glukoneogenesen. Derfor er nærværet av en arbeids EM sti indikerer glukoneogenese som opererer via den samme vei. Som noen reaksjoner av EM-reaksjonsveien er irreversibel, men ytterligere reaksjoner er nødvendige for glukoneogenese: Den eukaryote glucogenetic nøkkelenzymer 1,6-fruktose bisfosfatase (EC 3.1.3.11) og fosfoenolpyruvat carboxykinase (EC 4.1.1.49) ble kvalifisert og vist å bli nedregulert i mutantstammen. Den tredje enzym, en glukose-6-fosfatase (EC 3.1.3.9), kunne ikke være kvalifisert i begge stammer. Dette indikerte en direkte omdannelse av gluconeogenetic glukose-6-fosfat til glukose-1-fosfat til dannelsen av celleveggen og andre polymere sukkerarter for lagringsformål. Som tilfellet var for andre gluconeogenetic enzymer, ble det respektive glukose fosfat glyceratmutase (EC 5.4.2.2) vist seg å bli nedregulert i mutantstammen.
Intern sukker lagring (
e
.
g
. glykogen dannelse) var ikke aktiv i mutantstammen. Alle tilgjengelige glukose inn direkte i glykolysen som angitt ved nedregulering av alle enzymer som er nødvendige for polymere sukker degradering. Den nedregulering av glukosefosfat mutase (EC 5.4.2.2) som er understøttet av denne hypotesen, siden dens aktivitet er en forutsetning for transformering av sukker i en lagrings polysakkarider.
ketosyrer av TCA tjene som startmolekyler for biosyntesen av aminosyrer og andre molekyler. Fjerningen av disse ketosyrer fra TCA ved anabole reaksjon avtar fluksen av den katabolske reaksjoner og derved av den energetiske utbytte. Følgelig er mange av de anabole reaksjoner som starter ved TCA ble nedregulert i mutantstammen, såsom suksinat-dehydrogenase (EC 1.2.1.16), 4-aminobutanoat-transaminase (EC 2.6.1.19) og malat-dehydrogenase (EC 1.1.1.38).
aminosyre biosyntese trasé var kvalifisert, men ble ikke observert noen forskjeller mellom stammer. Proteomet data viste at LF580 brukte alpha-aminoadipate veien for lysin biosyntese.
Transport.
Et tilsvarende antall proteiner knyttet til transport prosesser var opp- og nedregulert. Oppregulert proteiner var involvert i transport av aminosyrer, så vel som av oksygen inn i cellene. Spesielt, et protein (fosfat-repressible fosfat permease, g10374) er ansvarlig for den regulerte opptak av fosfor ble nedregulert; i stedet en ikke-regulert fosfor transport er til stede. Reguleringen av inntak av nitrogen (
i
.
e
. Nitrat) ble nedregulert (nitrat assimilering regulatorisk protein Nira, g12583) og er i henhold til nedregulering av alle veier for ytterligere gevinst på nitrogen i mutantstammen.
proteiner involvert i intracellulær transport ble nedregulert i mutantstammen, for eksempel proteiner som hører til Golgi-apparatet, den peroksisom og vesikkeltransport.
Replication, morfologi, celle integritet og vedlikehold.
Vekst forskjeller ble tydelig reflektert i kategoriene replikering og pellet formasjon. Sammenlignet med WT-stammen tre ganger mer proteiner som tilhører disse to kategorier ble oppregulert i mutantstammen (figur 3). Noen proteiner ble nedregulert, slik som ekstracellulære serin-rike protein (g7517), som var tilknyttet til sent stadium utvikling [32]. Men endringer av proteiner involvert i pellet morphogenesis ble ikke observert.
Mutantstammen viste noen oppregulert proteiner involvert i vedlikeholdsfunksjoner,
e
.
g
. omdannelse av glycin til aminolevulinat (5-aminolevulinat-syntase, EC 2.3.1.37) for etterfølgende Porfyrin syntese. Oppregulering av dette enzymet kan være relatert til økt respirasjonskjede vedlikehold. Høyere nivåer av åndedrett i mutantstammen implisere høyere nivåer av beskyttelse mot oksidativt stress. For eksempel, den nukleære proteiner qri2 nse4 (g3175), som virker i DNA-reparasjon, ble oppregulert i mutantstammen [33].
imidlertid gener involvert i stressrespons viste høyere ekspresjonsnivåer i WT. Tatt i betraktning den begrensning situasjon for WT grunn av pellet formasjon (
i
.
e
. Næringsstoff stress, lav pH-verdi ved slutten av vekstfasen), slike spennings svar ville forventes [34 , 35]. Et eksempel er et høyere nivå av peroksisom katalase (g8585), som er nedregulert i mutantstammen. Ytterligere proteiner i reparasjon og stressrespons ble nedregulert:
e
g
.. Tam domene metyltransferase (g15885) bevare integriteten av polypeptider som vender aldersavhengig ikke-enzymatiske reaksjoner [36]; sphingomyelin fosfodiesterase (g8757) [37] og overlevelse protein sikker lignende fosfatase /nukleotidase (g13733). Sistnevnte kan være involvert i stressrespons, som celler med mutasjoner i sikker genet dårlig overleve i den stasjonære fasen [38].
Sekundær metabolisme.
I alt 39 biosyntetiske enzymkomplekser var identifisert i genomet til
M
.
brevicaulis
. 17 ble tilknyttet NRPS, 18 til PKS, to til fettsyre ligase og en representerte en PKS /NRPS hybrid [7, 24]. Ut av disse genene, ble 9 NRPS og 7 PKS proteiner kvalifisert i GO datasett. iTRAQ kvantifisering viste en høyere ekspresjon av NRPS13 og PKS15 og en lavere ekspresjon av PKS 9, 14 og 18 i mutanten. Imidlertid er funksjonen til disse enzymene er fortsatt uklar som de sekundære metabolittprofiler av WT og mutant er meget lik
Nærmere bestemt regulering av de respektive biosyntese-trasé for de fem aminosyrene som danner scopularides A og B ble sammenlignet.: trasé for l-valin, L-fenylalanin, L-alanin, d-leucin og glysin syntese var kvalifisert, noe som indikerer at
M
.
brevicaulis
syntetisert alle forløper molekyler for scopularides. Dette støttes av tidligere vekstforsøk som viste at aminosyrer fra næringskilder ikke tjener som direkte forløpere for produksjon scopularide [9]. Degradering av aminosyrer som er nødvendig for scopularide produksjon var betydelig nedregulert i mutantstammen: Alanin nedbrytning ble nedregulert ved nivået for alanin-glyoksylat nase (EC 2.6.1.44) og 4-aminobutyrat-2-oksoglutarat nase (EC 2.6.1.19) . Valin degradering ble blokkert på nivået av metylmalonat-semialdehyd dehydrogenase (EC 1.2.1.27). [17].
