Abstract
3-dimensjonale (3D) kultur modeller har potensial til å bygge bro mellom monolayer cellekultur og
in vivo
studier. For å dra nytte anti-kreft medisiner fra 3D-modeller, nye teknikker nødvendig som gjør at deres bruk i high-throughput (HT) screening mottagelig formater. Vi har etablert miniatyrisert 3D kultur metoder robuste nok for automatiserte HT skjermer. Vi har anvendt disse metoder for å evaluere følsomheten av normale og tumorigene bryst epiteliale cellelinjer mot et panel av onkologiske medisiner når dyrket som monolag (2D) og kuler (3D). Vi har identifisert to klasser av forbindelser som utviser preferanse cytotoksisitet mot kreftceller enn normale celler når de dyrkes som 3D-kuler: mikrotubul-målsøkende midler og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Ytterligere forbedre ved vår 3D-modell, ble overlegne differensiering av EC50-verdiene i proof-of-concept skjermer oppnådd ved co-dyrkning av brystkreftceller med normale humane fibroblaster og endotelceller. Videre ble den selektive følsomheten av kreftceller mot kjemoterapeutika observert i 3D co-kultur forhold, snarere enn som 2D co-kultur monolag, fremhever viktigheten av 3D kulturer. Til slutt undersøkte vi de antatte mekanismene som driver ulik styrke vises av EGFR-hemmere. Oppsummert våre studier etablere robuste 3D kultur modeller av humane celler for HT vurdering av tumorcelle-selektive midler. Denne metodikken er forventet å gi et nyttig verktøy for studier av biologiske forskjeller innen 2D og 3D dyrkningsforhold i HT-format, og en viktig plattform for romanen anti-kreft medisiner
Citation. Howes AL, Richardson RD , Finlay D, Vuori K (2014) 3-Dimensional Kultur Systems for Anti-Cancer forbindelse Profilering og høy gjennomstrømming screening Avslør Økning i EGFR Inhibitor cytotoksisitet Sammenlignet enlagskultur Systems. PLoS ONE ni (9): e108283. doi: 10,1371 /journal.pone.0108283
Redaktør: Chryso Kanthou, University of Sheffield, Storbritannia
mottatt: 01.11.2013; Godkjent: 27 august 2014; Publisert: 23.09.2014
Copyright: © 2014 Howes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av Arra bevilgning (1 RC1 EB011780-01) «High throughput screening i menneskelige 3D kuler av epitel, endotelial, og stromale celler» (Vuori, PI) fra HHS-National Institutes of Health-National Institute of Bioimaging og bioteknologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne oppmerksom på at en eller flere av forfatterne er ansatt ved et kommersielt selskap (Tanabe Research Laboratories). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
utvikling og utnyttelse av modellsystemer som rekapitulere menneskelig solid svulst arkitektur og biologi er avgjørende for å bedre forstå patofysiologien av tumorceller, og for å hjelpe til oppdagelsen av nye anticancer terapi. Som et resultat av dette har modeller blitt utviklet for å reflektere mikromiljøet av faste tumorer. 3D sfæroide kulturer kan rekapitulere celle-celleinteraksjoner, celle-matriks interaksjoner, næringsstoffer og oksygen gradienter og celle polaritet som mangler i tradisjonelle 2D-monolagskultur [1], [2]. 3D-kulturer også inneholde heterogene soner med formerende, stillestående, og døende celler, som likeledes finnes i humane tumorvevet og utviser forskjellige sensitiviteter til anti-tumor behandlinger [1], [3]. Dermed 3D cellekultur modeller bringe betydelig verdi til medisiner og utviklingsprosessen som en potensiell praktisk bro mellom tradisjonell
in vitro
monolagkulturer og dyre
in vivo
dyrestudier [4], [ ,,,0],5], [6].
Nåværende behandling for de fleste humane kreftformer omfatter kjemoterapeutiske midler som er giftige mot delende celler, som ofte resulterer i en rekke bivirkninger. Godkjenning av molekylært målrettede behandlinger, for eksempel protein kinase hemmere imatinib, gefitinib, og lapatinib, har båret ut løftet om at midler som spesifikt retter kreftceller i stedet for alle dele celler føre til færre bivirkninger.
når cytotoksisitetstester studier mot kreftceller blir utført, blir cellene vanligvis dyrket som en monolayer, der celle-celle kontakter og mikromiljøet signaler mangler og dyrkningsforholdene kan derfor ikke gjenspeile
in vivo
situasjon for cytotoksisitet og /eller legemiddelresistens. For å omgå disse tekniske problemene, er 3D-kulturer som blir dannet og analysert i en rekke interessante formater [7], [8], [9], og co-kulturer blir anerkjent som verdifulle systemer for å forutsi legemiddel svar
in vivo
for en rekke forskjellige sykdommer, [10], [11], [12]. En samtale for komplekse 3D kultur modeller spesielt for brystkreft [13] fremhever viktigheten av arbeidet med Reid
et al.
Å måle transkripsjons endringer i 3D-monotypisk kulturer ved hjelp av høyt innhold bildebehandling [14], samt av vår studie her hvor vi måler celle levedyktighet i high-throughput (HT) mottagelig 3D co-kulturer som viser nytten av 3D co-kulturer for å identifisere antitumormidler med robust selektivitet for tumorceller enn normale celler.
Her har vi benyttet en modifisert versjon av multi-cellulære sfæroide «hengende dråpe» -teknikken [15] og har optimalisert det i høy tetthet rundbunnede plater som er blitt behandlet med hydrogeler for å hemme celleadhesjon, slik at dannelsen av enkelt kuler av reproduserbar størrelse på tvers av flere forskjellige humane celletyper. Behovet for HT-mottagelig modeller for kreftforskning har nylig blitt anmeldt [16]. Av de fem mest prominente metoder for å generere jevnt store kuler; det vil si, kitosan hydrogel ko-kultur, PDMS V-bunn mikrobrønner, microfluidic enheter, to-lags embryoid legemer, og den multi-brønn hengende dråpe (oversikt i [3] og [17]), vi begrunnet at den multi-brønn hengende dråpe modell er den mest HT-mottagelig på grunn av kostnadene, møte væske håndteringskrav, og som resulterer i mindre kryssreaktivitet med administrerte forbindelser. I våre studier, genererte vi 3D kulturer av normale og tumorigene bryst epitelceller egnet for robuste celle levedyktighet avlesninger i hovedskjermbilder og sekundær hit bekreftelse. Kulene ble også funnet å være mottagelig for tradisjonelle biokjemiske og cellebiologiske teknikker (f.eks immunoblottingforsøk og farging), slik at mekanistiske studier. Dermed bruker samme eksperimentelle format, er vi nå i stand til å direkte sammenligne normale celler til kreftceller i 3D kultur.
I denne studien sammenlignet vi følsomheten til normal og svulst bryst epiteliale cellelinjer til 89 klinisk relevante forbindelser i National Cancer Institute (NCI) Godkjent onkologi Drug Collection (ADC) [18]. Som forventet, ble det observert signifikant cytotoksisitet overfor både normale og tumorcellelinjer med en rekke medikamenter, men også identifisert mikrotubul-målsøkende midler og epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) inhibitorer som hovedklasser av forbindelser som viste preferanse cytotoksisitet mot tumorceller i løpet normale celler når de dyrkes i 3D. Vi har også generert 3D ko-kulturer av humane brysttumor epitelceller med stromal og endotelceller og i forhold til de som 3D ko-kulturer av stromal og endotelceller. ADC Biblioteket ble igjen vist ved hjelp av disse co-kulturer, denne gangen over fire konsentrasjoner og med forbedret robusthet av analysen. Resultatene av disse proof-of-concept skjermer indikerte at 3D kulturer og co-kulturer kan være verdifulle verktøy for å identifisere klinisk nyttige legemidler, inkludert molekylært målrettede agenter med selektivitet for tumorceller enn normale celler som har potensial til å redusere skadelige side -effects ofte observert med cytostatika.
Materialer og metoder
Komponenter og reagenser
Godkjent onkologi Drug Collection (ADC) ble hentet fra Developmental Therapeutics Program National Cancer Institute . Samlingen inneholder 89 stoffer, alle vedlikeholdt på 10 mm i 100% DMSO. For mer informasjon, se: https://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/oncology_drugset_explanation.html [18]. Hoechst 33342 ble kjøpt fra Invitrogen (H3570), vinblastin og vinorelbin fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og lapatinib, gefitinib, dasatinib, og Tyrphostin AG1478 fra LC Labs (Woburn, MA).
celler og antistoffer
MCF-10A-celler, BT-474-celler og humane forhudsfibroblaster (Hs.58) ble oppnådd fra ATCC. MCF-10A-celler ble dyrket i DMEM 50/50 /F12, 5% FHS, 1 ug /ml hydrokortison, 5 ug /ml insulin, 5 ng /ml rhEGF, og penicillin, streptomycin og glutamin (PSG) kosttilskudd. BT-474-celler ble dyrket i RPMI med 10% FCS og humane fibroblaster (HFS) ble dyrket i DMEM med 10% FCS og PSG. Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) ble oppnådd fra Lonza (Walkersville, MD), og dyrkes i Lonza s Endothelial Cell Basal Medium (EBM-2) supplert med EGM-2 singlequots (CC-3124). Den CD31 antistoff (klone JC70A) ble hentet fra Dako North America, Inc. (Carpinteria, CA) (# M0823) og brukes på en 1:50 fortynning, er vimentin antistoff (V2122-11E) fra USA Biologisk (1:200 fortynning ), den β-aktin-antistoff (klon AC-40) fra Sigma (1:5000 fortynning for IB) og HER2-antistoff (554 299) fra BD Biosciences (1:1000 fortynning). Den fosfor-HER2-antistoff (klone 6B12) (1:100 fortynning for IF, 1:1000 for IB), fosfor-EGFR-antistoff (klone D7A5) (1:100 fortynning for IF, 1:1000 for IB), og total EGFR antistoff (klone C74B9) (1:1000 for IB) ble alle kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA).
Cell dyrkningsforhold i 2D eller 3D
MCF-10A, BT- 474, humane fibroblaster eller HUVECs ble opprettholdt som monolagskulturer i de media som er beskrevet ovenfor. For å generere 3D miniatyr kulturer for HTS ble cellene sådd på en celle nummer observert å konsekvent danne en enkelt, jevnt runde spheroid. BT-474-celler ble sådd ut ved 3000 celler /brønn (i RPMI + 10% FBS + PSG medium) og MCF-10A-celler på 1000 celler per brønn (50/50 i DMEM /F12, 5% FHS, 1 ug /mL hydrokortison, 5 ug /ml insulin, 5 ng /ml rhEGF, PSG) i 96-brønners rundbunnede ultralav festeplater (Corning # 7007). Over en førtiåtte timer kuler selv-montert fra seeded celler, en celleklump (av ~250 mikrometer i diameter) per brønn. Sfæroidene som overstiger 200 mikrometer i diameter ble funnet å ha hypoksiske celler lokalisert på innsiden av den sfæroide [ved hjelp av deteksjonsreagensen hypoxyprobe, NPI Inc. (data ikke vist)]. Den levedyktighet av cellene komponere kulene ble kontrollert ved hjelp av ATP som en avlesning og cellene ble funnet å opprettholde levedyktighet i minst fem dager etter plating uten å måtte endre medium eller legge til kosttilskudd. For HTS kulturer i 2D, felles vev kultur-belagt, flatbunnede 96-brønners plater (Corning # 3595) ble brukt til å dyrke celler, i de samme mediene og på samme cellekonsentrasjoner som er nevnt ovenfor.
For ko-kulturer i 3D, ble trypsinert cellene tellet og blandet sammen for å bli sådd ut i 96-brønners rundbunnede ultralav festeplater (Corning # 7007). Som indikert i legendene, ble enten det totale celle nummer holdes på 3000 celler per brønn, eller 3000 BT-474 celler ble sådd sammen med 1500 HFS og /eller HUVECs. Som vi har observert med monotypisk kulene, co-kulturer også spontant dannet en spheroid per brønn i løpet av 48-timers inkubasjonstid. Ved analyse av ATP nivåer, co-kultur kulene var levedyktig i 5 dager uten et medium endring eller tilsetninger. Alle co-kulturene ble opprettholdt i et 01:01:01 blanding av RPMI: DMEM: EGM-2 komplett media. 2D-ko-kulturer ble sådd ut på det samme forholdet av celler i det samme blandede medium, men i flatbunnede 96-brønns vevskulturplater (Corning # 3595). Førti-åtte timer etter plating ble 2D- eller 3D-celler brukes for cytotoksisitetsassayer, screening, eller farging som beskrevet i påfølgende metoder seksjoner.
Cvtotoksisitetsmålinq
Celler ble belagt som beskrevet for 2D eller 3D-kultur, og deretter behandlet med forbindelsene ved den indikerte konsentrasjon i 48 timer. For å kvantifisere cellular ATP som et mål på levedyktighet, 50 ul av CellTiter GLO-reagens (Promega) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble orbitalt ristet i 15 minutter ved værelsetemperatur for å lette lysis. I tillegg ble sfæroider triturert seks ganger for å fremme fullstendig lysis. Vel innholdet ble overført til en hvit-bottom 96-brønns plate og lese på en Bio-Tek luminescens plateleser.
Immunofluorescent analyse av sfæroide seksjoner
Spheroids ble løst i 1 time i sink formalin , vasket i PBS, og deretter frosset i oktober (Takeda) for cryostat seksjonering. Ti mikron snitt ble montert på objektglass og farget med passende primære antistoffer i 1 time ved 37 ° C. Etter tre grundige vaskinger i 1X TBS + 0,2% Tween-20, ble platene inkubert med anti-mus Alexa 488 (Invitrogen) ved 1:500 fortynning, anti-kanin Alexa 594 (Invitrogen) ved 1:750 fortynning og Hoechst 33342 i en 1:10,000 fortynning i 1 time ved 37 ° C. Platene ble vasket og montert med Vectashield (Vector Laboratories).
Mikroskopi og 3D-gjengivelse
Lysfelt eller fluorescerende bilder (10x) ble oppnådd ved en AI Observer Zeiss mikroskop med fotometriske Coolsnap HQ
2camera. Confocal (BD CARVII) optisk snitting ble utført på z-serien er fanget i 4 micron trinn, og deretter utsatt for 3D deconvolution via Autoquant (Media kybernetikk) programvare, og visualisert i Metamorph sin 4D viewer (MDS Analytical Tech).
Screening protokoller
Godkjent onkologi Drug Collection hentet fra National Cancer Institute ble brukt i skjermene. For enkel konsentrasjon punkthovedskjerm ble BT-474 celler sådd med 3000 celler /brønn (i RPMI + 10% FBS + PSG medium) og MCF-10A celler på 1000 celler per brønn (i 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 0,5 ug /ml hydrokortison, 5 ug /ml insulin, 5 ng /ml rhEGF, PSG) i 96-brønners Corning # 3595 (for 2D) eller Corning # 7007 (for 3D) platene. Utvannings plater ble laget ved å fortynne forbindelsene 1:01 med 50% medium /50% DMSO for å gi en endelig konsentrasjon på 5 uM per brønn. Førti-åtte timer etter plating ble cellene behandlet med den bibliotek av forbindelser. Etter 48 timer med forbindelse inkubering ble cellene lysert med 50 pl CellTiterGLO (Promega) reagens med 15 minutters orbital rister ved romtemperatur. 75 mL av løsningen ble overført til Greiner Lumitrac plater og lese på en BioTek luminescens plateleser.
For de co-kultur skjermer, ble serie fortynning primærscreening brukes. Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater ved 1500 HF + 1500 HUVEC-celler per brønn for human-fibroblast-og human endotelcelletype (HF + He) ko-kulturer (i EGM-2 komplett medium), eller 750 HF + 750 HUVEC + 1500 BT-474 for BT-474 + HF + han co-kulturer (i 01:01 RPMI + 10% FBS + PSG: EGM-2 komplett medium). Celler seeded i Corning # 7007 rund bunn, ultra-lave festeplater dannet et enkelt 3D spheroid per brønn mens celler seeded i Corning # 3595 flat bunn, vev kultur behandlet plater festet som en 2D enkeltlag. Etter 48 timers inkubering for å tillate sfæroide formasjon eller celleadhesjon, ble cellene behandlet ved hjelp av en STAR væskebehandler med 1 mL av forbindelsen. Her ble godkjent onkologi Drug Collection anvendes for fremstilling av master-platene via fortynning med DMSO ved å benytte et STAR væskebehandler til 10 mM, 1 mM, 100 uM, og 10 uM lagerplater for å behandle cellene med fire forskjellige sluttkonsentrasjoner (100 uM, 10 uM, 1 uM og 0,1 uM). Lapatinibs ble tilsatt til hver fortynning plate for en positiv kontroll, for å gi slutt i-brønn konsentrasjoner på 10 uM, 1 uM, 0,1 uM og 0,01 uM. Førti-åtte timer senere ble 50 mL av CellTiterGLO (Promega) reagens tilsatt i hver brønn med en Multi Combi. Platene ble rystet i 15 minutter for å stimulere cellelyse. Sfæroid lysis ble ytterligere hjulpet ved å blande 100 ul av volumet ved hjelp av STAR væskebehandler, og deretter 75 ul ble overført til en Greiner Lumitrac 96-brønners plate for luminescens avlesning på et PE Envision plateleser. For de monolagsplater, ble 75 mL overført til Greiner Lumitrac plater per brønn, og også lese på PE Envision.
Resultater og Diskusjon
Screening av 3D kulturer avslører tumorcelle selektivitet for visse legemiddelklasser
for å finne ut om menneskeceller dyrket i 3D kultur tilbudt en fordel fremfor 2D kulturer for å identifisere anti-tumor forbindelser med større selektivitet for kreftceller enn normale menneskelige celler, optimalisert vi forholdene til å vokse og skjermen bryst epiteliale celler i to forskjellige multibrønn formater. For å danne 3D sfæroider, 96-brønners U-bunn ultralave festeplater ble anvendt. Dette oppmuntret cellene tilsatt til hver brønn for å samle sammen og danner en enkelt celleklump, siden de ikke kan feste seg til brønnflater (figur 1A). 2D-monolag ble dyrket i typisk vevskultur-behandlede, flatbunnede 96-brønners plater (figur 1B). Viktigere, ble brystkreft epitelceller (BT-474) og ikke-transform bryst epitelceller (MCF-10A) håndteres og satt på samme måte i de to forskjellige multi-brønn formater, minimere andre variabler som kan påvirke narkotika potens. Cellene ble platet ut, behandlet 48 timer senere med en endelig konsentrasjon på 5 uM av forbindelse (fra NCI godkjente onkologi Drug Collection bibliotek), og analysert for ATP-innholdet ytterligere 48 timer senere (figur 1C). Den 48 h tidspunkt etter plating ble valgt basert på den tiden som trengs for kulene for å danne og oppnå reproduserbare kompakthet (basert på spheroid diameter) i hver brønn. 48 timers tidspunkt etter medikamentbehandling ble identifisert som den optimale tid for å observere medikament-indusert celledød, som mellom endringer legge til ekstra utgift til HT-analyser og lengre inkubasjoner resulterte i ubehandlede celler som utviser celledød som følge av utmattelse av mellom næringsstoffer og oppbygging av avfallsprodukter.
A, en sfæroide per brønn ble dannet i 96-brønners rundbunnede ultra-lav festeplatene. Lysfelt mikrografer av typiske BT-474 og MCF-10A kuler vises 48 timer etter plating,
bar, etter 200 mikrometer. B, 2D-monolagskulturer ble innstilt ved hjelp av den samme celle nummer som i de runde bunnplatene (3000 celler /brønn for BT-474 eller 1000 celler /brønn for MCF-10A) i flat bunn, vevskultur-belagte 96-brønners plater . Fluorescens bilder vises på typisk BT-474 og MCF-10A monolayers 48 timer etter plating, farget for aktin (rødt) og DNA (blått),
Bar i henhold til 3D-forhold, MCF-10A-celler var relativt ufølsomme for disse forbindelser (EC50 5 um). De MCF-10A celler dyrket som 2D monolag i sin tur utstilt EC50-verdier mindre enn 5 mikrometer etter behandling med lapatinib eller dasatinib. Som i den primære skjermen, de BT-474 celler viste følsomhet (EC50 10 mm) under begge dyrkningsforhold for disse forbindelsene (tabell 1, figur 2A), og dermed en selektivitet for BT-474 celler i løpet av MCF-10A celler det ble ikke observert i henhold til 3D-dyrkningsbetingelser, med EC50-verdien for lapatinibs mindre enn 1 pM i BT-474-celler og 9,8 uM i MCF-10A-celler (tabell 1). De beregnede EC50 verdiene for gefitinib og dasatinib var litt over 5 um (6-8 mm), som kan være på grunn av annen kilde av forbindelser som brukes til de bekreftende respons analyser dose i forhold til den primære skjermen (NCI sin ADC bibliotek versus LC Labs; NCI bibliotek formatet tillater sammensatte bruk for primærscreening bare).
A, konsentrasjon-responskurver ble samlet inn via BT-474 eller MCF-10A celler satt og behandlet i tre eksemplarer med lapatinib, gefitinib, eller dasatinib som beskrevet i materialer og metoder, og prosent levedyktighet ble beregnet ut fra luminescens målingene representerer ATP innhold og normalisert til kjøretøy-behandlede kontrollceller. B, konsentrasjon-responskurver ble generert fra BT-474 og MCF-10A-celler satt og behandlet i tre eksemplarer med vinblastin eller vinorelbin. Alle kurvene er representative data for minst to eksperimenter utført i tre eksemplarer.
microtubule målretting midler «vinblastin og vinorelbin hadde også scoret som positive «treff» i vår primære skjermen, som viser svak selektivitet for BT-474 celler i løpet av MCF-10A celler under 3D dyrkningsforhold. Resultatene oppnådd med vinblastin og vinorelbin i den primære skjermen resultatene ble ikke lett bekreftet i dose-responsstudier, men (Tabell 1, figur 2B). Mens vinblastin gjorde viser større selektivitet for BT-474 celler, spesielt når vokst som 3D kulturer, EC50 verdiene vi observerte var alle 5 um (Tabell 1, Figur 2B, venstre panel). I konsentrasjon-respons eksperimenter, vinorelbin var faktisk en hit i de BT-474 celler, men ikke i MCF-10A celler dyrket i 3D (tabell 1, figur 2B, panel til høyre). Men under 2D dyrkningsforhold, observerte vi EC50-verdier mindre enn 5 mikrometer for begge cellelinjene, selv om vi ikke identifisere vinorelbin som en «hit» for MCF-10A celler i den primære skjermen. For å fastslå om eventuelle uregelmessigheter skyldes permeabiliseringen problemene, har vi også bekreftet at små fluorescerende fargestoffmolekyler, av tilsvarende størrelse til mange medikamenter kan faktisk trenge inn i den sfæroide kjerne (data ikke vist).
Til sammen vår studier viser at det er mulig å identifisere tumor-selektive forbindelser ved å påføre en strategi som benytter informasjon fra både 2D og 3D cytotoksiske skjermer. På grunn av det faktum at vår proof-of-concept studie innebærer et bibliotek som består av kjente bioaktive forbindelser, kan de observerte forskjeller i følsomhet mellom normale og kreft epitelceller ikke nødvendigvis være stor nok til å sikre at de ville være nyttig i en HTS omgivelser. En objektiv skjerm med en større små-molekyl biblioteket vil sannsynligvis gi ulike og potensielt mer informative resultater. Også, og som demonstrert av våre oppfølgingsstudier, en tradisjonell HTS som tester forbindelser i en enkel konsentrasjon kan være tynget av falske positive og falske negative og krever omfattende oppfølging testing. Et nytt paradigme, kvantitative HTS (qHTS), genererer konsentrasjon-respons kurver for testforbindelsene i en enkelt eksperiment, og vil sannsynligvis redusere disse problemene, og kan være en metode for valg for en hurtig screening av nye anti-cancer forbindelser [19].
Co-kultur modeller av normal vs kreftceller har ulik narkotika følsomhet i 3D vs 2D
for å ytterligere forbedre våre screeningmetoder, forsøkte vi å finne ut om humane kreftceller dyrket som 3D co -cultures med støtte celler så som fibroblaster og endotelceller kan vise seg å være mer nyttig ved identifisering målrettet (og, generelt, mindre toksisk) forbindelser. Vi antok at ko-dyrking av tumorceller med fibroblaster og endotelceller kan påvirke mikromiljøet av 3D-kultur og således påvirke medikamentsensitivitet. Svulsten mikromiljøet, inklusive stromale faktorer som fibroblaster og endotelceller, spiller en viktig rolle i tumorprogresjon og metastasedannelse [20]. I normalt vev, blir epitelceller adskilt fra stroma ved interaksjon med basalmembranen. I ko-kulturer beskrevet heri, BT-474-celler interaksjon direkte med fibroblaster og endotelceller, som kan observeres i avansert brystkreft som invasivt duktalt karsinom [6], og disse kultursystemer kan derfor bedre etterligner svulsten mikromiljøet av avansert kreft . Mange forskere utnytte laminin-rike basalmembran ekstrahert fra Engelbreth-Holm-sverm mus sarkom (Matrigel) for å fremme vekst av celler i 3D [3], [5] eller i xenograft-modeller, men på bekostning av dette reagenset ville være uoverkommelige for en HT-skjerm og kan potensielt forstyrre visse analyseleselig. Således vår modell som benytter humane fibroblaster og endotelceller til å understøtte veksten av tumor epitel-celler i 3D ble utviklet som et kostnadseffektivt og praktisk alternativ.
Vi utnyttet vårt modellsystem for å sammenligne ko-kulturer inneholdende tumor celler til å co-kulturer mangler tumorceller. BT-474 cellelinjen var co-dyrket i 2D eller 3D (figur 3A, øverst til venstre og høyre, henholdsvis) med normale humane fibroblaster og normale humane endotelceller (BT-474 + HF + HE). Interessant, observerte vi at under ko-kultur i 3D, celletypene gjentatte ganger selv-sammenstilt til en struktur hvor BT-474-tumorceller omgitt av en kjerne av fibroblaster og endotelceller. Disse tumor-celle-inneholdende ko-kulturer ble sammenlignet med 2D eller 3D (figur 3A, nederst til venstre og høyre respektivt) ko-kulturer inneholdende bare de normale humane fibroblaster og endotelceller (HF + HE). De CD31-positive endotelceller fremsto som skipslignende formasjoner i HF + HE kulturer som ligner på det som tidligere er rapportert i 3D co-kulturen med hud fibroblaster og HUVECs [21].
a, Immunofluorescent bilder av faste og farget 2D (venstre panel) og faste, seksjonert og farget 3D (høyre panel) co-kulturer farget for endotelceller markør CD31 (grønn), fibroblast-rik protein vimentin (rød), og alle cellenes kjerner (blå),
barer,
200 mikrometer. De øverste de fleste paneler er BT-474 + HF + han co-kulturer, seeded med 1500 BT-474 + 750 fibroblaster + 750 endotelceller per brønn. Bunnplatene er HF + han co-kulturer, sådd med 750 fibroblaster + 750 endotelceller. B, skjematisk av fire-konsentrasjonen screening-protokollen i BT-474 + HF + HE og HF + HE celler dyrket i 3D eller 2D. C, Z «verdier som genereres fra en eller to 96-brønners plater satt, inkuberes, og håndteres som beskrevet for skjermen for 2D BT-474 + HF + HE-celler (øverst til venstre panel), 2D HF + HE-celler (øverst til høyre panel), 3D BT-474 + HF + HE-celler (nederst til venstre panel), 3D HF + HE-celler (panel nederst til høyre).
skjermen på BT-474 + HF + HE og HF + HE kulturene ble utført over fire forskjellige konsentrasjoner av den NCI s ADC bibliotek, som resulterer i slutt i brønner konsentrasjoner på 100, 10, 1 og 0,1 um (figur 3B). På grunn av det store antallet av 96-brønners plater som kreves for å screene ved fire forskjellige konsentrasjoner, ble mer automatisering anvendt enn i den foregående skjerm av monotypisk BT-474 og MCF-10A cellekulturer. For å sikre at analysen var sterk nok for semi-automatisert screening, ble Z-verdiene beregnet for både co-dyrkningsforhold i 2D og i 3D for å kvantifisere den statistiske reproduserbarheten av analysen basert på et middel av de maksimale og minimale signaler som mottas i hver brønn på tvers av flere plater. Denne standarden beregning utføres for å sikre at hver brønn avgir et tilsvarende utgangs (kjemiluminescens som angir ATP-innholdet og dermed levedyktighet for denne skjermen), slik at når forbindelser tilsettes, er sannsynlig å være et resultat av forbindelsens virkning på en reduksjon i kjemiluminescensen celleviabilitet og ikke bare variasjon på tvers av de individuelle brønner. Vi observerte Z «verdier større enn 0,7 på tvers av alle co-dyrkningsforhold (Figur 3C), og dermed demonstrerer en utmerket ytelse for høy gjennomstrømming screening.
Resultatene fra co-kulturen skjermen ble analysert ved hjelp av en to- lagdelt tilnærming. For det første treff ble definert som forbindelser som ga 50% levedyktighet ved en hvilken som helst av de fire konsentrasjoner som ble testet, i en hvilken som helst av de kulturbetingelser. Med et slikt lavt nivå av stringens, var 57 av de 89 forbindelser som finnes som «treff» i den primære skjermen (data ikke vist); igjen en forståelig resultat basert på innholdet av biblioteket. For det andre, ble konsentrasjons-responskurver generert for hver forbindelse under hver kultur tilstand, og EC50-verdier ble tildelt der dette er aktuelt. Vi minelagt EC50 data for å identifisere forbindelser som viste større giftighet mot kreft celle co-kulturer (BT-474 + HF + HE) enn den normale celle co-kulturer (HF + HE) når dyrket i 3D, med begrunnelsen at vår langsiktige målet er å bruke disse kulturene til å identifisere nye anti-tumor terapi med selektiv toksisitet mot svulstvevet, mens sparsom normalt vev. Tolv forbindelser utstilt større selektivitet for 3D BT-474 + HF + HE celler enn 3D HF + HE-celler (tabell 2), inkludert, nok en gang, en rekke forbindelser som er rettet mot reseptor tyrosin kinaser eller mikrotubuli.
Vi fulgte opp den primære co-kultur skjerm med en sekundær konsentrasjon-respons-analyse for å bekrefte de tolv treff oppført i tabell 2. forbindelsene ble cherry-plukket fra mester bibliotek platene forberedt på skjermen, og brukes til å utføre konsentrasjon-respons eksperimenter over samme tid kurs (48 timer med behandling). [25].
