Abstract
For å forstå effektene av samspillet mellom Mycoplasma og celler på verten cellular funksjon, er det viktig å belyse påvirkning av infeksjon av celler med Mycoplasma om atom enzymer som DNA topoisomerase type I ( Topo I). Menneskelig Topo jeg deltar i DNA transaksjonsprosesser og er målet for anti-kreft narkotika, de camptotheciner (CPTs). Her undersøkte vi om mekanismen hvorved infeksjon av humane tumorceller med
Mycoplasma fermentans
påvirker aktiviteten og ekspresjon av celle Topo I, og den anti-kreft effekt av CPT. Humane kreftceller ble smittet eller behandlet med levende eller ultralydbehandlet
M. fermentans
og aktivitet og uttrykk av Topo jeg var fast bestemt på.
M. fermentans
vesentlig redusert (med 80%) Topo-I-aktivitet i de infiserte /behandlede tumorceller uten å påvirke nivået av Topo I-protein. Vi viser at denne reduksjonen i enzymaktivitet skyldes ADP-ribosylering av Topo I-protein ved poly-ADP-ribose polymerase (PARP-1). I tillegg ble Perk aktivert som et resultat av induksjonen av MAPK signaltransduksjonsbane ved
M. fermentans
. Siden PARP-1 ble vist å bli aktivert av Perk, konkluderte vi med at
M. fermentans
endrede cellulære Topo I-aktivitet ved aktivering av PARP-I via induksjon av MAPK signaltransduksjonsbane. Videre smitte av tumorceller med
M. fermentans
redusert den hemmende effekten av CPT. Resultatene av denne studien tyder på at endring av Topo Jeg aktivitet ved
M. fermentans
kan endre mobil genekspresjon og responsen av tumorceller til Topo I hemmere, påvirke anti-kreft kapasitet på Topo I antagonister
Citation. Afriat R, Horowitz S, Priel E (2013)
Mycoplasma fermentans
hemmer aktiviteten til Cellular DNA topoisomerase I. Aktivering av PARP1 og endrer Effekt av sin anti-kreft-hemmer. PLoS ONE åtte (8): e72377. doi: 10,1371 /journal.pone.0072377
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 09.07.2013; Publisert: 27 august 2013
Copyright: © 2013 Afriat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av Seed forskningsfond, Ben-Gurion University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mykoplasma, som tilhører den klasse Mollicutes, er de minste selvreproduserende eubacteria, blottet for et cellevegg og er omgitt bare av en plasmamembran. Deres lille genomstørrelse (varierer 580-1380 kbp) resulterer i begrenset metabolske evner og parasittisme [1], [2]. Mykoplasma kan finnes som parasitter i et bredt spekter av verter inkludert mennesker, dyr, insekter, planter og celler dyrket i vevskultur.
Hos mennesker er noen Mycoplasma arter funnet som commensal innbyggere, mens andre ble vist å være forbundet med infeksjonssykdommer og etter infeksjon patologier [3], [4].
de fleste av de kjente artene Mycoplasma er funnet som membranoverflaten parasitter, og nylig, noen ble vist å gå inn i celler og bli intracellulære beboere [5].
Mycoplasma kan føre til kroniske infeksjoner på grunn av sofistikerte mekanismer for unndragelse fra immunovervåkning (dvs. molekylær mimikk, en unik type antigen variasjon), opp-regulering eller nedregulere cytokinutskillelse, adhesjonsmolekyler uttrykk, transkripsjonsfaktorer uttrykk, kinaser MAP aktivitet, apoptotiske reaksjonsveier, og mer [2], [3].
Nylig har mange rapporter sterkt støttet evne Mycoplasma til å forårsake eller fremme onkogen transformasjon [6 ] -. [9], og jakten på koblingen mellom Mycoplasma og kreft blir nå undersøkt [10]
lipoproteiner (LPMf) av
Mycoplasma fermentans
, en human patogen, var grundig undersøkt i løpet av det siste tiåret. LPMf ble vist å påvirke funksjonene til immunsystemceller ved å indusere ekspresjon av onkogener [1], noe som påvirker flere faktorer som deltar i signaloverføringsproteiner [11] – [13], transkripsjon [14], og den apoptotiske prosess [11], [15], [16].
M. fermentans
ble vist å hemme apoptose prosess indusert av tumornekrosefaktor α (TNFa) [17], [18]. Alle disse har ført til den antagelse at infeksjon av tumorceller ved Mycoplasma kan påvirke aktiviteten, og ekspresjon av essensielle atom enzymer så som topoisomeraser, som er mål for en rekke anti-kreft medikamenter og således interfererer med anti-kreft effekt av disse stoffene. DNA topoisomeraser er en familie av viktige kjernefysiske enzymer som er ansvarlig for å kontrollere den topologiske tilstand av DNA-molekyler. De deltar i de fleste DNA-transaksjoner som replikasjon, transkripsjon, rekombinasjon, og kromatin remodellering [19] – [21]. DNA-topoisomeraser er klassifisert som enten type I (spaltes en tråd av DNA) eller type II (spalter to tråder av DNA). Begge enzymtypene er videre inndelt i undergrupper i henhold til strukturelle og funksjonelle egenskaper. Medlemmer av hver familie av enzymer som er forskjellige i sekvens, struktur, funksjon og [22].
Den katalytiske aktiviteten til DNA-topoisomeraser involverer dannelsen av forbigående kovalente broer av enzym-DNA komplekser. En tyrosyl gruppe i det aktive setet av enzymet angriper en fosfodiester-binding til DNA-ryggrad og forblir kovalent bundet til en side av bruddet, og etterlater en motsatt fri hydroksylgruppe (OH) ende som gjør det mulig religering trinnet, etter DNA-topologi er løst, ved et andre nukleofilt angrep av det kovalente enzym-DNA-fosfotyrosin-binding, frigjør enzym for den neste katalytiske syklus. Involvering av disse enzymene i essensielle cellulære prosesser merket topoisomeraser som et viktig mål for anti-kreft-behandling og for å utvikle potente, mer effektive, antikreftmidler [22], [23]. Den cytotoksisitet av topoisomeraser hemmere som camptothecin (CPT) og dets derivater TPT og CPT-11 (som er godkjent for klinisk bruk), stammer fra deres evne til å stabilisere spaltbare kompleks av Topo-DNA, som introduserer enkle og doble trådbrudd i DNA [21], [24], [25]. Topoisomerase-aktivitet påvirkes av en rekke post-translasjonelle modifikasjoner, blant dem fosforylering, poly-ADP-ribosylering og ubiquitinering. Nyere arbeider utført i vårt laboratorium viste O-GlcNAcylation av Topo IB, noe som påvirker dens aktivitet [26].
fosforylering av DNA topoisomerase I ved kasein kinase II (CK II) og proteinkinase C (PKC) oppregulerer enzymet DNA avslapping aktivitet, mens defosforylering med alkalisk fosfatase inhiberte denne aktiviteten. I tillegg ble poly-ADP-ribosylering av poly-ADP-ribose polymerase (PARP-1) av enzymet protein funnet å ned-regulere aktiviteten [20], [27]. PARP-1 er kjent for å bli aktivert av DNA-bryter; imidlertid nylig, ble det rapportert at PARP-1 kan aktiveres ved fosforylert ERK2 i fravær av spenningsforhold eller skade på DNA [28]. I nyere studier ble Mycoplasma vist seg å være i stand til å aktivere forskjellige MAPK, såsom SAPK /JNK, p38, NF-kB, AP-1, og ERK 1/2 i respons til Mycoplasma-avledet membran lipoproteiner [11], [29] – [31]. Derfor er det viktig å undersøke muligheten for at mobilnettet Topo jeg og effekten av CPTs som anti-kreft agenter kan bli påvirket av Mycoplasma infeksjon.
Materialer og metoder
Cells
menneskelig brystkreftcellelinjer -MCF7 (American Type Culture Collection, HTB-22) og menneskelig glioblastom cells- U251 (HTB-17) vennlig mottatt fra Porgador A, Ben-Gurion University. Celler ble dyrket som monolag i DMEM og RPMI 1640-medium (Biological Industries, Beith HaEmek, Israel), henholdsvis, supplert med 10% føtalt bovint serum, 50 IU penicillin, 50 ug /ml streptomycin og L-glutamin (0,29 μγ /ml ). Cellelinjer ble dyrket i en fuktet inkubator supplert med 5% CO
2 ved 37 ° C.
enzymer, antistoffer og forbindelser
Stamløsninger av Camptothecin (Sigma, Israel) i 20 mM (oppløst i 100% DMSO) ble lagret i alikvoter ved -70 ° C og fortynnet i DMSO før de tilsettes til reaksjonsblandingen eller til cellekulturmediet. Supercoil DNA plasmid pUC19 ble kjøpt fra MBI Fermentas (Hanover, MD, USA). PD98059 og 3-aminobenzamid (3AB) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)
Den primære antisera var som følger:. Monoklonalt mus anti-β-aktin-antistoff (MP Biomedicals, LLC); geite-polyklonal IgG (C-15) anti-topo I, muse-monoklonalt IgG antiphospho-ERK (E-4), og kanin-polyklonal IgG anti-ERK (C-16) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA); musmonoklonale anti-poly-ADP ribose antistoffer (Serotec, Oxford, UK); og geit anti-mus og anti-kanin IgG andre antistoffer (Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA). For immunoutfellingsstudier analyser, ble anti-Topo jeg antistoff avledet fra sklerodermi pasientserum som brukes (TopoGene, Florida, USA).
Forbedret chemiluminescence (ECL) reagenser ble kjøpt fra Biologiske Industries (Beit HaEmek, Israel).
Mycoplasma Vekst
M. fermentans belastning
K7 ble dyrket i SP4 buljong ved 37 ° C og 5% CO
2 til log fase. En ml aliquoter inneholdende 2 x 10
8 kolonidannende enheter (CFU) ble holdt frosset ved -70 ° C inntil anvendelse. For hvert forsøk ble en alikvot tint, dyrket i SP4 kjøttkraft ved en fortynning på 1/10 til 24 timer (37 ° C, 5% CO
2), etterfulgt av videre fortynning av 1/50 til en log fase var observert (etter ca. 24 timer). Den nøyaktige mengden av
M. fermentans
ble bestemt ved å telle CFU, som tidligere beskrevet [32], [33].
mycoplasmal Protein Pakk Utarbeidelse
M. fermentans
ble dyrket som ovenfor; 500 ml kulturen ble pelletert (13 000 x g, 30 min ved 4 ° C) og vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS). Pelleten ble deretter resuspendert i PBS. CFU /ml ble bestemt, og de re-suspenderes pellet ble lagret ved -70 ° C for videre eksperimenter. Frosne pellets av
M. fermentans
ble tint og sonikert ved 4 ° C i 4 x 30 sek ved 80% effekt (50% arbeidssyklus; Heat Systems Ultrasonics, Inc.) i nærvær av proteaseinhibitoren phenylmethylsulphonyl-fluorid (PMSF; 0,001 M). Disse betingelsene for lydbehandling resulterte i en ikke-live mycoplasmal forberedelse (ingen vekst ble observert i gjentatte dyrknings prosedyrer). Proteinkonsentrasjonen av den sonikert
M. fermentans
ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalysesett (Richmond, CA); 1 × 10
8 CFU samsvarer med 10 mikrogram mycoplasmal protein.
Behandling av ondartede cellelinjer med live
M.
fermentans
eller
M. fermentans
Total protein
MCF7 og U251-celler, på forhånd var vasket en gang med PBS (1200 rpm, 5 min ved 4 ° C) og re-suspendert i en ny kulturmedium ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 celler /ml, ble dyrket i 96-brønns sterile plater (Corning Inc., Corning, New York) ved en sluttkonsentrasjon på 4 x 10
4/200 ul /brønn. Lev
M. fermentans
ved log fase, på forhånd var vasket en gang i PBS (13 000 x g, 30 min ved 4 ° C), og re-suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10% inaktivert FCS, 1% penicillin og 1% glutamin, ble det tilsatt til cellekulturer på MOI 1000:1 (4 × 10
7 CFU /brønn). De ko-kulturer ble inkubert i fem timer ved 37 ° C, 5% CO
2. For eksperimenter med
M. fermentans
totalt protein, en konsentrasjon på 20 ug /ml (svarende til 2 x 10
8 CFU) ble tilsatt til de undersøkte tumorceller (2 x 10
5 celler /ml) i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO
2.
DNA Forsterkning av
M. fermentans
ved revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) Ved hjelp av en nukleotidsekvens innenfor Insertion Sequence-Like Element
Total RNA ble ekstrahert fra den infiserte MCF7 og U251 celler ved hjelp TRI Reagens (T9424, Sigma- Aldrich, Rehovot, Israel), deretter reversere transkribert ved hjelp av en mikrogram total RNA fra de undersøkte celler med Oligo-dT primer, ved hjelp RevertAid Kit (K1621, Fermentas, Vilnius, Litauen). Diverse cDNA isolert fra
M. fermentans
-infected celler for ulike intervaller (1,5, 3, 6, 12 og 24 timer) ble forsterket ved hjelp REDTaq Ready Mix (R2523, Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Sekvenser av det syntetiske oligonukleotid primerpar (RWO04 og RWO05) brukes for spesifikke DNA forsterkning av
M. fermentans Hotell og sine posisjoner i Insertion Sequence-Like Element (IS-lignende element) ble tidligere beskrevet [34]. Primersekvensene og størrelser av PCR-produktene var som følger: RW004 Primer (24 nt): 5’GGA CTA TTG TCT AAA CAA TTT CCC og RW005 Primer (24 nt): 5’GGT TAT TCG ATT TCT AAA TCG CCT. Størrelsen av den diagnostiske DNA-båndet er 206 bp. Den termiske sykluser profilen til forsterkning omfattet 40 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder (240 sekunder i den første syklus), 62 ° C i 60 sekunder og 72 ° C i 60 sekunder (øket til 10 minutter etter den siste syklus). PCR-produktene ble synliggjort på en 1% agarosegel farget med etidiumbromid.
Nuclear proteinekstrakter Fremstilling
Nuclear ekstrakter for topoisomerase analyser og Western blot-analyse fra MCF7 og U251-celler ble fremstilt som tidligere beskrevet [27], [35] – [40] og en blanding av protease-inhibitorer (sluttkonsentrasjoner: 2 ug /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin A, 2 ug /ml antipain, 100 ug /ml PMSF) ble tilsatt til utvinning buffere. Totalt proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad Lab, CA, USA).
Bestemmelse av nivået på Topo jeg Protein ved Western Blot analyse
Like mengder av nukleære proteiner fra Mycoplasma behandlede eller ubehandlede MCF7 og U251-celler, ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av enten anti-Topo i-antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc.) eller anti-β-aktin-antistoffer (MP Biomedicals, LLC) som beskrevet tidligere [36], [39], [41]. De immunokomplekser ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (ECL).
Topo I Analyse
Topo I-analysen ble utført som tidligere beskrevet [26], [37]. Økende konsentrasjoner av nukleære proteiner ble tilsatt til en Topo I reaksjonsblanding inneholdende, i et sluttvolum på 25 ul: 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM ditiotreitol, 20 mM KCl, 10 mM MγCl
2, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 30 ug /ml bovint serumalbumin og 250 ng pUC19 supercoil DNA-plasmid (MBI; Fermentas, Hanover, Maryland). Etter inkubasjon ved 37 ° C i 30 minutter, ble reaksjonen avsluttet ved å tilsette 5 ul av stoppe-buffer (sluttkonsentrasjon: 1% natriumdodecylsulfat, 15% glycerol, 0,5% bromfenolblått, og 50 mM EDTA, pH 8). Reaksjonsproduktene ble analysert ved elektroforese på en 1% agarosegel ved bruk av Tris /borat /EDTA-buffer (89 mM Tris-HCl, 89 mM borsyre, og 62 mM EDTA) ved 1 V /cm, beiset med etidiumbromid (1 pg /ml) og fotografert med en kortbølget UV-lampe ChemiImager ™ 5500 utstyr (Alpha INOTECH Corporation, San Leandro, CA). Densitometrisk analyse av resultatene ble utført med EZ-Quant-Gel analyseprogramvare (EZ-Quant, Rehovot, Israel), og prosentandelen av Topo I-aktivitet ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning: (1 – (prøve /kontroll)) x 100 [37].
Immunpresipitasjon analysen
mus monoklonalt anti-poly-ADP ribose (PAR) antistoff (MCA 1480) ble kjøpt fra Serotec (Oxford, UK). Like mengder av kjerneproteiner (200 pg), som var pre-kokt i 5 minutter, ble underkastet immunoutfelling med anti-humant Topo I antistoff (SC) ved et sluttvolum på 100 ul av kjernebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, og protease-inhibitorer: 2 ug /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin A, 2 pg /ml antipain, 100 ug /ml PMSF) . Blandingen ble rotert ved 4 ° C over natten. Protein A-Sepharose (0,1 g /ml) i TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) ble tilsatt i ytterligere 1 time. Prøvene ble sentrifugert ved 10000 x g i 2 minutter og kulene ble vasket tre ganger med TE-buffer. Pelleten ble resuspendert i 25 pl prøvebuffer (sluttkonsentrasjon: 7,5% glycerol, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% β-merkaptoetanol, og 0,025% bromfenolblått), kokt i 5 minutter, og sentrifugeres. Prøvene ble applisert på 7,5% SDS-PAGE, og Western blot-analyse ble utført under anvendelse av geite-polyklonal IgG (C-15) mot Topo I eller anti-poly-ADP-ribose (PAR) antistoffer.
Stripping av antistoffer fra nitrocellulosemembranen
membranen ble neddykket i en strippebuffer (100 mM 2-β-merkaptoetanol, 2% SDS, og 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7) etterfulgt av inkubasjon ved 50 ° C i 30 minutter med leilighetsvis omrøring. Membranen ble vasket to ganger med TPBS (31,25 mM Na
2HPO4, 12,5 mM Na
2HPO
4, 13,7 mM NaCl, 0,1% Tween) i 10 minutter ved romtemperatur.
Cell Cvtotoksisitetsmålinq
Celler (5000 /brønn, i tre paralleller) ble infisert med
M. fermentans
på 2 × 10
1-2 × 10
3 MOI for 6 timer, etterfulgt av behandling med 30 mikrometer CPT eller 0,01% DMSO for en ekstra 12, 24 eller 36 timer. Celle overlevelse ble undersøkt ved hjelp av Neutral Red analyse [42].
Statistical Analysis
Student
t
-test ble benyttet for å bestemme betydningen mellom eksperimentelle prøver og kontroller.
P
verdier 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant (*);
P
verdier 0,01 (**) og 0,005 (***) ble vurdert som svært viktig
Resultater
1.. Lev
M. fermentans
hemmer DNA Avslapping aktivitet av Topo jeg
Effekten av levende
M. fermentans
på aktiviteten av celle Topoisomerase I ble undersøkt i to typer cellelinjer: human brystkreft (MCF7) og glioblastom (U251). Celler ble infisert med levende
M. fermentans
på MOI av 10
3CFU /celle, for ulike intervaller (1,5, 3, 6, 12 og 24 timer). Nukleære ekstrakter ble fremstilt fra infiserte og ikke-infiserte celler og Topo I-aktivitet ble målt. Ekvivalente mengder av kjerneekstrakt proteiner ble tilsatt til en Topo I DNA avkobling prøveblanding inneholdende supercoil DNA-plasmid som substrat for enzymet; reaksjonsproduktene ble analysert ved agarosegelelektroforese. Topo I-aktivitet blir målt ved omdanning av supercoil plasmid til sine helt eller delvis avslappet formene [19]. Begge celletyper infisert av
M. fermentans
viste en betydelig nedgang, opp til 80%, i DNA avslapping enzymets aktivitet, sammenlignet med ikke-infiserte celler. En gradvis reduksjon av topo I-aktivitet ble observert begynt 1,5 timer etter infeksjon med
M. fermentans
, og toppen av reduksjonen i enzymaktivitet (80%) ble detektert ved 6 timer efter infeksjon. Betydelig reduksjon i DNA avslapping aktiviteten av Topo I ble også detektert 12 og 24 timer etter infeksjon (30-50% for MCF7, 25-40% for U-251, henholdsvis) (figur 1A-D). Imidlertid er graden av reduksjonen i topo I-aktivitet ble redusert med tiden, noe som tyder på at effekten av det signal som formidles av Mycoplasma er svekket, som tidligere ble vist for Mycoplasma-mediert signaltransduksjonsveier [31], [43]. For å bekrefte at cellene faktisk var infisert, og den observerte effekten er på grunn av tilstedeværelsen av
M. fermentans
, vi analysert nærvær av Mycoplasma-DNA i de infiserte cellene ved revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ved benyttelse
M
.
fermentans-
spesifikke primere. Resultatene bekreftet at de undersøkte kreftcellelinjer ble faktisk smittet med
M. fermentans
(figur 2A).
MCF7- (A, B) og U251 (C, D) kreftceller ble smittet med levende
M. fermentans product: (
M.f
) for ulike intervaller på MOI av 10
3CFU /celle. Total kjerneprotein (12,5 ng) ble tilsatt til en spesifikk reaksjonsblandingen i Topo I. Reaksjonsproduktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese. (A, C) En representant bilde (n = 4-5) av Topo I DNA-avslapping aktivitet. (B, D) Kvantifisering analyse av Topo Jeg aktivitet. Symboler: R og S er avslappet og supercoil form av pUC19 DNA, henholdsvis; Topografisk ingen protein tilsatt til reaksjonsblandingen.
t
-test. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,005
prøver fra MCF7 og U251 infiserte celler (som beskrevet i figur 1) ble analysert for deteksjon av mycoplasmal-DNA ved hjelp av PCR (A, B). Nukleære ekstrakter som stammer fra MCF7 og U-251-infiserte celler ble analysert for Topo I proteinnivå ved hjelp av Western blot-analyse med anti-Topo I eller anti-p-aktin-antistoffer, og kvantifisert ved densitometrisk analyse ved bruk av EZquant programvare (C-F).
for å undersøke om nedgangen i Topo jeg aktivitet i infiserte tumorceller er en konsekvens av en reduksjon i Topo jeg protein nivå, ble atom utdrag hentet fra både infiserte og uinfiserte celler analysert ved Western blot med hensiktsmessige anti-Topo I-antistoffer. Som vist i figur 2C-F, nivået av Topo I-protein i infiserte celler som var lik den som finnes i uinfiserte celler. Resultatene tyder på at reduksjonen i Topo Jeg aktivitet var ikke på grunn av en nedgang i enzymet protein mengden.
2. Hemming av DNA Avslapping aktivitet av Topo jeg ved ultralydbehandlet
M. fermentans
For å finne ut om Mycoplasma effekt på Topo I utøves av materialer utskilt fra levende Mycoplasma eller av strukturelle proteiner av denne bakterien, undersøkte vi Topo jeg aktivitet i tumorceller behandlet med ikke-live, ultralydbehandlet
M. fermentans
. Celler (MCF7 og U251) ble behandlet i 24 timer med økende proteinkonsentrasjon (5, 10 og 20 ug /ml) avledet fra sonikert
M. fermentans
. Nuclear ekstrakt ble fremstilt fra de behandlede og ubehandlede celler, og Topo jeg DNA avslapping aktivitet ble målt. Som vist i figur 3A, D, en betydelig reduksjon i topo I-aktivitet ble observert, på en doseavhengig måte, i celler behandlet med
M. fermentans
proteiner (sonicate). Kvantifisering av Topo Jeg aktivitet [37] fra flere eksperimenter (n = 4) ble utført. En reduksjon på 40-80% (
p
0,05) i topo I-aktivitet er observert i celler behandlet med 5-20 pg /ml sonikert
M. fermentans
proteiner for 24 timer (figur 3B, E). Selv om det ble observert reduksjon av Topo I-aktivitet i celler behandlet med ultralydbehandlet Mycoplasma, ble nivået av Topo I-protein ikke påvirkes (fig. 3 C, F).
MCF7 (A-C) og U251 (D-F kreftceller) ble behandlet i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av
M. fermentans
proteiner. Total nukleære proteiner (12,5 ng) ble tilsatt til en spesifikk reaksjonsblandingen i Topo I. Reaksjonsproduktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese. (A, D) En representant bilde (n = 4-5) av Topo Jeg DNA avslapping aktivitet. (B, E) Kvantifisering analyse av Topo Jeg aktivitet. (C, F) topo I-protein-nivå undersøkt ved Western blot-analyse. Symboler: R og S er avslappet og supercoil form av pUC19 DNA, respektivt, topografisk ingen protein tilsatt til reaksjonsblandingen.
t
-test. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,005
Dette resultatet indikerer at enten levende eller ikke-levende (ultralydbehandlet)
M. fermentans
utøves lignende effekter på celle Topo I enzym.
3.
M. fermentans
Diminished CPT Hemming Effekt på DNA Avslapping aktivitet av Topo jeg
Det var interessant å undersøke effekten av Mycoplasma infeksjon på hemmende evne kjente Topo I antagonister som CPT. I utgangspunktet, gjennomførte vi en serie eksperimenter hvori cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CPT for å velge den CPT dose som fører til nesten fullstendig inhibering av enzymaktivitet i løpet av kort tid (ikke vist). Vi valgte en CPT dose på 30 mikrometer, som hemmet Topo jeg aktivitet med 90-95% i løpet av 1,5 timer (Figur 4A, B; sammenligne kjørefelt fire til lane 2). Celler ble infisert med levende
M. fermentans
i 6 timer ved MOI på 10
3 CFU /celle, fulgt av 30 uM CPT behandlinger i ytterligere 1,5 timer. En betydelig minskende i CPT inhiberende effekt (fra 95% inhibering til ca. 60%) ble observert i MCF7-celler eksponert for kombinasjonen av
M. fermentans
infeksjon og CPT behandling (figur 4A, B, sammenlign spor 6 til lane 4,
p
0,005). Lignende resultater ble oppnådd med U251-celler (figur S1 A-B). Behandling av celler med CPT er kjent for å redusere mengden av frie Topo I-protein til stede i nukleoplasma på grunn av stabiliseringen av de enzym-DNA spaltbare kompleksene av CPT. Faktisk behandling av tumorceller med CPT reduserte nivået av fritt Topo I-protein (figur 4C felt 3). Kombinasjonen av Mycoplasma infeksjon og CPT behandling påvirket ikke nivået av fritt Topo I-protein når den undersøkes i forhold til mengden av β-aktin-protein (figur 4C).
MCF7-celler ble infisert med
M. fermentans product: (
M.f
) i 6 timer, etterfulgt av CPT (30 mm) behandlinger for ytterligere 1,5 timer. Total kjerneprotein (12,5 ng) ble tilsatt til en spesifikk reaksjonsblandingen i Topo I. Reaksjonsproduktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese. (A) Et representativt bilde n = 5, av topo I DNA-avslapping aktivitet. (B) Kvantifisering analyse av Topo Jeg aktivitet. (C) Topo I-protein-nivå undersøkt ved Western blot-analyse. Symboler: R og S er avslappet og supercoil form av pUC19 DNA, respektivt, topografisk ingen protein tilsatt til reaksjonsblandingen
t
-test: *
p
0,05, * *
p
0,01, ***
p
. 0,005
4. Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) antagonister forhindret Mycoplasma-indusert hemmende effekt på Topo jeg Aktivitets
De nevnte Resultatene tyder på at reduksjonen i Topo jeg aktivitet i tumorceller som utøves av
M. fermentans
kan skyldes posttranslasjonelle modifikasjoner av enzymet proteiner. Topo I gjennomgår flere post-translasjonelle modifikasjoner, som påvirker dets aktivitet: Fosforylering av topo I ved kasein kinase II eller av PKC øker sin aktivitet, mens poly-ADP-ribosylering av PARP-1 reduserer dets aktivitet. I tillegg ubiquitinering av topo I fører til sin proteolyse [44], [45]. For å bestemme veien der
M. fermentans
påvirker topoisomerase I, vi først undersøkte effekten av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor -3-aminobenzamid (3AB) på Topo Jeg aktivitet, alene og som en pre-behandling for å
M. fermentans
infeksjon. MCF7-celler ble pre-inkubert med 3AB ved forskjellige konsentrasjoner (1-3 mM) i 1,5 timer, etterfulgt av
M. fermentans
infeksjon (MOI på 10
3CFU /celle) og inkubering i ytterligere 6 timer. Nuclear ekstraktet ble fremstilt og analysert for Topo I-aktivitet som beskrevet ovenfor. Resultatene vist i figur 5A-B viser at forbehandling med 3AB hindret
M. fermentans
indusert reduksjon i Topo Jeg aktivitet. Behandling av infiserte celler med 3AB for den angitte tid ikke påvirke celle Topo jeg aktivitet (figur 5A, B). Lignende resultater ble oppnådd med de U-251-celler (figur S2 A-B).
MCF7-celler ble for-inkubert med 3-aminobenzamid (3AB) i 1 time ved forskjellige konsentrasjoner, etterfulgt av
M. fermentans
infeksjon (MOI på 10
3 CFU /celle) i ytterligere 6 timer. Total kjerneprotein (12,5 ng) ble tilsatt til en spesifikk reaksjonsblandingen i Topo I. Reaksjonsproduktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese (A) og kvantifisering av Topo I-aktivitet ble utført (B). Symboler: R og S er avslappet og supercoil form av pUC19 DNA, respektivt, topografisk ingen protein tilsatt til reaksjonsblandingen
t
-test: *
p
0,05, * *
p
0,01, ***
p
. 0,005
5. MEK Inhibitor forhindret Mycoplasma-indusert reduksjon i Topo jeg Aktivitet og ERK 1/2 Fosforylering
Nye rapporter viser at PARP-1 er fosforylert av ERK [28]. Effekten av levende
M. fermentans
på MAPKs generelt ble ikke grundig undersøkt. De fleste av studiene om
M. fermentans
og MAPKs ble utført ved hjelp av mycoplasmal produkter eller varme inaktivert Mycoplasma (HIM). Imidlertid, noen få studier har vist at infeksjon av celler med forskjellige Mycoplasma kan føre til ERK-fosforylering [11], [17], [30]. I denne studien undersøkte vi effekten av MEK hemmer PD-98059 på Topo Jeg aktivitet, alene eller før infeksjon med
M. fermentans
. MCF7 og U-251-cellene ble pre-inkubert med PD i 1,5 timer ved en konsentrasjon på 25 mM, etterfulgt av
M. fermentans
infeksjon (MOI på 10
3CFU /celle) og inkubering i ytterligere 6 timer. Nuclear ekstraktet ble fremstilt og analysert for Topo I-aktivitet og fosforylering av ERK ved hjelp av Western blot-analyse med spesifikt anti-p-ERK-antistoff 1/2. Resultatene viste at tilsetningen av MEK-inhibitor til Topo I reaksjonen ikke påvirket Topo I-aktivitet (figur 6A, B), og i kontrast, behandling av celler med inhibitor (PD) hindret
M. fermentans-
indusert reduksjon i Topo Jeg aktivitet (figur 3A, B for U-251 celler). I tillegg fant vi at mengden av p-ERK1 /2 økt i infiserte celler (figur 6C for MCF7 celler og Figur S3 C for U-251), mens pre-behandling med PD forhindret denne økningen. Nivået av total ERK ble ikke påvirket av de ulike behandlinger (figur 6C). Disse resultatene tyder på at reduksjonen i Topo jeg aktivitet i
M. fermentans-
infiserte celler blir mediert av MAPK-signalisering.
MCF7 cellene ble pre-inkubert med MEK-hemmere (PD) i 1 time ved en konsentrasjon på 25 mM, etterfulgt av
M. fermentans
infeksjon (MOI av 10
3CFU /celle) i ytterligere 6 timer. Total kjerneprotein (12,5 ng) ble tilsatt til en spesifikk reaksjonsblandingen i Topo I. Reaksjonsproduktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese (A) og Topo I-aktivitet ble kvantifisert (B). Fosforylert ERK 1/2 proteinnivå fra MCF7-ekstrakt ble undersøkt ved Western blot-analyse (C). Symboler: R og S er avslappet og supercoil form av pUC19 DNA, respektivt, topografisk ingen protein tilsatt til reaksjonsblandingen
t
-test: ***
p
0,005 .
6.
M. fermentans
Infeksjon Økt Poly-ADP-ribosylering av Topo jeg avledet fra MCF7 celler
PARP-1 regulerer Topo Jeg aktivitet av ADP-ribosylering av enzymet protein [46]. For å undersøke om infeksjon med
M. fermentans
indusert Topo jeg modifikasjon av PARP, ble Topo jeg protein immunoutfelt med anti-Topo I-antistoffer avledet fra sklerodermi (SC) pasientserum [47] og analysert ved Western blot hjelp av anti-Poly-ADP-ribose monoklonalt antistoff (Figur 7A).
